空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 した ウイルスに 対 する 抑 制 性 能 評 価 試 験 方 法 1. 目 的 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 したウイルスに 対 する 抑 制 の 評 価 方 法 を 定 める 2. 対 象 品 目 空 気 清 浄 機 を 対 象 とする

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1 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 した ウイルスに 対 する 抑 制 性 能 評 価 試 験 方 法 2011 年 ( 平 成 23 年 )7 月 4 日 制 定 一 般 社 団 法 人 日 本 電 機 工 業 会

2 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 した ウイルスに 対 する 抑 制 性 能 評 価 試 験 方 法 1. 目 的 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 したウイルスに 対 する 抑 制 の 評 価 方 法 を 定 める 2. 対 象 品 目 空 気 清 浄 機 を 対 象 とする 但 し その 他 の 品 目 にも 準 用 することを 妨 げない 3. 試 験 機 関 試 験 は 公 的 機 関 に 依 頼 する 公 的 機 関 の 例 1.( 財 ) 北 里 環 境 科 学 センター 2.( 財 ) 日 本 食 品 分 析 センター 4. 試 験 微 生 物 等 試 験 に 用 いる 微 生 物 は 下 記 から 選 択 する 下 記 では 例 として 大 腸 菌 ファージおよびイン フルエンザウイルスを 用 いる 例 を 挙 げる これ 以 外 に 適 切 なものがあれば 追 加 する なお WHO ガイドライン 及 び 国 立 感 染 症 研 究 所 病 原 体 等 安 全 管 理 規 程 においてBS L2(バイオセフティーレベル2;Biosafety Level 2) 以 上 に 区 分 されている 微 生 物 (イ ンフルエンザウイルス 等 )の 使 用 にあたっては 病 原 体 等 の 管 理 と 使 用 に 関 する 現 行 の 法 律 および 指 針 の 順 守 が 必 要 である 1) 大 腸 菌 ファージと 宿 主 菌 :( 下 記 のいずれかを 選 択 ) 1 大 腸 菌 ファージ Escherichia coli phage Phi-X174(ATCC B1 NBRC 等 ) 宿 主 菌 Escherichia coli (ATCC NBRC 等 ) 2 大 腸 菌 ファージ Escherichia coli phage MS2 (NBRC 等 ) 宿 主 菌 Escherichia coli (NBRC 3012 同 同 等 ) 2) インフルエンザウイルス A 型 と 宿 主 細 胞 :( 下 記 は 代 表 例 ) 1 Influenza A virus H1N1(A/PR/8/34) ATCC VR-95 等 2 Influenza A virus H3N2(A/Aichi/2/68) ATCC VR-547 等 宿 主 細 胞 は 発 育 鶏 卵 または 使 用 するウイルス 株 に 感 受 性 がある 培 養 細 胞 (Madin-Darby canine kidney;mdck 細 胞 等 )とする ファージの 種 類 選 択 にあたっては 評 価 目 的 としたヒトウイルスと 代 替 使 用 するファー ジが 各 メーカーの 機 器 に 対 して 示 す 感 受 性 をあらかじめ 調 べておく その 結 果 ファージ の 感 受 性 がヒトウイルスと 同 等 ないし 低 いファージ 種 を 用 いることとする 5. 試 験 方 法 対 象 フィルターは 浮 遊 ウイルスまたは 飛 まつ 物 を 70% 以 上 抑 制 または 捕 捉 できるフィ ルターであることを 確 認 すること 風 速 は 任 意 とするが 試 験 品 の 風 量 切 替 ボタンで 設 定 で きない 風 量 では 試 験 してはならない 捕 捉 したウイルスへの 抑 制 性 能 確 認 試 験 は 下 記 1),2)いずれかの 試 験 方 法 を 選 択 する 1)20~32m 3 の 試 験 チャンバー 内 に 対 象 フィルターを 搭 載 した 試 験 品 ( 空 気 清 浄 機 )を 設 - 1 -

3 置 し チャンバー 内 にファージ 懸 濁 液 を 噴 霧 浮 遊 させる 初 発 (0 時 問 )の 浮 遊 ファージ をインピンジャーもしくはゼラチンフィルターで 捕 集 後 試 験 品 の 運 転 を 開 始 する なお 詳 細 の 試 験 方 法 は 空 気 清 浄 機 の 浮 遊 ウイルスに 対 する 除 去 性 能 評 価 試 験 方 法 に 準 ずる 試 験 終 了 後 試 験 品 から 対 象 フィルターを 取 り 出 し 一 定 面 積 (10 10cm)を 切 り 出 して 試 験 片 とする 試 験 片 をストマッカー 袋 に 入 れ 0.015%チオ 硫 酸 ナトリウム 溶 液 20ml を 加 えてストマッカー 処 理 したものを 試 料 原 液 とし イオン 交 換 水 で 10 倍 段 階 希 釈 列 を 作 製 す る その 試 料 原 液 または 希 釈 液 と 大 腸 菌 を 半 流 動 寒 天 に 混 合 し 35 で 18 時 間 培 養 する 培 養 後 培 地 上 に 発 生 したプラーク 数 を 数 え フィルター100cm 2 あたりの 付 着 ウイルス 数 を 求 める 同 様 の 試 験 を 標 準 品 ( 抗 ウイルス 処 理 のないフィルターが 搭 載 された 空 気 清 浄 機 )で 行 い ウイルス 不 活 化 効 果 を 算 出 する 試 験 時 間 は24 時 間 以 内 とする 2)フィルターの 試 験 片 (3 3 cm 以 上 )(9 枚 ) 標 準 品 ( 抗 ウイルス 処 理 のないフィル タ)の 試 験 片 (3 3 cm 以 上 )(9) 枚 を 用 意 し ファージ 液 またはインフルエンザウイル ス 液 を 接 種 する フィルターの 試 験 片 (9) 枚 を 試 験 品 ( 空 気 清 浄 機 )の 対 象 フィルターの 風 上 側 に 均 等 に 配 置 したものと 標 準 品 ( 抗 ウイルス 処 理 のないフィルタ)の 試 験 片 (9) 枚 を 試 験 品 ( 空 気 清 浄 機 )の 対 象 フィルターの 風 上 側 に 均 等 に 配 置 したものを 用 意 する その 後 それぞれの 試 験 品 ( 空 気 清 浄 機 )を 運 転 させ 一 定 時 間 後 に 試 験 片 を 回 収 する 詳 細 を 以 下 に 示 す 3) 試 験 系 20~32m 3 の 試 験 チャンバー 内 または セーフティキャビネット 内 に 空 気 清 浄 機 を 設 置 する チャンバー 内 の 温 湿 度 条 件 は 初 期 温 度 は 23±10 初 期 湿 度 は(50±20) %RH と する なお 試 験 中 の 温 湿 度 がこの 範 囲 を 越 える 場 合 は フィルターの 試 験 片 を 用 いた 試 験 標 準 品 ( 抗 ウイルス 処 理 のないフィルタ)の 試 験 片 を 用 いた 試 験 の 両 者 を 同 条 件 に 合 わせる 4)ファージ 液 またはインフルエンザウイルス 液 の 調 製 1ファージ 液 の 調 製 ( 例 ) ホストを 普 通 寒 天 培 地 ( 例 : 日 水 製 薬 社 製 Code または Nutrient Agar(NA) 培 地 ( 例 :Difco)+0.5%NaCl で 前 培 養 した1コロニーを 釣 菌 し 大 腸 菌 用 液 体 培 地 ( 例 :NB 培 地 -+0.5%NaCl)に 植 菌 して 35±1 で 18±2 時 間 静 置 培 養 する また は 35±1 で 100rpm で 5±1 時 間 振 とう 培 養 する 角 型 シャーレ 下 層 培 地 ( 例 : 普 通 寒 天 培 地 または NA 培 地 +0.5%NaCl を 約 60mL) を 作 成 し 培 養 した 大 腸 菌 液 体 培 地 5mL( 約 108~9CFU/mL)(CFU:Colony forming unit) とファージ 5mL( 約 10 5~6 PFU/mL)を 大 腸 菌 とファージの 比 率 がおよそ 1000:1 とな るよう 加 えて 混 合 し 35±1 10~20 分 間 静 置 する この 液 に 硬 化 しない 程 度 に 暖 め た( 例 :45~50 ) 軟 NB 寒 天 培 地 (NB 培 地 +0.5%NaCl+0.5% 寒 天 )10mL を 添 加 混 合 し 角 型 シャーレ 下 層 培 地 へ 重 層 し 固 定 化 させて 倒 置 せずに 35±1 で 18±2 時 間 程 度 培 養 する 培 養 後 角 型 シャーレ 上 層 をコンラージ 棒 を 用 いて ストマッカー 用 袋 ( 例 : seward 社 製 #BA6141 standard bags)に 回 収 し 260rpm で2 分 間 ストマッキング 後 35±1 で 1 時 間 静 置 する この 液 を 別 の 50mL 遠 沈 管 に 移 し 3500rpm で 10 分 間 遠 心 し 上 澄 みをさらに 別 の 50mL 遠 沈 管 に 移 す この 遠 心 操 作 をさらに 2 回 繰 り 返 した 後 上 澄 みを 孔 径 0.22μm のメンブレンフィ ルター( 例 :Stericup-MILLIPORE 社 製 #SCGPU02RE でろ 過 し 試 験 ファージ 原 液 を 得 る または JIS T 8061 によるファージ 液 を 調 製 する ファージ 原 液 濃 度 は Phi-X174 の 場 合 10 9 ~10 10 PFU/mL MS2 の 場 合 ~10 12 PFU/mL 程 度 とし, 作 成 したファージ 原 液 は 試 験 に 供 すまで 凍 結 保 存 または 冷 蔵 保 存 する 噴 霧 試 験 直 前 に 解 凍 し 滅 菌 イオン 交 換 水 で 希 釈 し 液 の 表 面 張 力 を 65~69( 10-3 N/m)に 調 節 し ファージ 液 の 濃 度 を 10 6 ~10 7 PFU/mL に 調 製 し 試 験 に 供 する なお 上 記 方 法 にて 作 成 したファージ 原 液 の 使 用 期 限 は 凍 結 乾 燥 保 存 で Phi-X174 は 3 ヶ 月 MS2 は 6 ヶ 月 とし 噴 霧 ファージ 液 は その 日 のうちに 使 い 切 る - 2 -

4 なお 試 験 で 使 用 するファージは 凍 結 解 凍 標 品 または 乾 燥 標 品 のアンプル(0 代 ) を 上 記 方 法 で 培 養 した 液 (1 代 とする)を 用 い 作 成 すること(2 代 とする) 1 代 お よび 2 代 を 購 入 または 輸 送 する 場 合 は, 冷 凍 輸 送 とし, 輸 送 時 に 解 凍 されていないこ とを 確 認 したもののみ 使 用 可 能 とする 2インフルエンザウイルス 液 の 調 製 ( 例 ) 発 育 鶏 卵 の 漿 尿 膜 腔 に 試 験 インフルエンザウイルスを 接 種 する ふ 卵 器 で 培 養 後 漿 尿 液 を 採 取 しショ 糖 密 度 勾 配 遠 心 法 により 精 製 したインフルエンザウイルス 液 をイ ンフルエンザウイルス 原 液 とする 作 成 したインフルエンザウイルス 原 液 を 滅 菌 イオン 交 換 水 もしくはリン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (phosphate buffered saline:pbs)にて 希 釈 し インフルエンザウイルス 濃 度 を 10 6 ~10 8 PFU/mL(PFU: Plaque forming unit)もしく は 10 6 ~10 8 TCID50/mL (TCID50:50%tissue culture infectious dose)に 調 製 し 試 験 に 供 する 5)ファージ 液 またはインフルエンザウイルス 液 の 試 験 片 への 接 種 ファージ 液 またはインフルエンザウイルス 液 (50μl 以 上 )をフィルターの 試 験 片 標 準 品 ( 抗 ウイルス 処 理 のないフィルター)の 試 験 片 に 数 箇 所 に 分 けて 接 種 する 接 種 量 は 基 準 を 1mlとし フィルタの 保 水 状 態 により 50μlまで 減 らしてもよい 接 種 量 を 1mlから 減 らす 場 合 ウイルス 液 及 びファージ 液 の 濃 度 を 減 らした 接 種 量 に 応 じて 濃 く 調 整 してもよい ( 例 :フィルタへの 接 種 量 を 0.1ml に 減 らす 場 合 それぞれ ファ ージ 液 の 濃 度 10 7 ~10 9 (PFU/ml)インフルエンザ 液 の 濃 度 10 7 ~10 9 (PFU/ml or TCID50/ml) となる この 時 試 験 片 を 持 ち 上 げ ファージ 液 またはインフルエンザウイルス 液 が 自 重 で 落 ちない 事 とする なお 供 試 ウイルス 液 が 試 験 片 に 浸 透 しにくい 場 合 は 非 イオン 界 面 活 性 剤 0.05%を 添 加 しても 良 い 6)ファージ 液 またはインフルエンザウイルス 液 の 回 収 回 収 した 試 験 片 は それぞれに 1 枚 あたり 20mL 以 上 の MEM(Minimum Essential Medium) PBS(Phosphate buffered saline) 滅 菌 イオン 交 換 水 のいずれかを 加 え 1 手 振 り( 振 幅 30cm 30 回 振 とう)2 試 験 管 用 かくはん 器 (5 秒 5 回 ) 3ストマッカーで 3 分 間 処 理 4ボルテックスミキサー( 例 :VORTEX GENIE2 Scientific Industries 製 ) で 回 転 数 3000rpm( 攪 拌 レベル 10)で 3 分 間 攪 拌 等 でウイルスを 試 験 片 から 洗 い 出 す 洗 い 出 した 試 料 ( 液 )は フィルターの 試 験 片 (9) 枚 で1セット 標 準 品 ( 抗 ウ イルス 処 理 のないフィルタ)の 試 験 片 (9) 枚 で1セットとし 混 合 して 測 定 に 用 いる フィルターに 抗 ウイルス 効 果 のある 物 質 を 放 射 することで 効 果 を 出 す 製 品 の 場 合 上 記 のフィルターの 試 験 片 を 対 象 フィルターとし 試 験 品 ( 空 気 清 浄 機 )を 運 転 させる ときに 抗 ウイルス 効 果 のある 物 質 を 放 射 することで 評 価 を 行 う 7) ファージ 数 またはインフルエンザウイルス 感 染 価 の 測 定 1ファージ 数 の 測 定 ( 例 ) 誘 出 したファージ 液 を 試 料 原 液 として 滅 菌 イオン 交 換 水 もしくは MEM PBS で 10 倍 段 階 希 釈 列 を 作 製 する その 試 料 原 液 または 希 釈 液 とファージ 液 調 製 時 と 同 様 の 方 法 で 大 腸 菌 を 培 養 した 大 腸 菌 液 体 培 地 を 混 合 し 35±1 10~20 分 間 静 置 する この 液 に 45~50 の 軟 NB 寒 天 培 地 を 添 加 混 合 し 角 型 シャーレ 下 層 培 地 へ 重 層 し 固 定 化 させて 上 下 逆 さにし 35±1 で 16~24 時 間 程 度 培 養 する 培 養 後 培 地 上 に 発 生 したプラーク( 例 ;10~100/シャーレ)を 数 え 洗 い 出 し 液 1ml 当 たり(または 試 験 片 1 個 当 たり)のファージ 数 を 求 める なお 洗 い 出 し 液 はろ 過 滅 菌 をする 2インフルエンザウイルス 感 染 価 の 測 定 ( 例 ) a)プラーク 形 成 法 を 用 いた 場 合 洗 い 出 したファージウイルス 液 を 試 料 原 液 として イオン 精 製 水 もしくは MEM (Minimum Essential Medium) PBS で 10 倍 段 階 希 釈 列 を 作 製 する その 試 料 原 液 または 希 釈 液 を MDCK 細 胞 に 接 種 する 接 種 した MDCK 細 胞 は 細 胞 培 養 液 と Agarose を 等 量 混 合 したものを 載 せ 37 5%CO2 下 で 培 養 を 行 う 培 養 後 固 定 染 色 を 行 い 発 生 したプラークを 数 え 洗 い 出 し 液 1ml 当 たり(または 試 験 片 1 個 当 たり)のイン - 3 -

5 フルエンザウイルス 感 染 価 を 求 める b)tcid50(50%tissue culture infectious dose) 法 を 用 いた 場 合 洗 い 出 したインフルエンザウイルス 液 を 試 料 原 液 として イオン 交 換 水 もしくは MEM PBS で 10 倍 段 階 希 釈 列 を 作 製 する その 試 料 原 液 または 希 釈 液 100μL と 5% ウシ 胎 児 血 清 (FBS:fetal bovine serum)を 含 む DMEM(Dulbecco s modified Eagle's Medium)に 懸 濁 した MDCK 細 胞 100μL を 96 ウエルプレートに 植 え 込 む その 後 炭 酸 ガスふ 卵 器 で 培 養 後 顕 微 鏡 下 で 細 胞 変 性 効 果 (CPE:cytopathogenic effect) を 確 認 し Reed-Muench 法 を 用 いて 洗 い 出 し 液 1ml 当 たり(または 試 験 片 1 個 当 た り)のインフルエンザウイルス 感 染 価 を 求 める 6. 試 験 結 果 試 験 の 結 果 から 下 記 の 式 によりウイルス 不 活 化 効 果 を 算 出 する R=Log(B/A) R:ウイルス 不 活 化 効 果 A: 標 準 品 の 一 定 時 間 後 のファージ 数 またはインフルエンザウイルス 感 染 価 B:フィルターの 試 験 片 の 一 定 時 間 後 のファージ 数 またはインフルエンザウイルス 感 染 価 数 値 は 少 数 点 以 下 2けた 目 を 切 り 捨 て 少 数 点 以 下 1けたで 表 示 する 注 :1 桁 減 少 は 90% 減 少 2 桁 減 少 は 99% 減 少 である 計 算 式 は 以 下 のようになる 7. 抑 制 効 果 本 試 験 方 法 によって 得 られる 対 数 減 少 値 が 2.0 以 上 のとき 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 したウイルスに 対 する 抑 制 効 果 があるものと 判 断 する - 4 -

6 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 したウイルスに 対 する 抑 制 性 能 評 価 試 験 方 法 解 説 1. 目 的 制 定 の 趣 旨 空 気 清 浄 機 のフィルターに 捕 捉 したウイルスに 対 する 抑 制 性 能 評 価 については 国 際 規 格 JIS 等 の 規 格 も 無 い 状 況 から 各 社 にて 第 三 者 試 験 機 関 の 協 力 も 交 えつつ 独 自 の 試 験 方 法 により その 評 価 を 行 って 来 た しかし その 試 験 方 法 等 が 各 社 で 統 一 されていないた めその 効 果 が 比 較 しにくく またインフルエンザの 流 行 により 空 気 清 浄 機 のウイルスに 対 する 除 去 または 抑 制 性 能 が 社 会 的 に 注 目 される 様 になった そのため その 評 価 を 業 界 で 統 一 して 行 える 様 に 本 抑 制 性 能 評 価 試 験 方 法 基 準 を 定 め 日 本 電 機 工 業 会 会 員 各 社 の 評 価 / 訴 求 の 適 正 化 を 図 る 2. 対 象 品 目 本 基 準 を 空 気 清 浄 機 以 外 のその 他 の 品 目 にも 準 用 する 事 は 妨 げないが 対 象 とする 品 目 の 特 性 を 考 慮 して 試 験 チャンバーの 大 きさ 及 び 測 定 時 間 については 品 目 毎 に 設 定 する 3. 試 験 機 関 本 基 準 はウイルスの 除 去 や 抑 制 を 評 価 することから 家 庭 電 気 製 品 製 造 業 における 表 示 に 関 する 公 正 競 争 規 約 に 準 拠 し 公 的 機 関 とする 4. 試 験 微 生 物 これまでウイルスに 対 する 性 能 検 証 は インフルエンザウイルスを 指 標 ウイルスとして 容 積 1m3 等 の 密 閉 空 間 を 用 いて 実 施 されてきたが 微 生 物 的 リスクの 観 点 から インフル エンザウイルスを 広 い 空 間 に 噴 霧 する 性 能 検 証 方 法 は 国 内 の 評 価 機 関 で 実 施 困 難 な 状 況 で ある 社 会 的 な 関 心 の 高 まりもあることから 本 来 は 対 象 とするウイルスを 用 いて 性 能 評 価 を 行 なうべきではあるが 上 記 のような 背 景 により 第 三 者 機 関 での 性 能 評 価 が 実 施 困 難 で あるため 本 規 定 ではファージ MS2 と Phi-X174 をインフルエンザウイルスの 代 替 ウイルス と 位 置 づけ 試 験 微 生 物 に 加 えている ファージは 細 菌 に 感 染 するウイルスの 総 称 であり 人 に 対 して 感 染 せず 病 原 性 を 有 しな いウイルスである ファージのなかには 様 々なタイプが 存 在 するが 大 腸 菌 に 感 染 する MS2 と Phi-X174 は 環 境 中 において 比 較 的 安 定 であり すでに JIS として 制 定 されている 試 験 法 においても 指 標 ウイルスとして 用 いられている ファージとインフルエンザウイルスの 感 受 性 について 比 較 検 証 した 結 果 ファージの 感 受 性 は インフルエンザウイルスに 比 べて 同 等 以 下 であることが 確 認 されている 場 合 において 不 活 化 効 果 においても 過 大 評 価 されることはないと 考 えられる 5. 試 験 方 法 1) 試 験 系 試 験 空 間 および 試 験 品 設 置 は JEM1467( 家 庭 用 空 気 清 浄 機 )の 試 験 空 間 および 試 験 品 設 置 に 合 わせることとする 設 定 するチャンバー 内 の 温 湿 度 条 件 は 使 用 するウイル スがその 条 件 によって 死 滅 するなどの 影 響 を 与 えない 条 件 とする - 5 -

7 コントロール 環 境 ( 自 然 減 衰 等 )での 評 価 を 行 い ウイルスの 死 滅 がないことを 確 認 すること 試 験 品 の 運 転 時 間 について フィルターに 捕 捉 したウイルスの 生 存 時 間 としては 24~48 時 間 湿 潤 環 境 では72 時 間 以 上 とされ JIS L 1902において も18 時 間 の 試 験 方 法 があることから 最 大 24 時 間 と 規 定 した 3) 参 考 文 献 ファージがインフルエンザウイルスの 代 替 となる 根 拠 の 資 料 APIC guideline for selection and use disinfectant 以 上 - 6 -

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