目 次 1. ビオチンラベル 化 剤 3. タンパク 質 標 識 試 薬 Biotin--ulfo-u...5 CFE Biotin-PDP...6 IC3-u special packaging Biotin-u...7 IC5-u s

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1 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤

2 目 次 1. ビオチンラベル 化 剤 3. タンパク 質 標 識 試 薬 Biotin--ulfo-u...5 CFE Biotin-PDP...6 IC3-u special packaging Biotin-u...7 IC5-u special packaging Biotin-AC 5 -u FITC-I Biotin-(AC 5 ) 2 -u ulforhodamine 101 acid chloride Biotin ulfo-u...8 ICG-ulfo-u Biotin-AC 5 ulfo-u プロトコル Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u Biotin-PE-maleimide Biotin-PEAC 5 -maleimide 4. PLC 用 誘 導 体 化 試 薬 Biotin-hydrazide...9 BD-F Biotin-AC 5 -hydrazide ABD-F Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide AM ARP BD-F プロトコル...10 DDB MDB Br-DMEQ 2. 二 価 性 試 薬 Br-Mmc < etero-bifunctional Reagents > DMEQ-CCl EMC...14 GMB MC 5. 関 連 試 薬 KMU DTPA anhydride ulfo-emc...15 BABE ulfo-gmb FeBABE ulfo-mc AB-TA free acid ulfo-kmu Aminobenzyl-EDTA ulfo-mcc Isothiocyanobenzyl-EDTA PDP...16 Maleimido-C 3 -TA ulfo-ac 5 -PDP Isothiocyanobenzyl-TA < omo-bifunctional Reagents > Dithiobis(C 2 -TA) B3 DTP DP...17 Dithiobis(succinimidyl undecanoate) Dithiobis(succinimidyl octanoate) Dithiobis(succinimidyl hexanoate) プロトコル...18

3 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 pacer length 一 覧 表 ビオチン 試 薬 類 品 コード 品 名 pacer length (A ) 二 価 性 試 薬 類 品 コード 品 名 pacer length (A ) Å B572 Biotin--ulfo-u G005 GMB a B573 Biotin-PDP E018 EMC Å B304 Biotin-u Å MC B305 Biotin-AC 5 -u Å K214 KMU B306 Biotin-(AC 5 ) 2 -u Å ulfo-gmb Å B319 Biotin ulfo-u ulfo-emc a B320 Biotin-AC 5 ulfo-u Å ulfo-mc a Å B321 Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u ulfo-kmu Å 3a Å B300 Biotin-PE-maleimide ulfo-mcc Cl B299 Biotin-PEAC 5 -maleimide PDP Cl Å B303 Biotin-hydrazide ulfo-ac 5 -PDP B302 Biotin-AC 5 -hydrazide B574 B B301 Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide Å D630 DTP A305 ARP(Aldehyde Reactive Probe) D629 DP Å Å Å Å Å Å Å Å 3a a3 a Å Å Å Å Å Å Å Å 3a 3a 3a 3a 3a 3a 3a D539 Dithiobis(succinimidyl hexanoate) Å D538 Dithiobis(succinimidyl octanoate) Å D537 Dithiobis(succinimidyl undecanoate) Å

4 はじめに 概 要 標 識 したタンパク 質 は 抗 原 抗 体 反 応 などとの 組 み 合 わせにより 多 くの 分 析 に 用 いられる 原 理 的 には 様 々な 化 合 物 をタンパク 質 に 標 識 することができるが 抗 体 への 標 識 に 限 ると 蛍 光 やビオチン キレート 酵 素 等 がよく 用 いられる タンパク 質 に 標 識 する 場 合 は アミノ 基 ( 2 ) スルフヒドリル 基 () カルボキシル 基 (C) 還 元 糖 末 端 や 過 ヨウ 素 酸 酸 化 により 生 じるアルデヒド 基 (C) 等 が 標 識 部 位 として 利 用 できる アミノ 基 に 対 しては 一 般 的 に- ヒドロキシスクシンイミドエステル() 基 に 対 してはマレイミド 基 アルデヒド 基 に 対 してはヒドラジド( 2 )が 用 いられる カルボキシル 基 は を 用 いて 活 性 化 して アミノ 基 を 持 つ 標 識 試 薬 と 結 合 させるこ とができるが タンパク 質 にはアミノ 基 が 数 多 く 存 在 し 自 己 カップリングするため 通 常 使 用 されることはない アルデヒド 基 は 糖 タンパク 質 の 糖 鎖 を 過 ヨウ 素 酸 で 酸 化 することにより 生 じる 一 級 アミノ 基 と 反 応 しシッフ 塩 基 としたのち 還 元 して 安 定 な 結 合 を 形 成 する それぞれの 標 識 方 法 は 目 的 に 応 じて 使 い 分 けることになる アミノ 基 への 標 識 は 部 位 を 特 定 できないため 場 合 によっては タ ンパク 質 の 活 性 に 大 きく 影 響 を 与 える 場 合 があるが 標 識 方 法 が 極 めて 単 純 なので 抗 体 などのタンパク 質 標 識 に 利 用 される スルフヒ ドリル 基 への 導 入 は システインを 導 入 した 組 換 タンパク 質 に 用 いられることが 多 く 部 位 を 特 定 した 標 識 になる 糖 鎖 を 酸 化 し 調 製 したアルデヒド 基 を 用 いる 場 合 は 一 級 アミノ 基 を 持 つ 化 合 物 よりも 安 定 な 構 造 を 形 成 するヒドラジド 化 合 物 あるいはアミノオキシ 基 の 方 が 還 元 操 作 を 必 要 としない 分 有 利 である 以 下 に タンパク 質 標 識 に 一 般 的 に 用 いられるアミノ 基 およびスルフヒドリル 基 への 反 応 についてまとめた タンパク 質 のアミノ 基 への 標 識 アミノ 基 ( 2 基 )へ 結 合 できる 反 応 基 は 上 記 の 以 外 に イソチオシアノ 基 (ITC) スルホン 酸 クロリド カルボン 酸 クロリド エチレンオキシド アルキルクロリド アルデヒド 基 カルボン 酸 無 水 物 など 数 多 く 知 られている しかしながら タンパク 質 のア ミノ 基 を 介 して 目 的 とする 標 識 化 合 物 を 共 有 結 合 的 に 付 加 させる 場 合 には 水 系 での 反 応 が 必 須 で 反 応 溶 液 の p が 中 性 ~ 弱 アルカ リ 性 領 域 にあること 氷 冷 下 から 37 程 度 の 反 応 温 度 で 短 時 間 に 反 応 が 進 むことなど 反 応 化 合 物 を 使 用 できる 条 件 が 限 られており や ITC が 用 いられる 場 合 が 多 い や ITC は 中 性 の 条 件 で 遊 離 一 級 アミノ 基 と 反 応 する アルキルアミンは 弱 塩 基 性 で 遊 離 アミノ 基 となるため 反 応 時 の p は 8.5 ~ 9 が 一 般 的 である タンパク 質 などの 高 分 子 への 反 応 では 普 通 アミノ 基 が 複 数 個 あり pk a が 低 いアミノ 基 が 存 在 するため p7 程 度 の p 領 域 でも 反 応 できる アミノ 基 との 反 応 は 加 水 分 解 との 競 争 反 応 でもあるので 加 水 分 解 を 抑 えるには 低 い p や 低 温 での 反 応 が 望 ましい 標 識 試 薬 の 水 溶 性 が 低 い 場 合 には 普 通 ジメチルスルホキシド(DM)に 溶 解 して 反 応 バッファーに 加 え 均 一 溶 液 として 反 応 させる 溶 解 しにくい 化 合 物 を 付 加 すると タンパク 質 が 不 溶 化 することもあり 付 加 する 分 子 数 を 必 要 以 上 に 上 げないことが 求 め られる また 蛍 光 試 薬 を 結 合 させる 場 合 には 蛍 光 試 薬 同 士 が 近 接 すると 蛍 光 消 光 が 起 こり 分 子 あたりの 蛍 光 量 が 大 きく 減 少 する ため 導 入 量 のコントロールが 極 めて 重 要 である R C + R' 2 R R' 図 1 イソチオシアノ 基 と 一 級 アミノ 基 の 反 応 R X + R' 2 R R' + X X =, 3 a 図 2 基 と 一 級 アミノ 基 の 反 応 2

5 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 タンパク 質 のスルフヒドリル 基 への 標 識 スルフヒドリル 基 ( 基 )は 通 常 タンパク 質 中 ではジスルフィド(-)となっており 基 として 存 在 する 場 合 には 金 属 イオンと 結 合 した 構 造 をとり 反 応 の 活 性 中 心 となっているなど タンパク 質 機 能 に 大 きく 影 響 する このような 基 は 標 識 部 位 と しては 使 用 できない そのため タンパク 質 の 基 を 標 識 部 位 として 用 いるには ジスルフィド 構 造 を 還 元 し 基 として 使 うこ とになる ジスルフィドの 還 元 には ジチオスレイトール(DTT)や β - メルカプトエタノール(β -ME)などが 使 用 される タンパ ク 質 中 のジスルフィドを 全 て 還 元 して とすると タンパク 質 機 能 が 失 われてしまう 可 能 性 があるため 一 部 の 基 を 還 元 し 標 識 部 位 として 使 用 する 基 への 標 識 にはマレイミド 基 やブロモアセトアミド 基 などが 一 般 的 に 用 いられる いずれも p6 ~ 7.5 の 中 性 条 件 で 使 用 でき 加 水 分 解 も 受 けにくいため タンパク 質 標 識 に 広 く 用 いられている 但 し タンパク 質 によっては 還 元 で 活 性 がなくなってしまうもの もあり どのタンパク 質 にでも 使 用 できる 標 識 方 法 ではないが 抗 体 の 場 合 は 還 元 が 特 異 性 を 出 す 部 分 に 与 える 影 響 は 比 較 的 少 ない ため よく 使 用 されている 還 元 によって 失 活 する 危 険 性 はモノクローナル 抗 体 の 方 がポリクローナル 抗 体 の 場 合 よりも 高 いと 考 えら れるが モノクローナル 抗 体 の 場 合 も 還 元 剤 の 量 を 加 減 することにより 還 元 による 活 性 低 下 を 防 ぐことができるため 適 当 な 還 元 剤 によって 抗 体 のジスルフィドを としマレイミド 基 やブロモアセトアミド 基 を 使 って 目 的 化 合 物 を 導 入 することが 一 般 的 に 行 われて いる 抗 体 のヒンジ 部 位 にあるジスルフィドが 還 元 され となった 部 分 に 目 的 化 合 物 が 付 加 することが 理 想 的 であるが それ 以 外 の 部 位 のジスルフィドも 還 元 されるため 還 元 剤 の 使 用 量 を 必 要 以 上 に 用 いないことが 重 要 である また マレイミド 基 は 中 性 の 状 態 では 安 定 であるが p7.5 を 超 えると 加 水 分 解 によりマレイン 酸 構 造 となるため あまり p を 上 げすぎないようにする 基 を 介 して 標 識 した 抗 体 は アミノ 基 を 介 して 標 識 した 抗 体 に 比 べ 一 般 的 に 抗 体 の 抗 原 認 識 活 性 が 高 い これは 抗 体 への 結 合 が 部 位 特 異 的 であるためと 考 えられる しかしながら 還 元 操 作 を 加 えることによって 抗 体 の 構 造 変 化 が 起 こり 非 特 異 的 吸 着 の 度 合 いも 高 くなることが 観 察 される 場 合 もある シグナル/ノイズ 比 (/ 比 )を 向 上 させる 目 的 としては ブロッキ ング 剤 やバッファーの 検 討 も 必 要 である R' R + R' R 図 3 マレイミド 基 と 基 の 反 応 R X + R' R R' X = I, Br 図 4 ブロモ(ヨード)アセトアミド 基 と 基 の 反 応 弊 社 では その 他 フルオレセインや ulforhodamine 101 インドシアニン 色 素 を 標 識 するための 試 薬 PLC 分 析 用 のラベル 化 剤 種 々のリンカーを 持 つビオチン 標 識 試 薬 および 二 種 類 のタンパク 質 を 架 橋 するための 二 価 性 試 薬 を 取 り 揃 えている また 酵 素 (ペルオキシダーゼ アルカリホスファターゼ) 蛍 光 タンパク 質 蛍 光 色 素 およびビオチンをタンパク 質 に 標 識 するた めのキットも 取 り 揃 えている これらの 試 薬 には あらかじめ 活 性 エステル 基 あるいはマレイミド 基 が 導 入 されており タンパク 質 の アミノ 基 あるいはスルフヒドリル 基 を 介 して 標 識 することができる 反 応 条 件 はすでに 最 適 化 されており 標 識 に 必 要 な 試 薬 やバッ ファー 類 などが 全 て 含 まれているため 本 キットを 用 いて 簡 便 に 標 識 タンパク 質 を 調 製 することができる 詳 しくは 小 社 P をご 参 照 されたい ( 3

6 表. ラベル 化 剤 の 特 性 一 覧 表 タ ン パ ク 質 標 識 試 薬 P L C 用 誘 導 体 化 試 薬 ビ オ チ ン ラ ベ ル 化 剤 そ の 他 対 象 官 能 基 品 名 検 出 λ ex λ em 備 考 CFE 蛍 光 細 胞 質 標 識 剤 FITC-I タンパク 質 等 のアミノ 基 ラベル 化 剤 ア ミ ノ 基 IC3-u special packaging アミノ 酸 やペプチド 中 のアミノ 基 用 のラベル 化 剤 IC5-u special packaging ulforhodamine 101 acid chloride タンパク 質 等 のアミノ 基 ラベル 化 剤 ICG-ulfo-u ア ミ ノ 基 BD-F 蛍 光 PLC のプレカラムラベル 化 剤 ABD-F 蛍 光 PLC のプレカラムラベル 化 剤 基 AM PLC のプレカラムラベル 化 剤 BD-F DDB 蛍 光 芳 香 族 アルデヒドの 検 出 アルデヒド 基 MDB α - ケト 酸 の PLC プレカラムラベル 化 剤 カルボン 酸 Br-DMEQ 蛍 光 PLC のプレカラムラベル 化 剤 Br-Mmc 水 酸 基 DMEQ-CCl 蛍 光 PLC のプレカラムラベル 化 剤 Biotin-u Biotin-AC 5 -u ー ー アミノ 基 へのビオチン 導 入 剤 AC 基 の 数 でビオチ ンと 被 標 識 分 子 の 距 離 を 調 整 する Biotin-(AC 5 ) 2 -u Biotin ulfo-u アミノ 基 Biotin-AC 5 ulfo-u ー ー アミノ 基 へのビオチン 導 入 剤 AC 基 の 数 でビオチ ンと 被 標 識 分 子 の 距 離 を 調 整 する 水 に 溶 け 易 い Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u Biotin--ulfo-u ー ー アミノ 基 へのビオチン 導 入 剤 スペーサーのジスル フィド 結 合 は 還 元 剤 で 切 断 可 能 Biotin-PE-maleimide 基 Biotin-PEAC 5 -maleimide ー ー 基 へのビオチン 導 入 剤 AC 基 の 数 でビオチン と 被 標 識 分 子 の 距 離 を 調 整 する Biotin-PDP Biotin-hydrazide アルデヒド 基 Biotin-AC 5 -hydrazide ー ー アルデヒド 基 カルボン 酸 へのビオチン 導 入 剤 AC カルボン 酸 基 の 数 でビオチンと 被 標 識 分 子 の 距 離 を 調 整 する Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide DTPA anhydride ー ー ー アミノ 基 へのキレート 残 基 の 導 入 剤 アミノ 基 PDP ー ー ー 化 合 物 標 識 用 ulfo-ac 5 -PDP ー ー ー 化 合 物 標 識 用 水 に 溶 け 易 い 4

7 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 1. ビオチンラベル 化 剤 対 象 反 応 基 蛍 光 波 長 は 4 ページ ( 表. ラベル 化 剤 の 特 性 一 覧 表 ) を 参 照 下 さい Biotin--ulfo-u -[[2-Biotinylamino)ethyl]dithiopropionyloxy]sulfosuccinimide, sodium salt [CA o ] 100 mg ; 同 仁 品 コード (B572) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 80.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 15 mg/ml( 水 ), 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C a 9 4 = pacer length: a 性 質 Biotin--ulfo-u は 分 子 内 に - ヒドロキシスクシンイミド 活 性 エステル 基 を 持 つため 抗 体 や 酵 素 等 のタンパク 質 のアミ ノ 基 にビオチンを 導 入 することができる Biotin ulfo-u または Biotin-AC 5 ulfo-u 等 のリンカーにアルキル 鎖 のみを 有 するビオ チン 標 識 剤 とは 異 なり リンカー 部 位 に 導 入 されたジスルフィド 基 は 還 元 剤 により 容 易 に 還 元 されるためリンカー 部 位 の 切 断 が 可 能 で ある Biotin--ulfo-u を 用 いて 標 識 した 分 子 をアビジンあるいはストレプトアビジンの 固 定 化 カラムへ 捕 捉 後 還 元 操 作 によるリン カー 部 位 の 切 断 により 回 収 することができる 5

8 Biotin-PDP 50 mg ; 同 仁 品 コード (B573) -[6-(Biotinamide)hexyl]-3 -(2 -pyridyldithio)propionamide [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) ジメチルホルムアミド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 2 mg/ml( ジメチルホルムアミド ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a 性 質 Biotin-PDP は 分 子 内 にビオチンおよびピリジルジスルフィド 基 を 有 するため 基 にビオチンを 導 入 することができる ピリジルジスルフィド 基 は 還 元 剤 により 容 易 に 還 元 でき また タンパク 質 などの 基 と 交 換 反 応 することが 可 能 である Biotin- -ulfo-u と 同 様 還 元 操 作 によるリンカー 部 位 が 切 断 可 能 な 特 徴 を 有 しているが Biotin-PDP は 対 象 のタンパク 質 の 基 と 反 応 するため ジスルフィド 基 を 還 元 した 後 に 現 れる 基 は 元 のタンパク 質 由 来 の 基 に 戻 すことができる Biotin-PDP を 用 いて 標 識 した 分 子 をアビジンあるいはストレプトアビジンの 固 定 化 カラムへ 捕 捉 後 還 元 操 作 によるリンカー 部 位 の 切 断 により 回 収 することができる 6

9 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 Biotin-u Biotin -hydroxysuccinimide ester [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B304) 性 質 ビオチンはアビジンと 強 く 結 合 することが 知 られており その 性 質 を 利 用 して 高 感 度 分 析 に 広 く 利 用 されている ビオチン とアビジンの 結 合 安 定 度 定 数 は で 抗 原 - 抗 体 反 応 よりも 3 ~ 4 桁 高 いため 一 旦 アビジンと 結 合 したビオチンは 生 理 的 条 件 下 では 外 れない また ビオチンはカルボキシル 基 を 持 つ 低 分 子 であり 容 易 に 化 学 修 飾 することができ タンパク 質 等 の 活 性 をほと んど 損 なうことなく 標 識 することができる したがって 抗 体 を 用 いた 免 疫 分 析 のための 標 識 剤 として 数 多 くのビオチン 化 合 物 が 開 発 されてきた タンパク 質 のアミノ 基 ( 2 基 ) との 結 合 には 通 常 活 性 エステル 基 を 持 つビオチンが 用 いられ スルフヒドリル 基 ( 基 ) には マレイミド 基 を 持 つビオチンが 用 いられる 目 的 に 応 じて アビジンが 認 識 するビオチンヘッドと 反 応 基 の 間 のスペーサーの 長 さを 選 択 する 必 要 があるが 一 般 にスペーサー が 長 い 方 が アビジンを 結 合 させた 際 の 抗 体 への 抗 原 認 識 活 性 への 影 響 が 少 ないと 考 えられている ただし スペーサー 部 分 が 非 特 異 的 吸 着 を 起 こす 場 合 もあり 測 定 の 際 のバックグラウンドが 高 くなることもあるため 測 定 感 度 を 向 上 させるには /( シグナル ノイズ 比 ) を 見 て 適 当 な 長 さのスペーサーを 選 択 する 必 要 がある スペーサーには 通 常 アミノカプロン 酸 が 用 いられ アミド 結 合 でビオチンに 一 分 子 のアミノカプロン 酸 を 導 入 した 化 合 物 と 二 分 子 導 入 した 化 合 物 がある カプロン 酸 スペーサーが 長 くなると 水 溶 性 が 乏 しくなるため ビオチン 標 識 試 薬 を DM に 溶 解 し タン パク 質 を 含 むバッファー 溶 液 に 添 加 する 方 法 が 一 般 的 である タンパク 質 のアミノ 基 標 識 の 際 に 有 機 溶 媒 が 使 用 できない 場 合 には スルホン 酸 基 を 持 つ 活 性 エステル 化 合 物 が 利 用 できる また スルフヒドリル 基 への 反 応 に 際 しては 同 様 に DM で 調 整 した 溶 液 が 用 いられるが スペーサー 部 分 にピペラジン 構 造 を 持 つため 中 性 領 域 では プロトン 化 されることにより 水 溶 性 を 示 す 還 元 糖 に 用 いられるビオチンヒドラジド 化 合 物 は 水 溶 性 が 低 く DM 溶 液 での 調 整 が 必 要 となる ELIA(Enzyme-Linked Immunoorbent Assay) では ビオチン 標 識 した 抗 体 に 対 して 酵 素 標 識 ストレプトアビジンを 結 合 させる 方 法 が 一 般 的 である ストレプトアビジンに 比 べ アビジンは 安 価 であるが ELIA などに 用 いられるケースは 極 めて 少 ない 理 由 は バックグラウンドが 極 めて 高 くなるためで PI が 高 いことが 原 因 であると 考 えられている カラムによるビオチン 結 合 タンパク 質 な どの 分 離 目 的 には 一 般 的 にアビジンが 用 いられる Biotin-AC 5 -u 6-(Biotinylamino)hexanoic acid -hydroxysuccinimide ester [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B305) Biotin-(AC 5 ) 2 -u 6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid -hydroxysuccinimide ester [CA o ] 10 mg ; 同 仁 品 コード (B306) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C = pacer length: a 7

10 Biotin ulfo-u Biotin -hydroxy-sulfosuccinimide ester [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 淡 赤 褐 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( 水 ) 10 mg ; 同 仁 品 コード (B319) Biotin-AC 5 ulfo-u 6-(Biotinylamino)hexanoic acid -hydroxy-sulfosuccinimide ester [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 淡 赤 褐 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (4) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( 水 ) C a 8 2 = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B320) C a 9 2 = pacer length: a Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u 10 mg ; 同 仁 品 コード (B321) 6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid -hydroxy-sulfosuccinimide ester [CA o (free acid)] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 淡 赤 褐 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (4) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( 水 ) Biotin-PE-maleimide -Biotinyl- -[2-( -maleimido)ethyl]piperazine, hydrochloride 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C a 10 2 = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B300) C Cl 5 4 = pacer length: a Biotin-PEAC 5 -maleimide -6-(Biotinylamino)hexanoyl- -[2-( -maleimido)ethyl]piperazine, hydrochloride 10 mg ; 同 仁 品 コード (B299) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C Cl 6 5 = pacer length: a 8

11 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 Biotin-hydrazide Biotin hydrazide [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) Biotin-AC 5 -hydrazide 6-(Biotinylamino)hexanoylhydrazine [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC):95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide 6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoylhydrazine 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) 10 mg ; 同 仁 品 コード (B303) C = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B302) C = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (B301) C = pacer length: a ARP(Aldehyde Reactive Probe) -(Aminooxyacetyl)- -biotinyl-hydrazine [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 95.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( 水 ) C = pacer length: a 10 mg ; 同 仁 品 コード (A305) 9

12 プロトコル 1) Ⅰ 細 胞 表 面 タンパク 質 のビオチンラベル 化 1. 使 用 試 薬 ビオチンラベル 化 剤 Biotin--ulfo-u (Code: B572) Quench buffer (50 mmol/l Tris-Cl (p8.0), 0.1 mmol/l EDTA, 150 mmol/l acl) Lysis Buffer (50 mmol/l Tris-Cl (p8.0), 150 mmol/l acl, 0.2% a 3, 0.1% D, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml aprotinin, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate(code: D520)) treptavidin 固 定 ビーズ Loading dye (60 mmol/l Tris-Cl(p 6.8), 25% glycerol, 2% D, 350 mmol/l β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 2. タンパク 質 のビオチンラベル 化 の 操 作 方 法 (1) 細 胞 表 面 タンパク 質 のビオチンラベル 化 方 法 1) 薬 剤 で 処 理 をした 細 胞 を 準 備 する (T-75 フラスコ ) 2) 冷 PB で 2 回 洗 浄 した 後 1 mg/ml Biotin--ulfo-u (in PB) を 添 加 し 4 で 30 分 間 振 とうしながら 反 応 する 3) 反 応 後 冷 Quench buffer で 2 回 洗 浄 後 冷 PB にて 1 回 洗 浄 する 4) 細 胞 をフラスコ 上 からかき 取 り 遠 沈 管 に 移 した 後 遠 心 し て 細 胞 を 沈 殿 させる 5) 100 μl の Lysis Buffer を 添 加 し 30 分 間 氷 上 でインキュベート して 細 胞 を 溶 解 する 6) 4 で 遠 心 し 上 清 を 新 しいチューブに 取 る タンパク 質 濃 度 を 測 定 する (2) 細 胞 表 面 タンパク 質 の 分 離 精 製 1) タンパク 質 量 μg(200 μl Lysis Buffer)に treptavidin 固 定 ビーズを 添 加 し 4 で 一 晩 振 とうしながら 反 応 させる 2) 遠 心 してビーズを 沈 殿 させながら Lysis Buffer で 5 回 洗 浄 する 3) 55 μl の Loading Dye を 沈 殿 ビーズに 添 加 し 37 で 30 分 間 インキュベートする 4) 遠 心 して 得 られた 上 清 を 新 しいチューブに 移 す 5) 4 15% D- ポリアクリルアミドゲルで 電 気 泳 動 を 行 う < 参 考 文 献 > 1) cott R. Witting et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, II アミノ 基 標 識 用 ビオチンラベル 化 剤 を 用 いたビオチンラベル 化 1. 使 用 試 薬 10 mmol/l Bicine Buffer(p8.5) ビオチンラベル 化 剤 Biotin-u (Code: B304), Biotin-AC 5 -u (Code: B305), Biotin- (AC 5 ) 2 -u (Code: B306), Biotin ulfo-u (Code: B319), Biotin-AC 5 ulfo-u (Code: B320), Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u (Code: B321) DM ( ジメチルスルホキシド, Code: P10) AP-5 (GE ヘルスケア 社 ) PB (p7.4) (acl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l, a 2 P g/l, K 2 P g/l) 2. タンパク 質 のビオチンラベル 化 の 操 作 方 法 (1) ビオチンラベル 化 剤 溶 液 を 以 下 を 参 考 に 調 製 する (50 mmol/l) ビオチンラベル 化 剤 Biotin-u Biotin-AC 5 -u Biotin-(AC 5 ) 2 -u Biotin ulfo-u Biotin-AC 5 ulfo-u Biotin-(AC 5 ) 2 ulfo-u 溶 解 方 法 (50 mmol/l) 3.4 mg/dm 200 μl 4.5 mg/dm 200 μl 5.7 mg/dm 200 μl 4.4 mg/ 純 水 200 μl 5.6 mg/ 純 水 200 μl 6.7 mg/ 純 水 200 μl *ビオチンラベル 化 剤 は 加 水 分 解 しやすいので 溶 解 後 の 操 作 は 手 早 く 行 い 速 やかに (2) の 操 作 に 移 る (2) タンパク 質 のビオチンラベル 化 方 法 1) タンパク 質 を 10 mmol/l Bicine Buffer(p8.5) に 溶 解 する 2) タンパク 質 とビオチンラベル 化 剤 の 混 合 モル 比 が 1:2 1:10 となる 様 に (1) で 調 製 したビオチンラベル 化 剤 溶 液 を 1) のタ ンパク 質 溶 液 に 添 加 する 3) よく 混 和 した 後 振 とうしながら 恒 温 槽 (25 ) 中 で 2 ~ 4 時 間 インキュベートする (3) ラベル 化 したタンパク 質 のゲルろ 過 精 製 1) AP-5 の 上 部 キャップを 外 し 充 填 液 を 捨 てる 2) 流 出 口 のキャップを 外 し PB を 数 ml ずつピペットで 取 り カラムへロードする 1 カラム 当 たり 総 量 として 10 ml を 流 し ゲルを 平 衡 化 させる 3) (2) でラベル 化 したタンパク 質 溶 液 のサンプルチューブから 500 μl をマイクロピペッターで 測 り 取 りカラムへロードする この 時 の 流 出 液 は 廃 棄 する 4) カラムの 流 出 口 に 試 験 官 などを 置 き 1.0 ml の PB をマイク ロピペッターでカラムにロードし ビオチン 標 識 したタンパク 質 を 溶 出 する 10

13 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 III 基 標 識 用 ビオチンラベル 化 剤 を 用 いたビオチンラベル 化 1. 使 用 試 薬 10 mmol/l EPE Buffer (p8.0) 1,4-Dithiothreitol (DTT) ビオチンラベル 化 剤 Biotin-PE-maleimide (Code: B300), Biotin-PEAC 5 -maleimide (Code: B299) DM ( ジメチルスルホキシド, Code: P10) AP-5 (GE ヘルスケア 社 ) AP-10 (GE ヘルスケア 社 ) PB (p7.4) (acl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l,a 2 P g/l, K 2 P g/l) 2. 抗 体 のビオチンラベル 化 操 作 方 法 (1) 基 を 持 つ 抗 体 の 調 製 方 法 1) DTT を 200 mmol/l になるように PB に 溶 解 する 2) タンパク 質 1.0 ~ 5.0 mg を 精 秤 ( 秤 量 値 を 記 録 ) し マイクロ ピペッターにて EPE Buffer を 500 μl 添 加 し 溶 解 する 3) 2) のタンパク 質 溶 液 に 1) の DTT 溶 液 を 2 μl 添 加 し よく 混 和 する (2) ゲルろ 過 精 製 1) AP-5 の 上 部 キャップを 外 し 充 填 液 を 捨 てる 2) 流 出 口 のキャップを 外 し PB を 数 ml ずつピペットで 取 り カラムへロードする 1 カラム 当 たり 総 量 として 10 ml を 流 し ゲルを 平 衡 化 させる 3) (1) で 調 製 した 抗 体 溶 液 のサンプルチューブから 500 μl をマイ クロピペッターで 測 り 取 り カラムへロードする この 時 の 流 出 液 は 廃 棄 する 4) カラムの 流 出 口 に 試 験 官 などを 置 き 1.0 ml の PB をマイクロ ピペッターでカラムにロードし 還 元 した 抗 体 を 溶 出 する (3) ビオチンラベル 化 方 法 1) Biotin-PE-maleimide を DM に 溶 解 する (50 mmol/l, 4.7 mg/200 μl または 10 mg/424 μl) * Biotin-PEAC 5 -maleimide の 場 合 は 5.9 mg/200 μl または 10 mg/342 μl 2) 抗 体 とビオチンラベル 化 剤 のモル 比 が 1:10 程 度 となるように (3)-1) で 調 製 したビオチンラベル 化 剤 溶 液 を (2) の 抗 体 溶 液 に 添 加 する 3) よく 混 和 した 後 振 とうしながら 恒 温 槽 (25 ) 中 で 一 晩 インキュベートする (4) ラベル 化 した 抗 体 のゲルろ 過 精 製 1) AP-10 の 上 部 キャップを 外 し 充 填 液 を 捨 てる 2) 流 出 口 のキャップを 外 し PB を 数 ml ずつピペットで 取 りカ ラムへロードする 1 カラム 当 たり 総 量 として 15 ml を 流 し ゲルを 平 衡 化 させる 3) (3) でラベル 化 した 抗 体 溶 液 のサンプルチューブから 1 ml をマ イクロピペッターで 測 り 取 りカラムへロードする この 時 の 流 出 液 は 廃 棄 する 4) カラムの 流 出 口 に 試 験 官 などを 置 き 1.5 ml の PB をマイク ロピペッターでカラムにロードし ビオチン 標 識 した 抗 体 を 溶 出 する 表 各 種 タンパク 質 に 対 するラベル 化 率 rprotein A (MW=42,000) BA (MW=68,000) IgG (MW=150,000) タンパク 質 溶 液 の 濃 度 5 mg/500 μl 2.5 mg/500 μl 1.25 mg/500 μl ビオチン 試 薬 溶 液 添 加 量 濃 度 添 加 量 (μl) 10 mg/355 μl 2.5 mg/500 μl 10 mg/567 μl 2.5 mg/500 μl 10 mg/1,218 μl 混 合 比 b) a) ラベル 化 率 (mol/mol) 上 記 結 果 は 小 社 での 実 測 データであり 条 件 により 若 干 変 動 する 可 能 性 がある また ラベル 化 率 の 算 出 は V の ABA 法 により 行 った a) タンパク 質 1 mol に 対 して 混 合 したビオチン 試 薬 のモル 数 b) タンパク 質 1 mol に 結 合 したビオチンのモル 数 11

14 Ⅳ アルデヒド 基 ( 還 元 糖 末 端 ) 標 識 用 ビオチンラベル 化 剤 を 用 いたビオチンラベル 化 1. 使 用 試 薬 150 mmol/l acl 含 有 10 mmol/l ME Buffer (p5.5) 過 ヨウ 素 酸 ナトリウム 溶 液 (100 mmol/l acl 4 ; 上 記 ME buffer で 用 時 調 製 ) Biotin-hydrazide(Code: B303), Biotin-AC 5 -hydrazide(code: B302), Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide(code: B301) DM ( ジメチルスルホキシド ) (Code: P10) AP-5(GE ヘルスケア 社 ) AP-10(GE ヘルスケア 社 ) PB(p7.4) 2. タンパク 質 のビオチンラベル 化 の 操 作 方 法 (1) アルデヒド 基 ( 還 元 糖 末 端 ) を 持 つタンパクの 調 製 方 法 1) タンパク 質 1.0 ~ 5.0 mg を 精 秤 ( 秤 量 値 を 記 録 ) し ME buffer を 500 μl 添 加 する 溶 解 後 氷 浴 上 に 冷 却 する 2) 1) のタンパク 質 溶 液 に 過 ヨウ 素 酸 ナトリウム 溶 液 を 2 μl 添 加 し よく 混 和 して 0 で 20 ~ 30 分 反 応 させる (2) タンパク 質 のゲルろ 過 精 製 1) AP-5 の 上 部 キャップを 外 し 充 填 液 を 捨 てる 2) 流 出 口 のキャップを 外 し PB を 数 ml ずつピペットでとり カラムへロードする 1 カラム 当 り 総 量 として 10 ml を 流 し ゲルを 平 衡 化 させる 3) (1) で 調 製 したタンパク 質 溶 液 のサンプルチューブから 500 μl をマイクロピペッターで 測 りとりカラムへロードさせる こ の 時 の 流 出 液 は 廃 棄 する 4) カラムの 流 出 口 に 試 験 管 などを 置 き 1.0 ml の PB をマイク ロピペッターにてカラムにロードし 還 元 したタンパク 質 を 溶 出 する (3) タンパク 質 のビオチンラベル 化 方 法 1) ビオチン 試 薬 Biotin-hydrazide (50 mmol/l, 2.6 mg/200 μl) を DM に 溶 解 する (Biotin-AC 5 -hydrazide の 場 合 は 3.7 mg/200 μl, Biotin-(AC 5 ) 2 -hydrazide の 場 合 は 4.7 mg/200 μl) 2) 目 的 とするモル 比 になるように 1) で 作 製 したビオチン 試 薬 溶 液 を (2) で 得 られたタンパク 質 溶 液 に 添 加 する 3) よく 混 和 し 振 とうしながら 恒 温 槽 (25 ) 中 で 4 時 間 インキュ ベートする (4) ラベル 化 したタンパク 質 のゲルろ 過 精 製 AP-10 を 使 用 し (2) を 参 照 して 精 製 を 行 なう V ABA 法 によるタンパクのラベル 化 率 の 算 出 1. 原 理 タ ン パ ク 質 へ の ビ オ チ ン 試 薬 の ラ ベ ル 化 率 は ABA(4- ydroxy-azobenzene-2 -carboxylic acid) を 用 いた 方 法 で 調 べるこ とができる ABA はアビジンに 取 りこまれ 500 nm に 吸 収 を 持 つ 一 方 ビオチンは ABA よりアビジンに 対 する 親 和 性 が 高 いため ABA-Avidin 溶 液 に ビオチンラベル 化 したタンパク 質 を 添 加 す ると ABA に 代 わってビオチンがアビジンと 結 合 する アビジ ンから ABA が 解 離 すると 500 nm の 吸 光 度 が 減 少 するため そ の 減 少 からビオチンのラベル 化 率 を 算 出 することができる 2. 使 用 試 薬 Avidin from Egg White :(nacalai tesque ) 10 mg ABA:( 東 京 化 成 0586) 14 mg DM:(p)DM (Code: P10) 500 μl PB(p7.4) 20 ml acl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l, a 2 P g/l, K 2 P g/l 3. 測 定 及 び 算 出 方 法 1) 2 ml サンプルチューブに ABA 14.0 mg を 精 秤 し マイクロ ピペッターを 用 いて DM 500 μl を 添 加 し 溶 解 する 2) 20 ml メスフラスコに Avidin 10.0( ± 0.1) mg を 精 秤 し PB 15 ml を 入 れ 溶 解 する ( この 時 点 では 20 ml 全 量 は 添 加 しな い ) これに 上 記 1) で 調 製 した ABA-DM 溶 液 200 μl をマ イクロピペッターで 添 加 し PB で 20 ml に 調 整 しよく 混 和 する 3) ミクロセル ( 容 量 1 ml セル 長 1 cm) に 上 記 2) の ABA- Avidin 溶 液 900 μl をマイクロピペッターを 用 いて 入 れ 500 nm の 吸 光 度 を 測 定 する 3 回 繰 り 返 し 測 定 し 3 回 の 平 均 値 を Abs A とする このときの 吸 光 度 の 値 は Abs A = 約 1.5 になる 4) 2 ml サンプルチューブに 2) の ABA-Avidin 溶 液 900 μl を マイクロピペッターを 用 いて 入 れる これにゲル 濾 過 精 製 を 行 なったビオチン 化 タンパク 質 溶 液 100 μl をマイクロピペッ ターを 用 いて 添 加 し キャップを 閉 めた 後 ボルテックスで 攪 拌 する 5) 5 分 間 以 上 静 置 した 後 マイクロピペッターを 用 いてセルに 移 し 変 え 500 nm の 値 を 読 む ( この 値 を Abs B とする ) タン パク 濃 度 が 高 い 場 合 系 中 のビオチンがアビジンよりも 多 く なるため タンパク 質 に 結 合 した 正 確 なビオチン 数 が ABA 法 では 算 出 できなくなることがある このため Abs B =0.7 以 下 の 場 合 には タンパク 質 溶 液 を 適 宜 希 釈 ( 希 釈 倍 率 :Z) し た 後 ABA-Avidin 溶 液 に 添 加 してラベル 化 率 を 算 出 したほ うが 良 い 6) Abs A と Abs B の 値 より 下 記 の 式 に 従 いサンプル 中 のビオチ ン 濃 度 B (mol/l) を 算 出 する B (mol/l) = Z [10-2 (0.9 Abs A Abs B ) / 34 ] 7) タンパク 質 1 分 子 に 結 合 したビオチンの 数 を 算 出 する 例 えば 分 子 量 MWprotein のタンパク 質 X g を 標 識 したとす ると ゲルろ 過 精 製 後 のタンパク 濃 度 A (mol/l) は A (mol/l) = (X / MWprotein) 10 3 と 表 される これから B / A = タンパク 質 1 分 子 に 結 合 したビオチン 数 (mol/mol) を 得 る 12

15 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 参 考 文 献 1) M. Wilchek, E. A. Bayer, Ed., "Methods Enzymol., Vol Avidin-biotin technology", Academic Press, ). M. Green, Avidin, Adv. Protein. Chem., 1975, 29, 85. 3) M.Wilchek, E. A. Bayer, Applications of avidin-biotin technology Literature survey, Methods Enzymol., 1990, 184, 14. 4). M. Green, L. Konieczny, E. J. Toms R. C. Valentine, The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin, Biochem. J., 1971, 125, 781. 以 下 に 各 種 ビオチンを 用 いた 標 識 および ABA 法 についての 文 献 をリストアップした uccinimidyl Biotins(ydrophilic) 5) J. Wormmeester, F. tiekema C. Groot, "Immunoselective cell separation", Methods Enzymol., 1990, 184, ) J. J. Leary, D. J. Ward, "Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DA probes hybridized to DA or RA immobilized on nitrocellulose : Bio-Blots", Proc. atl. Acad. ci. UA, 1983, 80, ) W. T. Lee, D.. Conrad, The murine lymphocyte receptor for IgE. II. Characterization of the multivalent nature of the B lymphocyte receptor for IgE, J. Exp. Med., 1984, 159, ) D. R. Gretch, M. uter, M. F. tinski, "The use of biotinylated monoclonal antibodies and streptavidin affinity chromatography to isolate herpesvirus hydrophobic proteins or glycoproteins", Anal. Biochem., 1987, 163, ) M. himkus, J. Levy, T. erman, "A chemically cleavable biotinylated nucleotide : Usefulness in the recovery of protein-da complexes from avidin columns", Proc. atl. Acad. ci. UA, 1985, 82, ) W. J. LaRochelle,. C. Froehner, Immunochemical detection of proteins biotinylated on nitrocellulose replicas, J. Immunol. Methods, 1986, 92, ) P.. R. Anjaneyulu, J. V. taros, "Reactions of -hydroxysulfosuccin-imide active esters", Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, ). M. Ingalls, C. M. Goodloe-olland, E. J. Luna, Junctional plasma membrane domains isolated from aggregating Dictyostelium discoideum amebae, Proc. atl. Acad. ci. UA, 1986, 83, ) J. Guesdon, T. Ternynck,. Avrameas, "The use of Avidinbiotin interaction in immunoenzymatic techniques", J. istochem. Cytochem., 1979, 27, uccinimidyl Biotins (ydrophobic) 14) P. Kongtawelert, P. Ghosh, "A new sandwich-elia method determination of keratan sulfate peptides in biological fluids employing monoclonal antibody and labeled avidin biotin technique", Clin. Chem. Acta, 1990, 195, ) G. Paganelli,. Perves, A. G. iccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. cassellati, A. A. Epenetos, Interperitoneal radiolocalization of tumors pretargeted by biotinylated monoclonal antibodies", Int. J. Cancer, 1990, 45, ) C. Wagner, U. Kruger, J. E. hivery, elective precipitation of biotin-labeled antigens or monoclonal antibodies by avidin for determining epitope specificities and affinities in solution- phase assays, Methods Enzymol., 1990, 184, ) D. M. Boorsma, J. VanBommel, E. M.. 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16 2. 二 価 性 試 薬 二 価 性 試 薬 は 一 分 子 内 に アミノ 基 と 反 応 する 活 性 エステル 基 や 基 に 反 応 するマレイミド 基 を 持 つ 試 薬 で タンパク 質 分 子 を 結 合 させるのに 使 用 される 保 持 する 官 能 基 リンカーの 長 さ リンカー 部 位 の 種 類 水 溶 性 の 有 無 により 分 類 される <etero-bifunctional Reagents> EMC -(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (E018) 100 mg ; 同 仁 品 コード (E018) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (3) ジメチルホルムアミド 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : 63 以 上 (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 (6) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 200 mg/ml( ジメチルホルムアミド ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a GMB -(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 95.0% 以 上 (3) クロロホルム 溶 状 : 試 験 適 合 (4) ジメチルホルムアミド 溶 状 : 試 験 適 合 (5) 融 点 : (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 (6) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 50 mg/5 ml (クロロホルム) 50 mg/5 ml (ジメチルホルムアミド) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (G005) 100 mg ; 同 仁 品 コード (G005) MC -(8-Maleimidocapryloxy)succinimide 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 又 は 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (3) IR スペクトル: 試 験 適 合 (4) MR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 20 mg/ml ( アセトニトリル ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (257) KMU -(11-Maleimidoundecanoyloxy)succinimide [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 又 は 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (3) IR スペクトル: 試 験 適 合 (4) MR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 20 mg/ml (アセトニトリル) 20 mg/3 ml (メチルアルコール) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (K214) 14

17 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 ulfo-emc -(6-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide, sodium salt [CA o (free acid)] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 桃 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 20 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C a 9 = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (024) ulfo-gmb -(4-Maleimidobutyryloxy)sulfosuccinimide, sodium salt [CA o (free acid)] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 桃 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 20 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C a 9 = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (025) ulfo-mc -(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimide, sodium salt [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 桃 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 20 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C a 9 = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (026) ulfo-kmu -(11-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide, sodium salt [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 桃 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 1 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C a 9 = pacer length: a 50 mg ; 同 仁 品 コード (250) ulfo-mcc -[(4-Maleimidomethyl)cyclohexylcarbonyloxy]sulfosuccinimide, sodium salt [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (330) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 90.0% 以 上 溶 解 例 10 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C a 9 = pacer length: a 15

18 PDP -uccinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate [CA o ] 100 mg ; 同 仁 品 コード (291) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC):98.0% 以 上 (3) アセトニトリル 溶 状 : 試 験 適 合 (4) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 100 mg/50 ml( アセトニトリル ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = pacer length: a ulfo-ac 5 -PDP -{6-[3-(2-Pyridyldithio)propionamido]hexanoyloxy}sulfosuccinimide, sodium salt [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (359) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC):90.0% 以 上 溶 解 例 95 mg/ml( 水 ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C a 8 3 = pacer length: a 性 質 ulfo-ac 5 -PDP は 分 子 内 に - ヒドロキシスクシンイミド 活 性 エステル 基 を 持 つため 抗 体 や 酵 素 等 のタンパク 質 のアミノ 基 にピリジルジスルフィド 基 を 導 入 することができる ピリジルジスルフィド 基 は 還 元 剤 により 容 易 に 還 元 され 基 とすることがで きる また タンパク 質 などの 基 と 交 換 反 応 するため ジスルフィド 結 合 を 介 してカラムの 担 体 やタンパク 質 などと 結 合 させるこ とができる 本 試 薬 は PDP と 異 なりスルホン 酸 基 を 有 する 活 性 エステル 基 が 導 入 されているため 試 薬 を 溶 解 するための DMF や DM など 有 機 溶 媒 を 用 いることなく 標 識 反 応 を 行 うことが 可 能 である <omo-bifunctional Reagents> B3 Bis(sulfosuccinimidyl)suberate, disodium salt [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (B574) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 93.0% 以 上 溶 解 例 10 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意 C a = pacer length: a 性 質 アミノ 基 同 士 の 架 橋 反 応 が 可 能 な 試 薬 である - ヒドロキシスクシンイミド 活 性 エステルを 分 子 の 両 端 に 有 しており アミ ノ 基 に 対 して 選 択 的 に 反 応 するため 酵 素 標 識 体 の 調 製 や 単 純 ハプテンを 担 体 タンパク 質 に 結 合 することが 可 能 である B3 はリンカー 部 分 にアルキル 鎖 を 有 する 化 学 構 造 をとる 一 方 DP および DTP は リンカー 部 位 にジスルフィド 基 が 導 入 されていることで 還 元 剤 により 容 易 に 還 元 されリンカー 部 位 の 切 断 が 可 能 である また B3 および DTP は スルホン 酸 基 を 有 する 活 性 エステル 基 が 導 入 されているため 試 薬 を 溶 解 する 際 に DMF や DM など 有 機 溶 媒 を 用 いることなく 標 識 反 応 を 行 うことが 可 能 である DTP Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), disodium salt [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (D630) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 80.0% 以 上 溶 解 例 10 mg/ml ( 水 ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意 C a = pacer length: a 16

19 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 DP Dithiobis(succinimidyl propionate) [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 殆 ど 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 95.0% 以 上 (3) ジメチルホルムアミド 溶 状 : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルホルムアミド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意 C = pacer length: a 1 g ; 同 仁 品 コード (D629) Dithiobis(succinimidyl undecanoate) Dithiobis(succinimidyl undecanoate) 略 名 (DU) 10 mg; 同 仁 品 コード (D537) 50 mg; 同 仁 品 コード (D537) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) MR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 10 mmol/l 以 上 (ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意, 窒 素 置 換 C = pacer length: a Dithiobis(succinimidyl octanoate) Dithiobis(succinimidyl octanoate) 略 名 (D) 10 mg ; 同 仁 品 コード (D538) 50 mg ; 同 仁 品 コード (D538) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) MR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 10 mmol/l 以 上 (ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意, 窒 素 置 換 C = pacer length: a Dithiobis(succinimidyl hexanoate) Dithiobis(succinimidyl hexanoate) 略 名 (D) 10 mg ; 同 仁 品 コード (D539) 50 mg ; 同 仁 品 コード (D539) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 90.0% 以 上 (3) MR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 10 mmol/l 以 上 (ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 蔵, 2. 吸 湿 注 意, 窒 素 置 換 C = pacer length: a 17

20 プロトコル 6) I Fab の 調 製 法 1. F(ab ) 2 の 調 製 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) lgg ブタ 胃 ペプシン 緩 衝 液 A 緩 衝 液 B ephacryl -200R(GE ヘルスケア 社 製 ) (2) 操 作 1) lgg 5 mg/0.5 ml を 緩 衝 液 A で 透 析 する 2) 透 析 液 にブタ 胃 ペプシン 0.1 ~ 0.2 mg を 溶 解 し 37 で 15 ~ 20 時 間 インキュベートする 3) p7 に 調 整 して ephacryl -200R で 緩 衝 液 B を 用 いて 0.35 ml/min でゲル 濾 過 する 4) F(ab ) 2 分 画 をとり 濃 縮 する 280 nm での 吸 光 度 を 測 定 し 100 mg/ml のナトリウムアジドを 1% 添 加 して 保 存 する 5) MW=92,000 E 280 nm =1.48 g -1 L cm -1 を 用 いて 濃 度 を 決 定 する 蛋 白 濃 度 (mg/ml)=a 280 nm /(1.48 MW) MW=A 280 nm /1.48 または モル 濃 度 (mol/l)= A 280 nm /(1.48 MW) で 求 める IgG のペプシンによる 消 化 時 間 は 動 物 種 によリ 異 なる 例 え ば ウサギ IgG では 6 時 間 だが ヤギでは 1 ~ 2 日 ラット マウスの lgg 2b では F(ab ) 2 とはならない 6, 8) 2. Fab の 調 製 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) F(ab ) 2 緩 衝 液 C 緩 衝 液 D 0.1 mol/l 2-メルカプトエチルアミン 溶 液 (11.36 mg の 2-メルカプトエチルアミン 塩 酸 塩 を 緩 衝 液 D 1 ml に 溶 解 する ) (2) 操 作 1) 0.1 ~ 3 mg の F(ab ) 2 を 含 む 緩 衝 液 C 0.45 ml に 2-メルカプトエ チルアミン 溶 液 50 μl を 添 加 する 2) 37 で 90 分 間 インキュベートする 3) Ultrogel AcA44 カラムで 緩 衝 液 D を 用 いて 0.35 ml/min でゲル 濾 過 する 4) Fab 分 画 をとり 280 nm の 吸 光 度 を 測 定 し MW=46,000 E 280 nm =1.48 g -1 L cm -1 を 用 いて 濃 度 を 決 定 する さらに 後 述 の 方 法 で 基 を 定 量 する 6, 8) 3. 基 の 定 量 法 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) 5 mmol/l 4-PD 溶 液 (4-PD(Code: P017)1.1 mg/ 緩 衝 液 B 1 ml) (2) 操 作 1) Fab (3 ~ 14 μmol/l A 280 nm =0.1 ~ 1.0) の 緩 衝 液 D 溶 液 0.5 ml に 4-PD 溶 液 20 μl を 添 加 する 2) 30 で 10 分 間 インキュベートする 3) 324 nm の 吸 光 度 を 測 定 し 4-PD より 遊 離 した 4- チオピリ ドンを そのモル 吸 光 係 数 ε 324 nm =19,800 を 用 い 定 量 する Fab の 基 は EDTA 存 在 下 では 還 元 型 IgG の 基 より も 格 段 に 安 定 で 取 り 扱 い 易 い 8) 1) II 仔 ウシ 小 腸 由 来 アルカリホスファターゼ Fab ヘの 標 識 1. 仔 ウシ 小 腸 由 来 アルカリホスファターゼへのマレイミ ドの 導 入 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) 仔 ウシ 小 腸 由 来 アルカリホスファターゼ 緩 衝 液 E 緩 衝 液 F EMC(Code: E018) ephadex G-25(GE ヘルスケア 社 製 ) (2) 操 作 1) アルカリホスファターゼ (2 mg)/ 緩 衝 液 E 0.5 ml を 同 じ 緩 衝 液 E を 用 い 透 析 する 2) 透 析 液 に EMC(0.17 mg)/dmf 10 μl を 添 加 して 30 で 30 分 間 インキュベーションする 3) ephadex G-25 カラム (1 45 cm) で 緩 衝 液 F によりゲル 濾 過 し 濃 縮 する 4) マレイミド 量 (II-3) とアルカリホスファターゼ 活 性 (II-4) を 測 定 する 2. マレイド 導 入 アルカリホスファターゼの Fab への 標 識 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) マレイミド 導 入 アルカリホスファターゼ Fab 緩 衝 液 D, 緩 衝 液 G, 緩 衝 液 F 10 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン ( 緩 衝 液 D 溶 液 ) ナトリウムアジド (2) 操 作 1) マレイミド 導 入 アルカリホスファターゼ 1 mg(10 nmol) を 緩 衝 液 F 0.25 ml に 溶 解 し Fab 2.3 mg (50 nmol)/ 緩 衝 液 D 溶 液 0.25 ml を 混 合 する 2) 4 で 20 時 間 インキュベートする 3) 10 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン 溶 液 10 μl を 添 加 し Ultrogel AcA44 カラムでゲルろ 過 する 溶 離 液 には 緩 衝 液 G を 用 い 0.35 ml/min で 流 す 4) アルカリホスファターゼ 活 性 (II-4) を 測 定 し 100 mg/ml BA と 100 mg/ml のナトリウムアジドをそれぞれ 1% 添 加 し 保 存 する 6) 3. マレイミドの 定 量 法 EMC や GMB によりアルカリホスファターゼに 導 入 された マレイミドの 導 入 数 は 以 下 の 方 法 で 算 出 する (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) マレイミド 導 入 アルカリホスファターゼ 緩 衝 液 C 0.5 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン 溶 液 (I-2 で 調 製 した 0.1 mol/l の 2-メルカプトエチルアミン 塩 酸 塩 溶 液 10 μl と 50 mmol/l EDTA (p6.0) 2 ml を 混 合 し 調 製 す る 50 mmol/l EDTA 溶 液 100 ml 調 製 時 には 小 社 2A(Code: 001) 1.86 g を 溶 解 し 1 mol/l a で p6.0 に 調 製 する ) 5 mmol/l 4-PD 溶 液 (4-PD(Code: P017)1.1 mg/ 緩 衝 液 B 1 ml) (2) 操 作 1) マレイミドを 導 入 したアルカリホスファターゼ ( 約 10 μmol/l) / 緩 衝 液 C 0.45 ml に 0.5 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン 溶 液 50 μl を 添 加 する 2) 30 で 20 分 間 インキュベートする 3) 5 mmol/l の 4-PD 溶 液 20 μl を 加 える 18

21 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 4) 30 で 10 分 インキュベートする 5) 324 nm の 吸 光 度 より ε=19,800 M -1 cm -1 を 用 いて 計 算 する 4. アルカリホスファターゼ 活 性 の 測 定 比 色 法 および 蛍 光 法 があるが ここでは 最 も 一 般 的 な 比 色 法 とし て PPP(4- ニトロフェニルリン 酸 ) による 方 法 を 紹 介 する 8) (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) 緩 衝 液 5.5 mmol/l PPP/ 緩 衝 液 1 mol/l a (2) 操 作 1) 酵 素 溶 液 を 緩 衝 液 で 希 釈 する 2) 酵 素 希 釈 溶 液 0.5 ml を 30 ~ 37 で 5 分 間 インキュベーショ ンする 3) 5.5 mmol/l PPP/ 緩 衝 液 0.5 ml を 添 加 する 4) 30 ~ 37 で 10 ~ 100 分 間 インキュベーションする 5) 1 mol/l a 0.5 ml を 加 えて 反 応 を 停 止 させ 405 nm の 吸 光 度 を 測 定 する 予 め 既 知 濃 度 のアルカリホスファターゼを 用 い 同 一 法 で 活 性 を 測 定 し 作 製 しておいた 酵 素 濃 度 - 吸 光 度 の 検 量 線 から 定 量 する また 酵 素 量 は 280 nm の 吸 光 度 より ε=0.99 cm 2 mg -1 と MW=100,000 よリ 計 算 する タンパク 濃 度 (mg/ml)=a 280 nm / (0.99 MW) MW=A 280 nm / 0.99 またはモル 濃 度 (mol/l)=a 280 nm / (0.99 MW) で 求 める 9) III GMB を 用 いたβ - ガラクトシダーゼの IgM モノクローナル 抗 体 への 標 識 (1) 試 薬 ( 緩 衝 液 については 本 稿 末 尾 を 参 照 ) 緩 衝 液 I 緩 衝 液 L 緩 衝 液 J 緩 衝 液 M 緩 衝 液 K 緩 衝 液 β- ガラクトシダーゼ GMB(Code: G005) ephadexg-25(ge ヘルスケア 社 製 ) DEAE-TYPEARL( 東 ソー 社 製 ) (2) 操 作 1) lgm(1 mg 1.1 nmol)/ 緩 衝 液 I 1.0 ml に GMB(33 μg 117 nmol)/dioxane 50 μl を 添 加 する 2) 20 で 40 分 間 インキュベーションする 3) ephadex G-25 カラム ( cm) を 用 い 4 緩 衝 液 J でゲルろ 過 する 280 nm の 吸 光 度 が 0.41(0.87 nmol のタンパ ク 質 に 相 当 ) を 含 むフラクション 2.5 ml を 得 る 4) これに β- ガラクトシダーゼ (2.62 nmol)/ 緩 衝 液 K 1.0 ml を 添 加 する 5) 30 で 30 分 間 インキュベートする 6) 緩 衝 液 L 0.1 ml を 添 加 する 7) こ の 溶 液 500 μl を 緩 衝 液 M で 平 衡 に 達 し た DEAE- TYPEAL カラム ( cm) にアプライする 緩 衝 液 を 用 い acl を 0.1 mol/l から 0.5 mol/l にグラディエントを かけながら 溶 出 する 8) 280 nm の 吸 光 度 を 測 定 し 緩 衝 液 L 0.1 ml の 入 ったチューブ にとって 酵 素 活 性 を 測 定 する 緩 衝 液 一 覧 本 稿 で 用 いた 緩 衝 液 の 組 成 の 一 覧 を 下 記 に 示 す 緩 衝 液 A : 0.1 mol/l 酢 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p mol/l acl を 含 む ) 緩 衝 液 B : 0.1 mol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p7.0) 緩 衝 液 C : 0.1 mol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p6.0) 緩 衝 液 D :0.1 mol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p6.0, 5 mmol/l EDTA を 含 む )(EDTA-2a 塩 を 緩 衝 液 作 製 途 中 で 終 濃 度 が 5 mmol/l となるよ うに 加 え 希 釈 してリン 酸 濃 度 が 0.1 mol/l にする すなわち 100 ml 調 製 時 は 小 社 2A(Code: 001) を 186 mg 用 いる ) 緩 衝 液 E : 50 mmol/l ホウ 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p7.6 1 mmol/l MgCl mmol/l ZnCl 2 を 含 む ) 緩 衝 液 F : 0.1 mol/l Tris-Cl 緩 衝 液 (p7.0 1 mmol/l MgCl mmol/l ZnCl 2 を 含 む ) 緩 衝 液 G : 10 mmol/l Tris-Cl 緩 衝 液 (p mol/l acl 1 mmol/l MgCl mmol/l ZnCl 2 を 含 む ) 緩 衝 液 : 0.1 mol/l グリシン -a 緩 衝 液 (p mmol/l MgCl g/l 卵 白 アルブミンを 含 む ) 緩 衝 液 I : 0.1 mol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p mmol/l acl を 含 む ) 緩 衝 液 J : 10 mmol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p mmol/l MgCl 2 50 mmol/l acl を 含 む ) 緩 衝 液 K : 0.1 mol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p mmol/lmgcl 2 5 mmol/l EDTA を 含 む ) 緩 衝 液 L : 60 mmol/l リン 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (p mmol/l EDTA 1 mmol/l MgCl 2 0.1% BA 0.1% ナトリウムアジドを 含 む ) 緩 衝 液 M : 20 mmol/l Tris-Cl 緩 衝 液 (p mol/l acl を 含 む ) 緩 衝 液 : 20 mmol/l Tris-Cl 緩 衝 液 (p7.5) 参 考 文 献 1) P. Cuatrecasas, I. Parikh, Biochemistry, 1972,11 (12), ). Yoshitake, Y. Yamada, E. Ishikawa, R. Masseyeff, Eur. J. Biochem., 1979, 101, ) M. J. ullivan, E. Gnemmi, D. Morris, G. Chieregatti, A. D. immonds, M. immons, J. W. Bridges, V. Marks, Anal.Biochem., 1979, 100, ). Yoshitake, M, Imagawa, E. Ishikawa, Anal. Lett., 1982, 15(132), ) J. V. taros, Biochemistry, 1982, 21, ) E. Ishikawa, M. Imagawa,. ashida,. Yoshitake, Y. amaguchi, T. Ueno, J. Immunoassay, 1983, 4, ). Yoshitake, Y. amaguchi, E. Ishikawa, cand. J. Immunol., 1979, 10, 81. 8) 石 川 榮 治 河 合 忠 宮 井 潔 酵 素 免 疫 測 定 法 第 三 版 (1987 医 学 書 院 ). 9) K. Fujiwara,. Matsumoto,. Yagisawa,. Tanimori, T. Kitagawa, M. orita, K. iratani, K. Fukushima, A. Tomonaga, K. ara, K. Yamamoto, J. Immunol. Methods, 1988, 112,

22 3. タンパク 質 標 識 試 薬 対 象 反 応 基 蛍 光 波 長 は 4 ページ ( 表. ラベル 化 剤 の 特 性 一 覧 表 ) を 参 照 下 さい CFE 10 mg ; 同 仁 品 コード (C309) 5- or 6-( -uccinimidyloxycarbonyl)-fluorescein 3,6 -diacetate [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 (4) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド ) C = IC3-u special packaging -Ethyl- -[5-( -succinimidyloxycarbonyl)pentyl]indocarbocyanine iodide 20 μg 3 ; 同 仁 品 コード (I271) 規 格 (1) 性 状 : 濃 赤 色 固 体 (2) 純 度 (PLC): 80.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 (4) モル 吸 光 係 数 : 80,000 以 上 (545 nm 付 近 ) 溶 解 例 20 μg/40 μl ( ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C I 3 4 = IC5-u special packaging -Ethyl- -[5-( -succinimidyloxycarbonyl)pentyl]-3,3,3,3 - tetramethyl-2,2 -indodicarbocyanine iodide 20 μg 3 ; 同 仁 品 コード (I272) 規 格 (1) 性 状 : 濃 青 色 固 体 (2) 純 度 (PLC):80.0% 以 上 (3) ジメチルスルホキシド 溶 状 : 試 験 適 合 (4) モル 吸 光 係 数 :110,000 以 上 (640 nm 付 近 ) (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 20 μg/40 μl ( ジメチルスルホキシド ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C I 3 4 = FITC-I Fluorescein-4-isothiocyanate [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 黄 橙 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC):95.0% 以 上 (3) アセトン 溶 状 : 試 験 適 合 (4) モル 吸 光 係 数 : 80,000 以 上 (492 nm 付 近 ) (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 100 mg/10 ml( アセトン ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = mg ; 同 仁 品 コード (F007) 500 mg ; 同 仁 品 コード (F007) 20

23 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 ulforhodamine 101 acid chloride 1, 5, 11, 15 -Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i j ]diquinolizin-18-ium, 9-(2-sulfo-4-chlorosulfophenyl)-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-,inner salt [CA o ] 10 mg ; 同 仁 品 コード (016) 規 格 (1) 性 状 : 紫 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (TLC): 85.0% 以 上 溶 解 例 1 mg/ml( クロロホルム ), 遮 光 本 製 品 は 二 種 類 のスルホニルクロライド 化 合 物 を 含 む 混 合 物 です C Cl = 試 作 品 ICG-ulfo-u 1 mg ; 同 仁 品 コード (I254) 2-[7-[1,3-Dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2-benzo[e]indol-2-ylidene]-1,3,5- heptatrienyl]-1,1-dimethyl-3-[5-(3-sulfosuccinimidyl)oxycarbonylpentyl]-1-benzo[e]indolium, inner salt, sodium salt 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 2. 吸 湿 注 意 C a 10 2 =

24 プロトコル タンパク 質 を 蛍 光 標 識 したい I IC-Dye を 使 用 したタンパク 質 標 識 例 1. 試 薬 50 mmol/l リン 酸 緩 衝 液 (p8.0) 1 mmol/l グアニジン 液 (Lu)DM (Code. LU08) 10 mmol/l リジン 溶 液 2. 方 法 1) タンパク 質 をリン 酸 緩 衝 液 に 溶 解 する (2 mg/ml) 2) 1) の 溶 液 25 μl ( タンパク 質 50 μg) をチューブに 入 れる 3) 1 mmol/l グアニジン 塩 酸 塩 25 μl を 2) のチューブに 入 れる 4) 98 で 3 分 間 加 熱 する 5) IC3(もしくは IC5)u special packaging 20 μg を DM 80 μl に 溶 解 する ( 試 薬 溶 液 ) 6) 4) のチューブに 5) の 試 薬 溶 液 1 μl を 添 加 し 混 合 する 7) 氷 上 で 1 時 間 反 応 させる 8) 10 mmol/l リジン 溶 液 を 2 μl 添 加 し 氷 上 で 15 分 静 置 する 9) 反 応 液 をゲルろ 過 もしくは TCA 沈 殿 を 行 い 未 反 応 の 色 素 を 除 去 する II BA への IC3(IC5) の 標 識 例 1. 試 薬 100 mmol 炭 酸 緩 衝 液 (p8.5) Dulbecco's PB(-) (Lu)DM (Code. LU08) 2. 操 作 手 順 1) BA を 炭 酸 緩 衝 液 に 溶 解 する (1.2 mg/ml) (BA 溶 液 ) 2) IC3( もしくは IC5) u special packaging 20 μg を DM 6 μl に 溶 解 する ( 試 薬 溶 液 ) 3) BA 溶 液 125 μl に 試 薬 溶 液 3 μl を 加 える ( 試 薬 量 は BA に 対 して 約 7.2 倍 量 となる ) 4) 30 で 1 時 間 インキュベートする 5) 反 応 液 をゲルろ 過 もしくは TCA 沈 殿 を 行 い 精 製 し 未 反 応 の 色 素 を 除 去 する III FITC-I を 使 用 した 抗 体 標 識 例 * 免 疫 の 生 化 学, 蛋 白 質 核 酸 酵 素 編 集 部 編, 共 立 出 版 発 行 より 引 用 1) 抗 体 蛋 白 液 の 蛋 白 量 を 屈 折 計 で 計 り (A mg/ml) ついで 液 量 を 測 定 (B ml) し 総 蛋 白 量 を 計 算 する (AxB=C mg) 2) 総 蛋 白 量 の 1/100 1/150 量 の FITC を 秤 量 し ( 蛋 白 液 量 により 加 減 する) 2% の 蛋 白 液 (C/20=D ml) の 1/10 量 (D/10=E ml) に 相 当 する 0.5 mol/l 炭 酸 緩 衝 液 (p9.5) で 溶 解 する 緩 衝 溶 液 中 で FITC は 徐 々に 分 解 していきます 速 やかにご 使 用 ください また DM やアセトンなどに FITC-I を 溶 解 後 反 応 時 に 緩 衝 液 に 添 加 する 方 法 もあります 3) ついで 蛋 白 溶 液 B ml にあらかじめ 生 理 食 塩 水 F ml(d- (B+E)=F ml) を 加 え これに FITC 溶 液 を 加 える (ここで 蛋 白 液 は は じめて 2% になる) 4) この 場 合 両 液 とも 1 2 に 保 っておく p9.5 である ことを 確 かめてから 7 9 の 温 度 で 泡 立 てないように 4 時 間 撹 拌 する 室 温 で 1 2 時 間 程 度 の 反 応 でも 結 構 です 抗 体 の 性 質 にあわ せてください 5) 反 応 液 を ephadex カラムろ 過 し 未 反 応 の 色 素 を 除 去 する (PB p7 使 用 ) 6) 必 要 があれば 更 に DEAE カラムで 分 離 精 製 する 22

25 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 4. PLC 用 誘 導 体 化 試 薬 対 象 反 応 基 蛍 光 波 長 は 4 ページ ( 表. ラベル 化 剤 の 特 性 一 覧 表 ) を 参 照 下 さい BD-F 4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 淡 黄 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 99.0% 以 上 (3) エチルアルコール 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( エチルアルコール ) 10 mg/ml( アセトニトリル ), 遮 光 ABD-F 4-Fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 黄 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 99.0% 以 上 (3) アセトニトリル 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : (5) モル 吸 光 係 数 : 4,500 以 上 (315 nm 付 近 ) (6) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( アセトニトリル ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 遮 光, 2. 吸 湿 注 意 C 6 2 F 3 3 = C 6 4 F 3 3 = mg ; 同 仁 品 コード (020) 100 mg ; 同 仁 品 コード (020) 50 mg ; 同 仁 品 コード (A016) 100 mg ; 同 仁 品 コード (A016) AM -(9-Acridinyl)maleimide [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 黄 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 96.0% 以 上 (3) ジオキサン 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : ( 分 解 ) (5) モル 吸 光 係 数 : 12,600 以 上 (362 nm 付 近 ) (6) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 12.5 mg/50 ml( ジオキサン ) 取 扱 注 意 保 存 方 法 : 冷 蔵 C = mg ; 同 仁 品 コード (018) BD-F 4-Fluoro-7-sulfobenzofurazan, ammonium salt [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 淡 黄 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 98.0% 以 上 (4) モル 吸 光 係 数 : 4,000 以 上 (317 nm 付 近 ) (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 25.5 mg/100 ml( 水 ) 10 mg/2 ml( ホウ 酸 buffer, p9.5), 遮 光 C 6 6 F 3 4 = mg ; 同 仁 品 コード (013) 100 mg ; 同 仁 品 コード (013) 23

26 DDB 1,2-Diamino-4,5-dimethoxybenzene, dihydrochloride [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 桃 灰 白 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 ( 滴 定 ):98.0% 以 上 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 100 mg/10 ml( 水 ), 遮 光 C 8 14 Cl = mg ; 同 仁 品 コード (D034) MDB 1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene, dihydrochloride [CA o ] 50 mg ; 同 仁 品 コード (M021) 100 mg ; 同 仁 品 コード (M021) 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 微 桃 白 色 結 晶 性 粉 末 (2) 純 度 ( 滴 定 ): 98.0% 以 上 以 下 (400 nm) (4) メチルアルコール 溶 状 : 試 験 適 合 以 下 (400 nm) (5) 融 点 : ( 分 解 ) (6) IR スペクトル: 試 験 適 合 溶 解 例 100 mg/10 ml( 水 ) 100 mg/10 ml( メチルアルコール ), 遮 光 C 7 10 Cl = Br-DMEQ 3-Bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-1,2-dihydroquinoxaline-2-one [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 黄 色 針 状 結 晶 (2) 純 度 (PLC): 96.0% 以 上 ( ラベル 化 後 ) (3) アセトニトリル 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : ( 分 解 ) (5) ラベル 化 試 験 : 試 験 適 合 (6) IR スペクトル : 試 験 適 合 (7) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 6.0 mg/5 ml( アセトニトリル ) Br-Mmc 4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin [CA o ] C Br 2 3 = mg ; 同 仁 品 コード (B036) 100 mg ; 同 仁 品 コード (B023) 規 格 (1) 性 状 : 淡 黄 色 ~ 淡 黄 灰 白 色 結 晶 性 粉 末 (2) アセトン 溶 状 : 試 験 適 合 (3) 融 点 : (4) モル 吸 光 係 数 : 11,000 以 上 (332 nm 付 近 ) (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 100 mg/10 ml( 熱 アセトン ) 16 mg/100 ml( エチルアルコール ) C 11 9 Br 3 = DMEQ-CCl 3-Chlorocarbonyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1 )-quinoxalinone [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 橙 色 ~ 赤 橙 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC): 95.0% 以 上 ( ラベル 化 後 ) (3) トルエン 溶 状 : 試 験 適 合 (4) IR スペクトル : 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 8.5 mg/10 ml( トルエン ) 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍, 遮 光, 2. 吸 湿 注 意 C Cl 2 4 = mg ; 同 仁 品 コード (D049) 24

27 タンパク 質 架 橋 剤 ラベル 化 剤 5. 関 連 試 薬 DTPA anhydride Diethylenetriamine-,,,, -pentaacetic acid, dianhydride [CA o ] 1 g ; 同 仁 品 コード (D033) 5 g ; 同 仁 品 コード (D033) 規 格 (1) 性 状 : 微 黄 色 ~ 微 黄 褐 色 粉 末 (2) 純 度 ( 滴 定 ): 99.0% 以 上 (DTPA として ) (3) アルカリ 溶 状 : 試 験 適 合 (4) 融 点 : ( 分 解 ) (5) IR スペクトル : 試 験 適 合 (6) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 1 g/[3 ml( 水 ) + 2 ml(3 mol/l-a)] 1 mg/ml(ジメチルスルホキシド) 取 扱 注 意 吸 湿 注 意 C = BABE Request; 同 仁 品 コード (B437) 1-(p -Bromoacetamidobenzyl)ethylenediamine-,,, -tetraacetic acid [CA o ] 取 扱 注 意 1. 保 存 方 法 : 冷 凍,2. 吸 湿 注 意 C Br 3 9 = FeBABE 1 mg; 同 仁 品 コード (F279) 1-(p -Bromoacetamidobenzyl)ethylenediamine-,,, -tetraacetic acid, iron(iii) 規 格 (1) 性 状 : 黄 褐 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC) : 95.0% 以 上 溶 解 例 緩 衝 溶 液 DM に 可 溶 取 扱 注 意 1. 安 衛 法, 2. 保 存 方 法 : 冷 凍, 3. 吸 湿 注 意 C BrFe 3 9 = AB-TA free acid 100 mg ; 同 仁 品 コード (A459) -(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid [CA o ] 規 格 (1) 性 状 : 白 色 ~ 淡 黄 白 色 粉 末 (2) 純 度 (PLC):97.0% 以 上 (4) IR スペクトル: 試 験 適 合 (5) MR スペクトル : 試 験 適 合 溶 解 例 10 mg/ml( 水 ) C =