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1 平 成 20 年 度 ノロウイルスの 不 活 化 条 件 に 関 する 調 査 報 告 書 国 立 医 薬 食 衛 生 研 究 所 食 衛 生 管 理 部 山 本 茂 貴 野 田 衛

2 Ⅰ 背 景 近 年 ノロウイルスによる 食 中 毒 感 染 症 が 増 加 し 国 民 の 健 康 に 大 きな 被 害 をもたらし ている 過 去 数 年 間 の 食 中 毒 統 計 によると ノロウイルスによる 食 中 毒 は 事 例 数 ではカン ピロバクターに 次 いで 第 二 位 患 者 数 では 第 一 位 を 占 めていたが 2006 年 末 の 未 曾 有 の 大 流 行 により 2006 年 は 患 者 数 事 例 数 とも 第 一 位 となり 事 例 数 で 全 食 中 毒 事 例 の 半 数 近 く 患 者 数 では 3/4 近 くを 占 めた このノロウイルスの 大 流 行 を 受 け 薬 事 食 衛 生 審 議 会 食 衛 生 分 科 会 食 中 毒 部 会 において 平 成 19 年 10 月 12 日 に ノロウイルス 食 中 毒 対 策 につい て( 提 言 ) が 取 りまとめられるなど ノロウイルス 対 策 は 食 中 毒 感 染 症 の 両 面 から 厚 生 労 働 行 政 上 重 要 な 課 題 のひとつとなっている ノロウイルスによる 食 中 毒 感 染 症 の 未 然 予 防 および 発 生 後 の 拡 大 防 止 のためには 汚 染 環 境 等 に 存 在 するノロウイルスを 加 熱 あるいは 消 毒 殺 菌 剤 等 により 不 活 化 ( 死 滅 )させるこ とが 極 めて 重 要 である 厚 生 労 働 省 はノロウイルスを 不 活 化 させる 方 法 として 85 1 分 以 上 の 加 熱 および 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムによる 処 理 が 有 効 であるとして その 適 用 を 推 奨 し ている しかしながら すべての 汚 染 物 に 加 熱 あるいは 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムによる 消 毒 が 適 用 できるわけではなく 特 に 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムは 金 属 に 対 する 腐 食 作 用 皮 膚 等 に 対 する 刺 激 作 用 衣 類 に 対 する 漂 白 作 用 等 があるため その 使 用 が 制 限 される 場 合 が 多 く 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムに 替 わる 有 効 な 消 毒 剤 等 の 開 発 が 強 く 求 められている また 実 際 の 現 場 において ノロウイルスは 有 機 物 とともに 存 在 する 場 合 が 多 いため 試 験 管 内 の 不 活 化 効 果 は 実 際 の 現 場 での 有 効 性 とは 必 ずしも 一 致 せず 現 場 に 即 した 環 境 ( 有 機 物 存 在 下 )での 有 効 性 評 価 も 必 要 とされている さらに 近 年 ノロウイルスに 有 効 とされる 消 毒 剤 等 が 開 発 売 されているが それらについての 有 効 性 評 価 はあまり 行 われていない 一 方 ノロ ウイルスに 有 効 な 消 毒 剤 等 に 関 するデータについて 多 くの 文 献 的 報 告 があり 消 毒 剤 等 の 有 効 性 に 関 する 情 報 整 理 も 必 要 とされている Ⅱ 目 的 以 上 の 背 景 を 踏 まえて ノロウイルスの 不 活 化 に 関 し 実 験 的 に 各 種 消 毒 剤 等 の 有 効 性 を 検 証 すること およびこれまで 得 られている 科 学 的 データを 取 りまとめ ノロウイルスの 不 活 化 条 件 等 について 情 報 を 整 理 することを 目 的 として 本 調 査 を 行 った 今 年 度 は 下 記 の 事 項 について 実 施 した 1. ノロウイルスの 代 替 ウイルスであるネコカリシウイルスを 用 いての 消 毒 剤 等 を 中 心 とした 有 機 物 存 在 下 での 不 活 化 効 果 の 有 効 性 の 効 果 判 定 試 験 2. リアルタイム PCR 法 による 遺 伝 子 定 量 法 での 効 果 判 定 の 検 証 実 験 3. ノロウイルス 等 の 不 活 化 等 に 関 する 文 献 情 報 の 収 集 および 取 りまとめ Ⅲ 各 種 消 毒 剤 等 のネコカリシウイルスに 対 する 不 活 化 効 果 試 験 1. 方 法 (1) 供 試 ウイルス ネコカリシウイルス(FCV)F9 株 を CRFK 細 胞 に 接 種 し 37 1 時 間 吸 着 PBS(-)で 3 回 1

3 洗 浄 後 血 清 不 含 イーグル MEM 培 地 で 37 CO 2 フラン 器 内 で 静 置 培 養 した 全 ての 細 胞 に 細 胞 変 性 効 果 (CPE)が 生 じた 時 点 ( 培 養 後 約 2 日 目 )で 培 養 液 および 細 胞 を 回 収 し 凍 結 融 解 を 3 回 繰 り 返 した 後 3,000rpm 30 分 遠 心 分 離 した 上 清 を 試 験 用 ウイルス 原 液 とした 試 験 用 ウイルス 原 液 は 少 量 に 小 分 けし 使 用 時 まで-80 で 保 存 した 試 験 時 に 試 験 用 ウイルス 原 液 を PBS(-) 0.2% 牛 血 清 アルブミン(Sigma A ML) 加 PBS(-) あるいは 20% 牛 血 清 アルブミン 加 PBS(-)を 等 量 加 え 有 機 物 を 含 まないウイル ス 液 (FCV-PBS(-)) 有 機 物 ( 牛 血 清 アルブミン)を 0.1%(FCV-0.1% 牛 血 清 アルブミン)あるい は 10%(FCV-10% 牛 血 清 アルブミン) 含 むウイルス 液 の 3 種 類 のウイルス 液 を 調 製 し それぞ れ 不 活 化 試 験 に 供 した なお 供 試 ウイルス 液 は 不 活 化 試 験 時 に 等 量 の 消 毒 剤 等 と 混 合 され るため 不 活 化 試 験 時 に FCV-0.1% 牛 血 清 アルブミンは 0.05% FCV-10% 牛 血 清 アルブミン は 5%の 牛 血 清 アルブミンを 含 むことになる (2) 供 試 消 毒 剤 等 不 活 化 試 験 に 供 した 消 毒 剤 等 およびそれらの 調 整 方 法 の 概 要 を 表 1 に 示 した (3) 不 活 化 試 験 3 種 類 のウイルス 液 各 25μl と 各 消 毒 剤 等 25μl を 混 和 し 室 温 で 3 分 間 静 置 した その 後 0.1N チオ 硫 酸 ナトリウム 5μl を 加 え 混 合 した 後 速 やかに 反 応 液 20μl を 血 清 不 含 イ ーグル MEM 培 地 900μl で 希 釈 混 和 した 不 活 化 試 験 は 消 毒 剤 等 ごとに 3 回 繰 り 返 した (4) 不 活 化 試 験 後 の 生 存 ウイルスの 定 量 血 清 不 含 イーグル MEM 培 地 で 希 釈 した 反 応 液 を さらに 血 清 不 含 MEM 培 地 で 10 倍 階 段 希 釈 し 各 希 釈 液 25μl を 96 穴 マイクロプレートに 培 養 した CRFK 細 胞 に 接 種 し( 各 希 釈 液 につき 4 穴 を 使 用 ) 2% 牛 胎 児 血 清 加 イーグル MEM 培 地 で 37 CO 2 加 フラン 器 内 で 培 養 した 接 種 後 7 日 ~8 日 目 に CPE の 有 無 を 観 察 し 50% 以 上 の 細 胞 に CPE が 認 められた 場 合 CPE 陽 性 ( 不 活 化 されていない)とした 生 存 ウイルス 量 は 不 活 化 試 験 に 供 したウイルス 液 25μl 中 の 生 存 ウイルス 量 (TCID 50 )で 示 した 定 量 試 験 の 結 果 生 存 ウイルスがまったく 確 認 できない 場 合 32TCID 50 /25μl 以 下 の 生 存 ウイルス 量 となる 2. 結 果 ( 図 1 表 2) 今 年 度 実 施 したネコカリシウイルスを 用 いた 不 活 化 試 験 の 結 果 を 図 1 に また 昨 年 度 実 施 した 結 果 と 合 わせてその 概 要 を 表 2 に 取 りまとめた (1) 炭 酸 ナトリウム 及 び 過 炭 酸 ナトリウム 炭 酸 ナトリウム 及 び 過 炭 酸 ナトリウムによるネコカリシウイルスに 対 する 不 活 化 効 果 の 有 効 性 が 報 告 されている(1)ことから 検 証 試 験 を 実 施 した 1.25% 炭 酸 ナトリウム( 最 終 濃 度 ) および 2.5% 過 炭 酸 ナトリウムで PBS(-) 中 0.05% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 で 検 出 限 界 以 下 (4log 10 以 上 減 少 )となり 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 で 3log 10 程 度 減 少 した この 不 活 化 の 程 度 は 5,000ppm 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムには 及 ばないまでも 1,000ppm 次 亜 塩 素 酸 ナトリウ ムと 同 等 以 上 の 不 活 化 効 果 であった 0.25% 炭 酸 ナトリウムおよび 0.5% 過 炭 酸 ナトリウム では PBS(-) 0.05% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 で 3~4log 10 の 減 少 を 示 したが 5% 牛 血 清 アル ブミン 存 在 下 では 不 活 化 効 果 は 認 められなかった 2

4 表 1 供 試 消 毒 剤 およびその 調 製 法 消 毒 剤 等 試 験 液 の 調 整 法 備 考 炭 酸 ナトリウ ム 過 炭 酸 ナトリ ウム Milli Q 水 で 希 釈 して 供 試 濃 度 の 2 倍 濃 度 の 試 験 液 を 作 成 Milli Q 水 で 希 釈 して 供 試 濃 度 の 2 倍 濃 度 の 試 験 液 を 作 成 試 験 時 の 濃 度 : 1.25% 0.25% 試 験 時 の 濃 度 : 2.5% 0.5% J 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 防 カビ 消 臭 [ 主 成 分 ]フェノール 類 プロパノール 水 酸 化 ナトリウム エチレングリコール 水 K 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 消 臭 [ 主 成 分 ] 二 酸 化 塩 素 液 界 面 活 性 剤 シリコン 系 消 泡 剤 L 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 防 カビ 消 臭 [ 主 成 分 ] 二 酸 化 塩 素 水 溶 液 M 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 消 臭 効 果 [ 主 成 分 ] 殺 菌 電 解 水 99.87% 以 上 CIO2 0.13% 未 満 N 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 殺 菌 消 臭 [ 主 成 分 ] 強 酸 性 水 O 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 消 臭 抗 菌 [ 主 成 分 ] 水 ユーカリエキス グリセリン 脂 肪 酸 エステル 乳 酸 キトサン エタノール コカミドプロビルベタイン 焦 性 ブドウ 酸 P 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 手 指 皮 膚 の 殺 菌 消 毒 グルコン 酸 クロルヘキシジン 塩 酸 アルキルジアミノエチ ルグリシン Q 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 手 指 皮 膚 の 殺 菌 消 毒 [ 主 成 分 ]ベンザルコニウム 塩 化 物 0.05w/v% 添 加 物 : DL-ピロリドンカルボン 酸 Na クエン 酸 クエン 酸 Na ポ リオキシエチレン 硬 化 ヒマシ 油 エタノール R 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 除 ウイルス [ 主 成 分 ] 陽 イオン 系 界 面 活 性 剤 ( 第 4 級 アンモニウム 塩 系 ) アルカリ 剤 S 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 除 菌 [ 主 成 分 ]グレープフルーツ 種 子 抽 出 物 (GSE) エチルアル コール フィチン 酸 精 製 水 T 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 手 指 皮 膚 の 洗 浄 消 毒 [ 主 成 分 ]エタノール 76.9~81.4vol% / 添 加 物 :ヒアルロン 酸 Na グリセリン トコフェロール 酢 酸 エステル カルボ キシビニルポリマー トリエタノールアミン U 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ] 手 指 用 清 浄 ジェル [ 主 成 分 ]エタノール 水 イソプロパノール カルボマー ミリスチン 酸 イソプロピル 香 料 グリセリン PG 酢 酸 トコフェロール オキシベンゾン-4 DIPA V 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ]サンタリージェル(アルコール 系 消 毒 消 臭 除 菌 剤 ) [ 主 成 分 ]65%エタノール 5%IPA アロエ セージ ロー ズマリー ネトル シャモミレ 他 W 購 入 を 直 接 使 用 [ 用 途 ]すり 傷 切 り 傷 さし 傷 かき 傷 靴 ずれ 創 傷 面 の 洗 浄 消 毒 [ 主 成 分 ] 50ml 中 塩 化 ベンゼトニウム 0.02g / 添 加 物 : ヒドロキシプロピルセルロース LPG 3

5 図 1 各 種 消 毒 薬 等 によるネコカリシウイルスに 対 する 不 活 化 作 用 A: PBS(-) B: 0.05%アルブミン 存 在 下 C:5%アルブミン 存 在 下 対 照 (PBS(-)) 炭 酸 ナ ト リ ウ ム ( 試 験 1 25% 時 ). 炭 酸 ナ ト リ ウ ム ( 試 験 0 25% 時 ). 過 炭 酸 ナ ト リ ウ ム ( 試 験 2 5% 時 ). 過 炭 酸 ナ ト リ ウ ム ( 試 験 0 5% 時 ). ( J) ( K) ( L) ( M) ( N) ( O) ( P) (Q) (R) (S) (T) (U) (V) (W) 4

6 表 2 各 種 消 毒 剤 等 のネコカリシウイルスに 対 する 不 活 化 効 果 有 機 物 の 存 在 試 験 試 薬 対 照 (PBS(-)) 0.05%アルブミン 5%アルブミン 減 平 均 ± SD 減 少 平 均 ± SD 平 均 ± SD 減 少 少 接 種 ウイルス 4.25 ± 0.25 対 照 4.33 ± 0.14 対 照 4.08 ± 0.14 対 照 5000ppm 次 亜 塩 素 酸 Na 0.00 ± ± ± ppm 次 亜 塩 素 酸 Na 0.00 ± ± ± ppm 次 亜 塩 素 酸 Na 0.00 ± ± ± ppm 次 亜 塩 素 酸 Na 0.75 ± ± ± 最 終 濃 度 70%エタノール 0.75 ± ± ± 最 終 濃 度 60%1-プロパノール 0.00 ± ± ± 最 終 濃 度 35%エタノール 2.92 ± ± ± 最 終 濃 度 30%1-プロパノール 0.00 ± ± ± エタノール ( 最 終 濃 度 38.5%~40.7%) 0.42 ± ± ± 最 終 濃 度 1.25% 炭 酸 ナトリウム 0.00 ± ± ± 最 終 濃 度 0.25% 炭 酸 ナトリウム 0.25 ± ± ± 最 終 濃 度 2.5% 過 炭 酸 ナトリウム 0.00 ± ± ± 最 終 濃 度 0.5% 過 炭 酸 ナトリウム 0.50 ± ± ± A( 次 亜 塩 素 酸 Na/ 消 毒 ) 0.17 ± ± ± B( 次 亜 塩 素 酸 Na/ 漂 白 剤 ) 0.17 ± ± ± C ( 安 定 化 次 亜 塩 素 酸 / 消 臭 除 菌 ) 1.67 ± ± ± D(エタノール/ 清 浄 ) 1.25 ± ± ± E (エタノール/ 洗 浄 食 添 加 物 ) F (ポピヨンヨード/ 殺 菌 消 毒 ) 0.00 ± ± ± ± ± ± G 4.08 ± ± ± H 3.83 ± ± ± I 4.08 ± ± ± J 4.50 ± ± ± K( 二 酸 化 塩 素 / 除 菌 消 臭 ) 0.00 ± ± ± L ( 二 酸 化 塩 素 / 除 菌 防 かび 消 臭 ) 0.00 ± ± ±

7 M 2.67 ± ± ± N 4.08 ± ± ± O 3.50 ± ± ± P 4.58 ± ± ± Q 4.33 ± ± ± R 4.42 ± ± ± S 4.42 ± ± ± T 4.08 ± ± ± U 4.08 ± ± ± V 4.08 ± ± ± W 4.17 ± ± ± ( ) 主 成 分 / 主 用 途 (2) 消 毒 剤 等 住 宅 用 又 は 家 庭 用 除 菌 合 成 洗 剤 スプレータイプ 除 菌 消 臭 剤 除 菌 用 ハンドソープ 等 14 種 類 の 消 毒 剤 等 について 不 活 化 効 果 を 調 べた 本 試 験 ではすべての 消 毒 剤 等 は 等 量 のウイルス 液 と 混 合 して 試 験 されているため されている 状 態 ( 使 用 濃 度 )の 1/2 濃 度 で 試 験 されている ネコカリシウイルスに 対 して 明 瞭 な 不 活 化 効 果 が 認 められたものは 2 種 類 の 試 験 液 のみ ( K 及 び L)で いずれも PBS(-) 中 0.05% 牛 血 清 アルブミンン 存 在 下 で 一 部 生 存 ウ イルスがみられたもののほぼ 不 活 化 された しかし 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 では 不 活 化 効 果 はあまりみられなかった K 及 び L はいずれも 二 酸 化 塩 素 を 主 成 分 とするスプ レータイプで キッチン トイレなどの 環 境 の 消 臭 除 菌 剤 であった 次 亜 塩 素 酸 (0.13% 未 満 )を 含 む 電 解 水 を 主 成 分 とする M は PBS(-) 0.05% 牛 血 清 アルブミンン 存 在 下 で 1log 10 程 度 の 不 活 化 効 果 が 観 察 された 3. 考 察 昨 年 に 引 き 続 き 嘔 吐 物 糞 便 等 の 有 機 物 が 多 量 に 存 在 する 場 合 のノロウイルスの 不 活 化 を 想 定 し 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 での 各 種 消 毒 剤 等 の 有 効 性 を 調 べた 今 年 度 実 施 した 試 験 液 で 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 での 不 活 化 効 果 が 認 められたものは 1.25% 炭 酸 ナト リウムおよび 2.5% 過 炭 酸 ナトリウムで 3log 10 程 度 減 少 した この 不 活 化 の 程 度 は 5,000ppm 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムには 及 ばないまでも 1,000ppm 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムと 同 等 以 上 の 不 活 化 効 果 であった しかし その 減 少 量 は 3log 10 程 度 であり 10 6 ~10 9 個 /g 程 度 のウイルス が 存 在 することを 考 えると やはり 物 理 的 除 去 を 基 本 とし 消 毒 殺 菌 を 行 う 前 に 可 能 な 限 り 嘔 吐 物 や 糞 便 等 を 除 去 し 除 去 しきれず 残 存 したウイルスに 対 し 消 毒 剤 等 を 使 用 するこ とを 原 則 とすることに 変 わりはない 今 回 供 試 した 14 種 類 の 消 毒 剤 等 では 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 での 不 活 化 効 果 が 確 認 できたものはみられなかった 6

8 一 方 有 機 物 がほとんど 存 在 しない 状 態 では 1.25% 炭 酸 ナトリウムおよび 2.5% 過 炭 酸 ナトリウムは 検 出 限 界 以 下 まで 不 活 化 され 生 存 したウイルスは 検 出 されず 0.25% 炭 酸 ナ トリウムおよび 0.5% 過 炭 酸 ナトリウムでは 3~4log 10 程 度 の 不 活 化 効 果 があった 消 毒 剤 等 では 2 種 類 の 試 験 液 が 4log 10 程 度 の 不 活 化 効 果 があった この 不 活 化 は 200ppm 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムとほぼ 同 等 の 効 果 であり 有 機 物 の 少 ない 環 境 でのノロウイルスの 不 活 化 に 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムの 代 替 え 消 毒 剤 として 利 用 することができる 可 能 性 があると 考 えられた いずれも 二 酸 化 塩 素 を 主 成 分 とするスプレータイプの 消 臭 除 菌 剤 で キッチンやトイレ などの 環 境 材 料 への 使 用 を 目 的 としたものであった 二 酸 化 塩 素 は 文 献 的 にも(2) 不 活 化 効 果 が 報 告 されており 有 用 な 不 活 化 効 果 が 期 待 できると 考 えられた その 他 の 消 毒 剤 等 ではネコカリシウイルスに 対 して 明 瞭 な 不 活 化 効 果 は 観 察 されなか った なお 本 試 験 では 使 用 に 指 示 されている 1/2 濃 度 で 試 験 されていること またゲルタ イプの 試 験 液 ではウイルスと 試 験 液 が 十 分 に 混 和 されていない 可 能 性 があることなどから これらの 消 毒 剤 が 必 ずしも 不 活 化 効 果 をまったく 持 たないことを 示 すものではない 昨 年 度 実 施 した 消 毒 剤 等 を 含 め これまで 実 施 した 消 毒 剤 等 の 不 活 化 効 果 試 験 の 結 果 を 概 観 すると( 表 2) 嘔 吐 物 や 糞 便 等 の 高 濃 度 のノロウイルス 汚 染 の 除 去 に 際 しては 汚 染 物 を 可 能 な 限 り 物 理 的 に 取 り 除 いた 上 で 5,000ppm 以 上 の 濃 度 の 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムの 使 用 が 推 奨 される 有 機 物 が 少 ない 施 設 環 境 の 清 浄 除 菌 や 手 指 の 消 毒 等 を 目 的 とする 場 合 は 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 以 外 にも 有 効 性 が 確 認 される 消 毒 剤 が 存 在 するので 使 用 目 的 に 応 じて 使 い 分 けることができると 考 えられる IV. リアルタイム PCR 法 による 遺 伝 子 定 量 法 での 効 果 判 定 の 検 証 実 験 1. 方 法 (1) 供 試 ウイルス ノロウイルス( 遺 伝 子 型 GII.4) 陽 性 糞 便 の 10% 乳 剤 液 をさらに PBS(-)で 1000 倍 希 釈 し たものを 被 検 ウイルス 原 液 とし 供 試 時 まで-80 で 保 存 した 試 験 時 に 試 験 用 ウイルス 原 液 を PBS(-)あるいは 20% 牛 血 清 アルブミン(Sigma A ML) 加 PBS(-)を 等 量 加 え 有 機 物 を 含 まないウイルス 液 有 機 物 ( 牛 血 清 アルブミン) を 10% 含 むウイルス 液 の 2 種 類 のウイルス 液 を 調 製 し それぞれ 不 活 化 試 験 に 供 した なお 各 供 試 ウイルス 液 は 不 活 化 試 験 時 に 等 量 の 消 毒 剤 等 と 混 合 されるため 不 活 化 試 験 時 に 10% 牛 血 清 アルブミン 加 ウイルス 液 は 5%の 牛 血 清 アルブミンを 含 むことになる (2) 供 試 消 毒 剤 等 表 1 に 示 した 消 毒 剤 等 の 一 部 を 用 いた 対 照 として PBS(-)を 用 いた (3) 不 活 化 試 験 2 種 類 のウイルス 液 各 50μl と 各 消 毒 剤 等 50μl を 混 和 し 室 温 で 3 分 間 静 置 した その 後 以 下 の 4 種 類 の 方 法 で 得 た 試 験 液 を RNA 抽 出 に 供 した 1 反 応 後 速 やかに 反 応 液 の 一 部 を 分 取 したもの( 方 法 1) 2 反 応 後 等 量 (100μl)の 牛 胎 児 血 清 を 加 え よく 混 和 し その 一 部 を 速 やかに 分 取 したも の( 方 法 2) 7

9 3 反 応 後 等 量 の 牛 胎 児 血 清 を 加 え よく 混 和 し 室 温 で 一 夜 放 置 後 その 一 部 を 分 取 したも の( 方 法 3) 4 反 応 後 等 量 の 牛 胎 児 血 清 を 加 え よく 混 和 し その 混 合 液 70μl に 後 述 の AVL 試 薬 140 μl を 加 え 室 温 で 一 夜 放 置 し 以 後 の RNA 抽 出 操 作 を 行 ったもの( 方 法 4) (4) RNA 抽 出 上 記 方 法 1~3で 得 た 試 験 液 70μl に QIAamp Virus RNA Mini Kit(Qiagen) 添 付 の AVL 試 薬 140μl を 加 え 以 降 マニュアル 記 載 の 方 法 を 用 いて RNA 抽 出 を 行 った 方 法 4について も 同 様 に 処 理 した AVE 液 60μl に 回 収 した RNA 液 を DNAse 処 理 した 後 High Capacity cdna Synthesis Kit(ABI) および Oligo dt を 用 いて cdna を 合 成 した Kageyama らのリアルタイム PCR 法 (J Clin Microbiol, 41, , 2003)により cdna 5μl 中 のノロウイルス RNA コピー 数 を 定 量 し た (5) 結 果 の 判 定 リアルタイム PCR 法 による 定 量 値 の 結 果 とネコカリシウイルスを 用 いた 感 染 性 を 指 標 とし た 結 果 とを 比 較 し リアルタイム PCR 法 による 定 量 値 の 結 果 による 効 果 判 定 の 有 用 性 を 検 証 した 2. 結 果 遺 伝 子 定 量 検 査 による 不 活 化 効 果 判 定 結 果 をネコカリシウイルスを 用 いた 感 染 価 の 結 果 と 合 わせて 表 3 に 示 した 供 試 7 消 毒 剤 等 の 5% 牛 血 清 アルブミンを 含 む 場 合 と 含 まない 場 合 の 2 条 件 の 不 活 化 の 結 果 は 6 種 類 消 毒 剤 等 ( J,K,L,M,S)では 感 染 価 が 減 少 した 条 件 で は 遺 伝 子 定 量 値 も 減 少 し 感 染 価 が 変 化 しなかった 条 件 では 遺 伝 子 定 量 値 の 変 化 もなく 感 染 価 を 指 標 とした 場 合 と 遺 伝 子 定 量 値 を 指 標 した 場 合 とで 効 果 の 判 定 は 定 性 的 に 概 ね 一 致 し た しかし 感 染 価 では 大 きく 減 少 したのに 対 し 遺 伝 子 定 量 値 ではそれほど 減 少 しなかった もの( 試 薬 K の 有 機 物 を 含 まない 場 合 ) 逆 に 感 染 の 減 少 は 顕 著 ではないが 遺 伝 子 定 量 値 で は 比 較 的 減 少 が 大 きかったもの( 試 薬 M の 有 機 物 を 含 まない 場 合 )もあり 定 量 的 には 必 ずし も 感 染 価 と 遺 伝 子 定 量 値 とは 一 致 しない 傾 向 が 認 められた 一 方 O では 5% 牛 血 清 アルブミン 存 在 下 で 感 染 価 ではほとんど 不 活 化 効 果 が 認 められなかったのに 対 し 遺 伝 子 定 量 値 では 大 きく 定 量 値 が 減 少 した このため 遺 伝 子 定 量 値 では 試 験 液 ( O)が 抽 出 効 率 酵 素 反 応 などに 影 響 し 見 かけ 上 定 量 値 が 減 少 した 可 能 性 が 考 えられた そのため 試 験 液 そのものの 影 響 を 調 べるたに ウイルス 液 に 試 薬 0 を 添 加 後 反 応 時 間 を 置 かず 方 法 1および 方 法 2で RNA 抽 出 を 行 った 結 果 同 様 に 遺 伝 子 定 量 値 は 検 出 限 界 以 下 となり 試 験 液 そのものが RNA 抽 出 以 降 の 工 程 に 作 用 を 及 ぼし 定 量 値 に 影 響 を 与 えていることを 示 す 結 果 となった また 消 毒 剤 等 の 作 用 を 止 める 目 的 で 等 量 の 牛 胎 児 血 清 を 添 加 したもの( 方 法 2) あるい は 牛 胎 児 血 清 添 加 後 に 消 毒 剤 の 影 響 が 残 っている 場 合 経 時 的 に 定 量 値 が 低 下 する 可 能 性 が あるので 牛 胎 児 血 清 添 加 後 反 応 液 を 一 夜 放 置 したもの( 方 法 3)あるいは 牛 胎 児 血 清 添 加 後 蛋 白 変 性 剤 を 含 む RNA 抽 出 キットに 添 加 されている AVL 試 薬 を 添 加 して 一 夜 放 置 したもの( 方 8

10 法 4)について 遺 伝 子 定 量 を 行 ったが 大 きな 変 化 は 認 められなかった 表 3 遺 伝 子 定 量 検 査 と 感 染 価 による 不 活 化 効 果 判 定 の 比 較 リアルタイム PCR による 判 定 (ノロウイルス) 感 染 価 の 減 少 試 薬 有 機 物 の 割 合 方 法 1 反 応 後 等 量 の 牛 胎 児 血 清 を 添 加 方 法 2 方 法 3 方 法 4 (log 10 ) (ネコカリシ ウイルス) 対 照 J K L M N O S 0% % % % % (-) (-) 5% % ( ) ( ) 5% % ( ) ( ) 5% % % % ( ) ( ) 5% ( ) ( ) - 0% % :リアルタイム PCR では 定 量 価 が 対 照 の>0%~50%に 減 少 感 染 価 では 1~2log 10 の 減 少 :リアルタイム PCR では 定 量 価 が 検 出 限 界 以 下 感 染 価 では 3log 10 以 上 の 減 少 ( ) 内 は 反 応 時 間 <10 秒 での 結 果 3. 考 察 ヒトノロウイルスは 培 養 ができないことから ヒトノロウイルスそのものに 対 する 不 活 化 効 果 を 調 べる 場 合 には PCR 法 による 遺 伝 子 検 査 が 用 いられている ウイルスの 遺 伝 子 はウ イルス 粒 子 の 内 部 に 存 在 し 一 般 的 に 消 毒 剤 等 が RNA に 影 響 を 及 ぼすためにはウイルス 構 造 蛋 白 質 になんらかの 影 響 を 与 える 必 要 がある 従 って PCR 法 等 の 遺 伝 子 検 査 で 効 果 があっ たと 判 定 される 場 合 は 感 染 性 にも 影 響 がある すなわち 不 活 化 効 果 があると 考 えることは 妥 当 である しかしながら それは 遺 伝 子 検 査 に 偽 陰 性 の 可 能 性 が 完 全 に 排 除 されることが 前 提 となる 今 回 供 試 した 消 毒 剤 等 の 多 くは 感 染 価 と 遺 伝 子 定 量 値 との 結 果 は 効 果 の 有 無 の 判 定 において 多 くは 一 致 したが 感 染 価 では 変 化 がなく 遺 伝 子 定 量 値 のみが 減 少 した 例 が 1 例 認 められた( 0) この 理 由 として 用 いたウイルスの 違 いによることを 否 定 す 9

11 ることはできないが 通 常 は 考 えにくい この 例 では 試 験 液 そのものが RNA 抽 出 以 降 のス テップに 何 らかの 影 響 を 及 ぼし 見 かけ 上 遺 伝 子 定 量 を 減 少 させているものと 考 えられた 消 毒 剤 等 はそれぞれ 成 分 が 異 なり また 一 つの 消 毒 剤 にも 複 数 の 消 毒 に 有 効 な 成 分 が 含 ま れていることもあるので それぞれの 消 毒 剤 あるいはその 有 効 成 分 等 に 対 し 薬 剤 の 作 用 を 中 和 する 試 薬 を 用 いて 反 応 を 停 止 することは 不 活 化 効 果 のスクリーニング 検 査 の 判 定 法 として は 現 実 的 でない 汎 用 的 な 薬 剤 作 用 を 停 止 する 方 法 としては 薬 剤 の 影 響 を 受 けない 程 度 に 希 釈 する 方 法 多 量 の 有 機 物 を 添 加 し 作 用 を 弱 める 方 法 などが 考 えられ 今 回 は 等 量 の 牛 胎 児 血 清 を 添 加 した 系 を 試 みた M では 反 応 時 間 を 10 秒 以 下 とした 場 合 牛 胎 児 血 清 を 添 加 することにより 定 量 値 が 増 加 し 消 毒 剤 の 中 和 に 効 果 があったが O では 効 果 は 認 められなかった 本 結 果 から 遺 伝 子 検 査 においては 感 染 性 には 影 響 を 及 ぼさず 見 掛 け 上 遺 伝 子 検 査 で 有 効 と 判 定 される 可 能 性 が 示 唆 されたので 遺 伝 子 検 査 による 効 果 判 定 には 十 分 な 注 意 が 必 要 であると 考 えられた V ノロウイルス 等 の 不 活 化 等 に 関 する 文 献 情 報 の 収 集 および 取 りまとめ 1. 調 査 方 法 インターネット 等 を 通 じて ノロウイルスおよび 関 連 ウイルス 等 に 関 する 不 活 化 生 存 性 等 に 関 する 論 文 を 収 集 し その 情 報 を 整 理 した 2. 調 査 結 果 (1) ノロイルスの 不 活 化 条 件 等 に 関 する 研 究 の 現 状 の 概 要 今 年 度 は 前 年 度 の 取 りまとめ 以 降 に 発 表 された 論 文 を 中 心 に 情 報 を 収 集 した 不 活 化 に 関 しては 単 に 消 毒 剤 等 を 試 験 管 内 で 反 応 させて 効 果 を 判 定 するのではなく 実 際 にノロウ イルス 等 の 汚 染 が 問 題 となる 食 や 環 境 中 における 効 果 判 定 を 行 う 報 告 が 多 くみられた ま た ヒトノロウイルスは 依 然 培 養 できていないが マウスノロウイルスが 培 養 可 能 となった ことから 代 替 えウイルスとしてマウスノロウイルスを 使 用 して 不 活 化 効 果 を 検 討 している 報 告 が 増 加 した さらに 遺 伝 子 検 査 がウイルスの 生 存 性 や 不 活 化 効 果 の 判 定 に 利 用 可 能 かを 検 討 している 報 告 も 少 なからずみられ 今 後 の 研 究 動 向 が 注 目 される (2) 感 染 性 試 験 法 以 外 の 代 替 え 法 を 用 いたウイルスの 不 活 化 評 価 法 ウイルスの 生 存 性 や 消 毒 剤 の 殺 菌 効 果 の 判 定 はウイルスの 感 染 性 を 調 べることが 唯 一 直 接 的 な 評 価 方 法 であるが 近 年 感 染 性 試 験 法 以 外 の 代 替 え 試 験 法 の 開 発 やそれらを 用 いた 消 毒 剤 等 の 不 活 化 効 果 判 定 に 関 する 報 告 がみられる Nuanualsuwan ら(3)は A 型 肝 炎 ウイルス ポリオウイルス 1 型 ネコカリシウイルスを 用 いて 紫 外 線 照 射 塩 素 処 理 加 熱 処 理 を 行 ったウイルスを 蛋 白 分 解 酵 素 RNase で 消 化 し た 後 RT-PCR 法 で 検 出 することにより 未 処 理 のウイルス 粒 子 ( 感 染 性 ウイルス)と 処 理 した ウイルス 粒 子 ( 不 活 化 ウイルス)を 区 別 できる 可 能 性 を 示 した 10

12 一 方 Baert ら(4)は Nuanualsuwan らが 報 告 した 酵 素 処 理 をマウスノロウイルスの 熱 によ る 不 活 化 の 判 定 に 用 いているが 感 染 性 の 有 無 とリアルタイム PCR による 遺 伝 子 検 出 には 相 関 性 はなかったと 報 告 している しかし マウスノロウイルス RNA を 細 胞 にトランスフェク トすると 感 染 性 粒 子 が 回 収 されるが 熱 処 理 をした 場 合 は 回 収 されなかったと 報 告 してい る また マウスノロウイルスの 熱 による 不 活 化 では 秒 が 必 要 であることも 報 告 している Topping ら(5)は 加 熱 によるウイルス 粒 子 の 構 造 的 変 化 により 粒 子 外 部 に 露 出 したウイル ス RNA を RNase 処 理 で 分 解 した 後 逆 転 写 リアルタイム PCR を 行 い RNA のコピー 数 を 調 べた その 遺 伝 子 定 量 値 が 感 染 性 を 指 標 とした 方 法 と 相 関 性 が 認 めらたことから ウイルス の 不 活 化 評 価 法 に 応 用 できる 可 能 性 があることを 報 告 した また ヒトノロウイルス GII.4 はネコカリスウイルス FC-9 と 比 較 して 同 じ 不 活 化 を 得 るのに 13.3 高 い 温 度 を 必 要 とした ことから ヒトノロウイルスはネコカリシウイルスより 熱 に 対 し 抵 抗 性 であることを 示 して いる Lamhoujeb ら(6)は Nuanualsuwan ら(3)の 酵 素 処 理 とリアルタイム NASBA 法 を 用 いてレタ スと 七 面 鳥 をモデルとして 調 理 済 み 食 (Ready to eat foods) 中 のウイルスの 生 存 性 を 調 べ た レタスや 七 面 鳥 に 添 加 されたノロウイルスは 冷 蔵 保 存 で 少 なくても 10 日 間 生 存 すること が 示 された また 加 熱 処 理 酵 素 処 理 に 対 してネコカリシウイルスはノロウイルスと 比 較 して 抵 抗 性 が 弱 く 代 替 えウイルスとして 適 切 ではないことを 示 している (3) 水 環 境 中 における 生 存 性 Bae ら(7)は 地 上 水 (surface water)と 地 下 水 (groundwater)における 生 存 性 をマウスノロ ウイルス ネコカリシウイルス ポリオウイルス MS2 ファージを 用 いて 調 べた 感 染 価 と PCR 法 による 遺 伝 子 定 量 を 行 った 結 果 25 においてネコカリシウイルスは 感 染 価 および 遺 伝 子 定 量 値 の 減 少 が 顕 著 であり 他 のウイルスと 比 較 して 生 存 性 が 低 くノロウイルスの 代 替 えウイルスとして 適 さないとともに マウスノロウイルスは 生 存 性 が 高 く 重 回 帰 分 析 でもノ ロウイルスと 有 意 な 違 いはなかったことから 地 上 水 や 地 下 水 における 生 存 性 試 験 ではマウ スノロウイルスがノロウイルスの 代 替 ウイルスとして 適 当 であることを 示 した Shin ら(8)は 塩 素 要 求 フリー(chlorine demand-free)の 水 及 びクロロフォルム 処 理 フ ィルター 処 理 で 精 製 したウイルス 粒 子 を 用 いて ノロウイルスの 塩 素 に 対 する 抵 抗 性 を 厳 密 に 調 べた 短 い 増 幅 産 物 と 長 い 増 幅 産 物 が 得 られる 2 種 類 の RT-PCR で 不 活 化 効 果 を 判 定 した 結 果 1mg/L あるいは 5mg/L の 通 常 の 水 道 水 の 不 活 化 に 使 用 される 塩 素 濃 度 でノロウイルス は 対 照 としたポリオウイルス MS2 ファージと 比 較 して MS2 よりは 抵 抗 性 であるがポリオウ イルスよりは 感 受 性 であり これまでの 報 告 ほどノロウイルスは 塩 素 に 対 し 耐 性 ではなく 適 切 な 塩 素 処 理 で 飲 料 水 のノロウイルスの 汚 染 は 制 御 できると 述 べている 二 酸 化 チタン(TiO 2 )は, 紫 外 線 によって-OH,O 2 -,HO 2 -,H などのフリーラジカルを 放 出 し,その 強 力 な 酸 化 力 により 殺 菌 作 用 を 示 すとされている Lee ら(9)は 25mJ/cm 2 の 紫 外 線 照 射 によりマウスノロウイルスは 二 酸 化 チタン 存 在 下 で 3.6log 10 非 存 在 下 で 3.3log 10 の 減 少 を 示 し 紫 外 線 照 射 及 び 二 酸 化 チタンの 併 用 の 有 用 性 を 報 告 した 11

13 (4) 食 における 生 存 性 近 年 特 に 欧 米 においては 新 鮮 な あるいは 冷 凍 した 野 菜 果 物 によるノロウイルス 集 団 発 生 が 問 題 となっている Butot ら(10)は A 型 肝 炎 ウイルス ノロウイルス ロタウイルスお よびネコカリシウイルスを 用 いて 生 鮮 野 菜 果 物 における 生 存 性 と 不 活 化 法 を 検 討 した ブ ルーベリー ラズベリー イチゴ バジル パセリを 用 いた-20 2 日 間 の 凍 結 保 存 により イチゴにおいてネコカリシウイルスの 生 存 性 が 減 少 (2.7log 10 )した 以 外 感 染 価 (ノロウイル スはリアルタイム PCR のよる 遺 伝 子 定 量 のみ)の 減 少 は 概 ね 1log 10 以 下 で 顕 著 な 減 少 は 観 察 されなかった 90 日 間 の 観 察 では A 型 肝 炎 ウイルスとロタウイルスはほぼ 同 様 な 動 態 を 示 し ロタウイルスがブルーベリーとバジルで 凍 結 後 2 日 目 以 降 に 1log 10 減 少 した 以 外 ほとん ど 感 染 価 の 減 少 は 観 察 されなかった ノロウイルスの GI と GII の 比 較 では GII の 生 存 性 が 低 い 傾 向 にあり GII はブルーベリーでは 90 日 間 で 2.3log 10 の 減 少 が 観 察 された これらの 生 鮮 農 産 物 からのウイルスの 除 去 効 果 の 検 討 では 冷 水 および 温 水 を 用 いた 場 合 GI ノロウイル スが 洗 浄 後 不 検 出 であったのを 除 き 概 ね 1.5log 10 以 内 の 減 少 で ほとんどのウイルスは 除 去 されなかった 200ppm の 塩 素 水 による 洗 浄 では ネコカリシウイルスで 特 に 除 去 効 果 が 大 きく GI GII のノロウイルス A 型 肝 炎 ウイルスでもブルーベリー イチゴ バジルで 有 意 に 減 少 したが ラズベリー パセリではノロウイルス A 型 肝 炎 ウイルスで 顕 著 な 減 少 は 観 察 されなかった 塩 素 水 による 洗 浄 において A 型 肝 炎 ウイルスは 他 のウイルスと 比 較 して 抵 抗 性 が 強 かった ラズベリーとパセリの 二 酸 化 塩 素 による 洗 浄 では ppm の 1 分 間 の 作 用 でほとんど 減 少 効 果 はなく 10 分 の 作 用 でも 2log 10 以 下 の 減 少 に 止 まり ウイ ルスの 除 去 が 困 難 であることが 示 された Mattison ら(11)は ネコカリシウイルスを 用 いて レタス イチゴ ハム およびステン レスにおける 生 存 性 を 調 べた 10% 糞 便 乳 剤 のろ 過 液 で 作 成 したウイルス 液 を 付 着 乾 燥 後 4 または 室 温 で 7 日 間 観 察 した 結 果 4 での 生 存 性 が 高 い 傾 向 にあり イチゴを 除 き レ タス ハム およびステンレスでは 7 日 目 まで 感 染 性 ウイルスが 検 出 された 特 に ハムで の 生 存 性 が 高 く 乾 燥 しにくい ハムの 成 分 がウイルスの 保 護 作 用 があるなど ハムはウイ ルスの 生 存 に 適 した 環 境 であると 考 察 している Hewitt ら(12)は ニュージーランドの 緑 イ 貝 (Greenshell mussel, Perna canaliculus)を 用 いて 煮 沸 および 蒸 し 焼 きによる 不 活 化 を 検 討 した 供 試 した 6 ロット 50 個 体 の 緑 イ 貝 は 煮 沸 により 加 熱 開 始 後 170 秒 で 中 心 温 度 90 (ニュージーランドでは 秒 の 加 熱 がウ イルスの 不 活 化 に 推 奨 されている)に 達 し 210 秒 で 殻 が 開 いたことから 殻 が 開 いた 時 点 で はウイルスの 不 活 化 には 十 分 ではないことを 示 唆 した また 180 秒 の 蒸 し 焼 きでは 中 心 温 度 は 63 度 で A 型 肝 炎 ウイルスは 1.5log 10 の 減 少 180 秒 間 の 煮 沸 水 への 浸 漬 では 中 心 温 度 92 で A 型 肝 炎 ウイルスは 検 出 されなかった これらの 結 果 から 煮 沸 水 での 3 分 間 の 浸 漬 をウイルスの 不 活 化 に 推 奨 している Baert ら(13)は 加 熱 等 により 風 味 や 形 状 を 損 ないやすく 集 団 発 生 の 原 因 となっている ラズベリーについて 加 熱 による 殺 菌 効 果 をマウスノロウイルス 大 腸 菌 および B.fragilis HSP40 に 感 染 するファージ B40-8 を 用 いて 調 べた ラズベリーピューレに 各 微 生 物 を 汚 染 さ せた 場 合 秒 の 緩 和 な 加 熱 で それぞれ 1.86log log log

14 15 秒 の 加 熱 では 2.81log log log 10 の 感 染 価 の 減 少 が 認 められた( 表 4) さらに マウスノロウイルス B40-8 ファージについて 加 熱 後 4 24 時 間 冷 蔵 保 存 した 結 果 感 染 価 の 低 下 は 認 められなかった 表 4 ラズベリーピューレ 中 の 加 熱 による 不 活 化 微 生 物 感 染 価 の 減 少 (log 10 ) 秒 秒 マウスノロウイルス 1.86± ±0.39 B40-8 ファージ 3.89± ±0.56 大 腸 菌 2.77± ±0.48 Baert ら(14)は 玉 ねぎ ほうれん 草 における 洗 浄 による 除 去 および 生 存 性 等 についてマ ウスノロウイルスを 用 いて 調 べた 表 面 汚 染 させた 輪 切 り 玉 ねぎの 飲 料 水 (portable water) による 1 回 の 洗 浄 (100ml の 水 による 25 秒 の 攪 拌 )で 0.39log 10 の 減 少 ほうれん 草 では 1 回 の 洗 浄 (10g のほうれん 草 を 350ml の 水 で 2 分 間 攪 拌 )で 1.01log 10 3 回 の 洗 浄 で 1.26log 10 の 減 少 であった 一 方 4.98±0.21log 10 PFU/ml を 含 む 水 から 輪 切 り 玉 ねぎには 3.21± 0.58log 10 PFU ほうれん 草 (10g)には 3.74±0.28log 10 PFU のマウスノロウイルスが 移 行 した 水 およびほうれん 草 洗 浄 水 における 生 存 性 を 調 べた 結 果 飲 料 水 では 7 日 でほとんど 感 染 価 は 減 少 せず ほうれん 草 洗 浄 水 では 6 日 までほとんど 感 染 価 の 減 少 はなかったが 6 日 から 7 日 目 にかけて 0.67log 10 の 減 少 があった また 過 酢 酸 によるマウスノロウイルスの 不 活 化 効 果 を 飲 料 水 (ph8.18)あるいは 脱 ミネラ ル 水 (demineralized water, ph5.62)で 希 釈 した 液 で 調 べたところ 20ppm の 過 酢 酸 の 5 分 の 作 用 で 脱 ミネラル 水 (ph4.13)は 2.88±0.25log 10 PFU 飲 料 水 (ph7.70)は 2.41±0.18log 10 PFU 不 活 化 され 最 大 の 不 活 化 は 150ppm の 過 酢 酸 を 含 む 脱 ミネラル 水 (ph3.58)を 用 いた 場 合 で 4.29±0.15log 10 の 減 少 であった ほうれん 草 の 湯 煎 (ほうれん 草 50g を 80 または 90 の 飲 料 水 に 1 分 間 浸 漬 後 速 やかに 1 分 間 4 で 冷 却 )では 不 検 出 となった( 表 5) この 時 のほう れん 草 のペルオキシダーゼ 活 性 をみると 80 では 35.6% 90 では 78.8%が 失 活 しており この 活 性 を 指 標 に 利 用 することができると 報 告 している また きざんだ(shredded) 玉 ねぎ およびぶち 切 り(chopped)ほうれん 草 に 汚 染 させたマウスノロウイルスの-21 における 生 存 性 は 6 カ 月 間 でほとんど 変 動 はなかった ( 参 考 ) 過 酢 酸 過 酢 酸 は 殺 菌 消 毒 薬 として 使 用 され 主 に 医 療 器 具 の 滅 菌 殺 菌 消 毒 に 0.2% 0.3%の 濃 度 で 用 いられておる ほとんど 全 ての 細 菌 真 菌 芽 胞 ウイルスに 対 しグルタルアルデ ヒドと 同 等 かそれ 以 上 の 効 果 を 示 すが グルタルアルデヒドと 異 なり 人 体 に 対 する 影 響 が 少 ない 分 解 生 成 物 は 酢 酸 過 酸 化 水 素 で 過 酸 化 水 素 は 最 終 的 に 水 と 酸 素 に 分 解 されるた め 実 質 的 にほぼ 無 害 である また 過 酢 酸 は 炭 疽 菌 に 代 表 される 芽 胞 にも 有 効 であり グ ルタルアルデヒド ホルムアルデヒド 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 過 酸 化 水 素 とともに 世 界 保 13

15 健 機 関 (WHO)が 炭 疽 菌 の 消 毒 薬 として 推 奨 するもののひとつとなっている 表 5 ほうれん 草 の 湯 煎 によるマウスノロウイルスの 不 活 化 遺 伝 子 コピー 数 ほうれん 草 のペルオキ 感 染 価 (log 10 コピー 数 / 検 シダーゼ 活 性 (%) (log 10 PFU/ 検 体 ) 体 ) 未 処 理 100.8± ± ±0.40 湯 煎 (80 1 分 ) 65.2±16.1 < ±0.39 湯 煎 (90 1 分 ) 22.0±7.1 < ±0.29 Fino ら(15)は いちご 青 ネギ レタスに 付 着 する A 型 肝 炎 ウイルス アイチウイルス ネコカリシウイルスの 紫 外 線 による 不 活 化 を 検 討 した( 表 6) 240mWs/cm 2 の 照 射 で レタスで は 4.5~4.6log 10 青 ネギでは 2.5~5.6log 10 イチゴでは 1.9~2.6log 10 の 減 少 で レタスの 表 面 が 最 も 不 可 化 されやすく ストロベリーの 表 面 が 最 も 不 活 化 されにくかった あるいは 240mWs/cm 2 の 照 射 量 で 不 活 化 効 果 に 大 きな 違 いはなかった 表 6 食 表 面 に 付 着 させたウイルスの UV による 不 活 化 UV 照 射 量 (mws/cm 2 ) ウイルス 食 A 型 肝 炎 ウイルス レタス 4.29± ± ±0.00 A 型 肝 炎 ウイルス 青 ネギ 4.16± ± ±0.21 A 型 肝 炎 ウイルス イチゴ 1.28± ± ±0.73 アイチウイルス レタス 3.96± ± ±0.57 アイチウイルス 青 ネギ 2.35± ± ±0.35 アイチウイルス イチゴ 1.53± ± ±0.19 ネコカリシウイルス レタス 3.48± ± ±0.00 ネコカリシウイルス 青 ネギ 2.46± ± ±0.77 ネコカリシウイルス イチゴ 1.13± ± ±0.53 (5) 環 境 中 における 不 活 化 Hudson らは(16) ホテルの 室 内 船 室 事 務 室 の 様 々な 場 所 に 乾 燥 状 態 で 存 在 するウイル スの 不 活 化 方 法 として ネコカリシウイルスを 用 いてオゾンガスの 有 用 性 を 検 討 した 不 活 化 は オゾン 発 生 装 置 を 用 いてオゾンガスを 発 生 させ 濃 度 が 20-25ppm に 達 してから 20 分 間 その 濃 度 を 維 持 した 後 加 湿 器 を 5 分 間 作 動 させた その 後 オゾン 発 生 装 置 と 加 湿 器 を 止 め さらに 10 分 間 放 置 した 後 スクラバー( 除 ガス 装 置 )を 15 分 間 作 動 し オゾンガス を 除 去 させた ホテルにおいて バスルーム ベッド 机 の 上 に 置 かれたネコカリシウイル ス(プラスチック 上 で 乾 燥 させたウイルス)は 3.7log 10 以 上 の 減 少 を 示 した 船 室 のベッド 14

16 机 隣 接 するバスルームにおける 実 験 (オゾン 発 生 15 分 加 湿 4 分 放 置 なし 除 ガス 15 分 ) では 感 染 性 ウイルスは 検 出 されなかった( 以 上 の 減 少 ) プラスチック 以 外 に 布 (Fabric) 綿 織 物 (Cotton) カーペットに 塗 布 したウイルスを 用 いて 机 の 上 や 下 側 壁 窓 床 に 設 置 したウイルスの 不 活 化 を 行 った 結 果 いずれも 有 効 に 不 活 化 され オゾンガス による 室 内 に 乾 燥 状 態 で 残 留 するノロウイルスの 不 活 化 に 有 用 であることを 示 した Lee ら(9)は マウスノロウイルスを 用 いて 種 々の 環 境 での 生 存 性 を 調 べた ガーゼやおむ つの 中 で 18 または 30 では 1 日 で 3log 10 以 上 減 少 したが 4 では 30 日 で 2log 10 (ガーゼ) 40 日 で 2log 10 以 下 (おむつ)の 減 少 に 止 まり -20 では 2log 10 未 満 (ガーゼ) 1log 10 未 満 (お むつ)の 減 少 であった 糞 便 中 の 生 存 性 を 40 日 間 観 察 した 結 果 4 が 最 も 安 定 で 1log 10 未 満 の 減 少 -20 と 18 では 4log 10 の 減 少 で 30 では 24 時 間 で 5log 10 以 上 の 減 少 が 認 められ た 0.5M あるいは 1M の 塩 化 ナトリウム 存 在 下 で 72 時 間 後 にそれぞれ 1.5log log 10 の 減 少 を 認 めた 一 方 リアルタイム PCR では 定 量 値 の 減 少 はほとんど 観 察 されなかった Park ら(17)は ステンレスおよびセラミックタイル( 孔 あり)における 生 存 性 を MS2 ファー ジおよびノロウイルスを 用 いて 調 べた MS2 ファージの 感 染 価 はウイルス 液 接 種 後 3 時 間 の 乾 燥 で 約 2log 10 (ステンレス 2.5% セラミックタイル 1.1%) 減 少 後 25 2 日 間 でさらに 1.5log 10 減 少 したが MS2 ファージおよびノロウイルスの RT-PCR のコピー 数 は 接 種 ウイルス 量 と 比 較 して 24 時 間 後 までは 変 化 ぜず 2 日 後 に 1log 10 減 少 した Park ら(17)は 次 亜 塩 素 酸 (HOCl)を 電 気 化 学 的 に 発 生 させる 装 置 ( 図 参 照 )を 利 用 して 生 成 した 次 亜 塩 素 酸 による 不 活 化 を ヒトノロウイルスおよび 代 替 えウイルスとして MS2 ファー ジ マウスノロウイルスを 用 いて 検 討 した セラミックス 製 タイル( 孔 あり)とステンレス に 汚 染 させた 3 種 類 のウイルスは 20~200ppm の 次 亜 塩 素 酸 溶 液 の 10 分 ( 以 下 ) 間 の 作 用 で 感 染 価 およびウイルスコピー 数 ともに 少 なくても 3log 10 減 少 した(ヒトノロウイルスは 遺 伝 子 検 出 のみ 実 施 )( 表 7) 水 溶 液 中 では 20 秒 の 作 用 で 感 染 価 および 遺 伝 子 検 出 ともに 少 なくても 3log 10 減 少 した また 閉 鎖 室 内 に 霧 状 に 噴 霧 した 場 合 の 実 験 では 1% 糞 便 を 含 む 3 種 のウイルス 混 合 液 を 塗 布 し 乾 燥 させたセラミックタイルを 水 平 方 向 垂 直 方 向 に 設 置 し 180~200ppm の 遊 離 塩 素 を 1 時 間 噴 霧 させた その 結 果 感 染 価 では 3.5log 10 以 上 遺 伝 子 検 出 では 概 ね 5log 10 以 上 の 低 下 が 観 察 され( 表 8) 有 用 性 が 確 認 されたと 報 告 している aspx 15

17 表 7 次 亜 塩 素 酸 による 不 活 化 3log 10 以 上 の 減 少 に 必 要 な 作 用 時 間 ( 分 ) 遊 離 塩 素 濃 度 MS2 ファージ ヒトノロウイルス 感 染 価 RT-PCR RT-PCR 188ppm 1 1* ppm ppm *: 左 側 はセラミックタイル 右 側 はステンレスに 汚 染 させた 場 合 の 時 間 ( 分 ) 表 8 次 亜 塩 素 酸 溶 液 噴 霧 によるウイルスの 不 活 化 遺 伝 子 減 少 (log 10 PCR 単 位 ) 感 染 価 減 少 (log 10 PFU) 設 置 方 向 ヒトノロウイ マウスノロ マウスノロウ MS2 ファー MS2 ファージ ルス ウイルス イルス ジ 水 平 -1 >6 > >3.5 >4.0 水 平 -2 >6 >5.5 6 >3.5 >4.0 水 平 -3 >6 > >3.5 >4.0 水 平 -4 >6 >5.5 6 >3.5 >4.0 水 平 -5 >5.5 > >3.5 >4.0 垂 直 -1 >5.5 > >3.5 >4.0 垂 直 -2 >4.5 >5 5 >3.5 >4.0 垂 直 -3 >6 >5 6.5 >3.5 >4.0 垂 直 >3.5 >4.0 垂 直 -5 >4.5 > >3.5 >4.0 ( 参 考 ) 次 亜 塩 素 酸 次 亜 塩 素 酸 は 水 と 塩 化 ナトリウムから 電 気 化 学 的 に 生 成 される( 電 気 分 解 ) ph5~ph7 の 弱 酸 性 の 水 溶 液 で 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムのような 漂 白 作 用 腐 食 作 用 人 体 に 対 する 影 響 が ない 上 低 濃 度 で 高 い 殺 菌 効 果 を 持 つなどの 特 徴 を 持 つ Lages ら(18)はネコカリシウイルスを 用 いて 9 種 類 の 手 指 用 消 毒 剤 の 30 秒 あるいは 2 分 間 の 作 用 による 消 毒 効 果 を 比 較 した 99.5%のエタノールは 62%エタノール 70%あるいは 91%イソプロピルアルコールを 含 むエタノール 性 殺 菌 剤 (Sanitizer)と 比 較 して 効 果 的 であ った 表 (9) 10%ポピドンヨード(1%の 有 効 ヨードを 含 む)を 含 む 消 毒 剤 (Antiseptics)は 30 秒 の 作 用 で 2.67log 10 の 減 少 を 示 し いずれのエタノールに 基 づく 殺 菌 剤 (Sanitizer) 非 アルコールの 殺 菌 剤 および 抗 菌 性 (Antimicrobial) 石 鹸 と 比 較 して 高 い 不 活 化 効 果 を 示 した 16

18 トリクロサン 含 有 の 抗 菌 性 石 鹸 は 最 も 低 い 効 果 を 示 し 石 鹸 を 用 いない 手 洗 いと 同 様 の 結 果 であった これらのことから エタノール 含 有 の 手 指 用 消 毒 剤 及 びトリクロサン 含 有 抗 菌 用 石 鹸 ではノロウイルスの 予 防 に 不 十 分 であることを 示 した 表 9 手 洗 用 消 毒 剤 等 のネコカリシウイルスに 対 する 不 活 化 効 果 内 容 分 類 商 名 減 少 (log 10 ) 30 秒 2 分 99.5%エタノール ACS 試 薬 エタノール %エタノール 91%イソプロピルアルコー ル 70%イソプロピルアルコー ル Hand sanitizer Purell instant hand sanitizer Antiseptic 91%isopropyl alchol Antiseptic 3% 過 酸 化 水 素 ( 安 定 化 ) Antiseptic 0.13% 塩 化 ベンザルコニウ ム+2% 塩 酸 リドカイン 10%ポピドンヨード 0.60%トリクロサン 0.115%トリクロサン Antiseptic Antiseptic Hand soap Hand soap 70%isopropyl rubbing alchol HomeBest hydrogen peroxide topical Band Aid hurt-free antiseptic wash Swan topical antiseptic microbicide povidone-iodine solution, 10% Dial complete antibacterial foaming hand wash Softsoap hand soap antibacterial 水 道 水 による 手 洗 い ACS:American Chemical Society Belliot ら(19)は マウスノロウイルスを 用 いて 医 療 機 関 で 使 用 される 消 毒 薬 に 対 する 抵 抗 性 を 調 べた( 表 10) マウスノロウイルスは アルコール アルコールハンドラボ ブリー チ ポビドンヨードに 基 づく 消 毒 薬 に 感 受 性 を 示 した 表 10 マウスノロウイルスに 対 する 各 種 消 毒 剤 の 不 活 化 効 果 感 染 価 (log 10 ) 性 状 作 用 時 RNA コピー(log 10 ) 消 毒 剤 の 減 少 (% 減 ( 濃 度 商 名 ) 間 の 減 少 (% 減 少 ) 少 ) エタノール 60% 0.5 分 >4(99.99) 1.22± 17

19 0.23(93.97) エタノール 60% 1 分 >4(99.99) エタノール 60% 3 分 >4(99.99) エタノール 30% 0.5 分 0.11± 0.06(22.38) エタノール 30% 1 分 0.16± 0.20(30.82) エタノール 30% 3 分 0.29± 0.11(48.71) エタノール 10% 0.5 分 - エタノール 10% 1 分 - エタノール 10% 3 分 - イソプロパノール 60% 0.5 分 3.86(99.98) 1.08± 0.57(91.68) イソプロパノール 60% 1 分 >4(99.99) イソプロパノール 60% 3 分 >4(99.99) イソプロパノール 30% 0.5 分 0.63± 0.18(76.56) イソプロパノール 30% 1 分 0.78± 0.08(83.40) イソプロパノール 30% 3 分 1.62± 0.39(97.60) イソプロパノール 10% 0.5 分 - イソプロパノール 10% 1 分 0.08± 0.05(16.82) イソプロパノール 10% 3 分 0.06± 0.02(12.90) 塩 素 0.26% ブリー チ 0.5 分 >4(99.99) >4(99.99) 塩 素 0.26% ブリー チ 1 分 >4(99.99) 塩 素 0.26% ブリー チ 3 分 >4(99.99) ポビドンヨード 1% Betadine 0.5 分 >4(99.99) 0.41± 0.51(61.10) ポビドンヨード 1% Betadine 1 分 >4(99.99) ポビドンヨード 1% Betadine 3 分 >4(99.99) 18

20 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) 第 四 級 アンモニウム 塩 アルカリアミン( 非 イオ ン 系 界 面 活 性 剤 ) Asphene 分 0.75± 0.09(82.22) Asphene381 1 分 1.01± 0.01(90.23) Asphene381 3 分 0.96± 0.15(89.04) Asphene 分 0.59± 0.09(74.30) Asphene 分 0.35± 0.14(55.33) Asphene 分 0.55± 0.13(71.82) アルコールハンドラボ Steriium gel 0.5 分 >4(99.99) 0.30± 0.18(49.88) アルコールハンドラボ Steriium gel 1 分 >4(99.99) アルコールハンドラボ Steriium gel 3 分 >4(99.99) アルコールハンドラボ Aniosgel 85NPC 0.5 分 >4(99.99) アルコールハンドラボ Aniosgel 85NPC 1 分 >4(99.99) アルコールハンドラボ Aniosgel 85NPC 3 分 >4(99.99) アルコールハンドラボ Purell 0.5 分 1.85± 0.05(98.59) アルコールハンドラボ 2.07± Purell 1 分 0.11(99.15) アルコールハンドラボ 2.89± Purell 3 分 0.13(99.97) アルコールハンドラボ 2.26± Purell 15 分 0.09(99.45) アルコールハンドラボ 2.87± Purell 30 分 0.12(99.87) アルコールハンドラボ 0.63± Purell 60 分 >4(99.99) 0.19(76.56) 19

21 Macingara(20)は ポリクオータニウムポリマー( 四 級 アンモニウム 塩 のカチオン 系 ポリマ ー)と 有 機 酸 を 含 む 新 しいアルコール 性 の 手 指 消 毒 剤 の 有 効 性 を ヒトロタウイルス ポリオ ウイルス およびヒトノロウイルスの 代 替 えとしてネコカリシウイルスとマウスノロウイル ス 等 を 用 いて 調 べた( 表 11) 試 験 管 内 では それらのウイルスは 30 秒 の 作 用 で 3log 10 以 上 の 減 少 が 認 められたが fingerpad 法 ( 指 の 腹 部 : 爪 の 反 対 側 にウイルスを 接 種 し 有 効 性 判 定 を 行 う) 法 では 30 秒 の 作 用 でマウスノロウイルスで 2.48log 10 アデノウイルス ロタウイ ルスで 3log 10 以 上 ポリオウイルスで 2.98log 10 A 型 肝 炎 ウイルスで 1.32log 10 の 減 少 であっ た 表 11 新 規 エタノール 製 剤 による 各 種 ウイルスの 不 活 化 消 毒 剤 ウイルス 作 用 時 間 減 少 (log 10 ) 75%エタノール マウスノロウイルス 30 秒 0.91* 新 規 エタノール 製 剤 マウスノロウイルス 30 秒 2.48* 新 規 エタノール 製 剤 アデノウイルス 5 型 15 秒 3.16 新 規 エタノール 製 剤 アデノウイルス 5 型 30 秒 3.12 新 規 エタノール 製 剤 ロタウイルス 15 秒 4.32 新 規 エタノール 製 剤 ロタウイルス 30 秒 3.84 新 規 エタノール 製 剤 ポリオウイルス 1 型 30 秒 2.98 新 規 エタノール 製 剤 A 型 肝 炎 ウイルス 30 秒 1.32 *: 有 意 差 あり(<0.0001) (6) 高 圧 処 理 Buckow ら(21)は ネコカリシウイルスをモデルとして 高 圧 処 理 による 不 活 化 を 検 討 した 75 2 分 の 加 熱 及 び 450MPa 15 分 の 高 圧 処 理 の 結 果 に 基 づきパラメータを 設 定 し 500MPa までの 種 々の 圧 力 および 5 ~75 までの 温 度 での 不 活 化 条 件 を 明 らかにし 食 の 高 圧 処 理 による 不 活 化 の 有 用 性 を 報 告 した (7) 有 機 物 等 存 在 下 での 消 毒 剤 による 不 活 化 Poschetto ら(22)は 有 機 物 存 在 下 での 有 機 酸 アルデヒド ハロゲン 化 合 物 過 酸 化 物 の 不 活 化 について 調 べた 有 機 酸 (55-60%ギ 酸 7%グリオキシル 酸 含 有 ) アルデヒド (22-25%グルタールアルデヒド 12%オリゴマー 含 有 ) ハロゲン 化 合 物 (12% 次 亜 塩 素 酸 Na) 過 酸 化 物 (14-16% 過 酢 酸 22-24% 過 酸 化 水 素 <15% 酢 酸 )によるネコカリシウイルスの 不 活 化 は アルデヒドを 除 き 有 機 物 が 含 まれると 不 活 化 効 果 は 減 少 した( 表 (12) 20

22 表 12 ネコカリシウイルスの 各 種 薬 剤 の 不 活 化 効 果 3log 10 減 少 (>99.9%)に 必 要 な 濃 度 と 時 間 (FCV の 感 染 価 ) 蛋 白 なし 40% 牛 胎 児 血 清 含 有 25% 糞 便 含 有 有 機 酸 0.5% 15 分 4% 15 分 4% 15 分 アルデヒド 0.1% 15 分 0.1% 15 分 0.1% 15 分 ハロゲン 化 合 物 0.5% (4,500ppm) 15 分 0.5% (4,500ppm) 15 分 0.8% 15 分 過 酸 化 物 0.1% 15 分 0.1% 15 分 1% 60 分 また 25% 糞 便 存 在 下 での 不 活 化 効 果 を Nuanualsuwan ら(3)が 報 告 した 酵 素 処 理 を 用 いた RT-PCR 法 で 評 価 した 結 果 は 表 13 のとおりであるが 感 染 価 を 指 標 とした 場 合 と 比 較 し よ り 高 濃 度 あるいは 長 時 間 の 作 用 時 間 を 必 要 としており 実 際 にはより 低 濃 度 短 時 間 の 作 用 で 効 果 がある 考 察 している また ノロイルスはネコカリシウイルスと 比 較 して これらの 薬 剤 に 対 して 抵 抗 性 である 可 能 性 を 示 唆 している 表 13 25% 糞 便 存 在 下 での 各 種 薬 剤 の 不 活 化 効 果 ( 酵 素 処 理 -RT-PCR で 判 定 ) 減 少 必 要 な 濃 度 と 作 用 時 間 (log 10 ) ネコカリシウイルス ノロウイルス 有 機 酸 3 4.0% 30 分 5% 60 分 アルデヒド 2 0.5% 60 分 2.0% 60~120 分 ハロゲン 化 合 物 * 3 1%(6,000ppm) 15 分 1%(6,000ppm) 15 分 過 酸 化 物 3 1.0% 60 分 1.0% 60 分 2.0% 15 分 2.0% 60 分 *:ハロゲン 化 合 物 は 10% 糞 便 存 在 下 の 結 果 (25% 糞 便 では 1%(6,000ppm)あるいは 1.2% (7,000ppm)の 120 分 の 作 用 では 0~2log 10 の 減 少 IV 参 考 文 献 1 高 木 弘 隆 杉 山 和 良 ; ネコカリシウイルス(FCV)を 代 替 としたノロウイルス(NV) 不 活 性 化 効 果 の 検 討 -アルカリ 剤 過 酸 化 水 素 および 過 炭 酸 ナトリウムによる 不 活 性 化 効 果 -. 医 学 と 薬 学 : 57(3): , Jeanette, A et al; Inactivation of enteric adenovirus and feline calicivirus by chlorine dioxide, Appl Environ Microbiol; 31: , Nuanualsuwan S, Cliver DO. et al.: Pretreatment to avoid positive RT-PCR results with inactivated viruses. J Virol Methods; 104(2): ,

23 4 Baert L, Wobus CE, Van Coillie E, Thackray LB, Debevere J, Uyttendaele M et al.: Detection of murine norovirus 1 by using plaque assay, transfection assay, and real-time reverse transcription-pcr before and after heat exposure. Appl Environ Microbiol; 74(2): , Topping JR, Schnerr H, Haines J, Scott M, Carter MJ, Willcocks MM, Bellamy K, Brown DW, Gray JJ, Gallimore CI, Knight AI et al.: Temperature inactivation of Feline calicivirus vaccine strain FCV F-9 in comparison with human noroviruses using an RNA exposure assay and reverse transcribed quantitative real-time polymerase chain reaction-a novel method for predicting virus infectivity, J Virol Methods; 156(1-2):89-95, Lamhoujeb S, Fliss I, Ngazoa SE, Jean J et al.: Evaluation of the persistence of infectious human noroviruses on food surfaces by using real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl Environ Microbiol; 74(11): , Bae J, Schwab KJ et al.: Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater. Appl Environ Microbiol; 74(2): , Shin GA, Sobsey MD et al.: Inactivation of norovirus by chlorine disinfection of water. Water Res; 42(17): , Lee J, Zoh K, Ko G et al.: Inactivation and UV disinfection of murine norovirus with TiO2 under various environmental conditions. Appl Environ Microbiol; 74(7): , Butot S, Putallaz T, Sánchez G et al.: Effects of sanitation, freezing and frozen storage on enteric viruses in berries and herbs. Int J Food Microbiol; 126(1-2):30-35, Mattison K, Karthikeyan K, Abebe M, Malik N, Sattar SA, Farber JM, Bidawid S. et al.: Survival of calicivirus in foods and on surfaces: experiments with feline calicivirus as a surrogate for norovirus.. J Food Prot; 70(2): , Hewitt J, Greening GE et al.: Effect of heat treatment on hepatitis A virus and norovirus in New Zealand greenshell mussels (Perna canaliculus) by quantitative real-time reverse transcription PCR and cell culture. J Food Prot; 69(9): , Baert L, Uyttendaele M, Van Coillie E, Debevere J et al.: The reduction of murine norovirus 1, B. fragilis HSP40 infecting phage B40-8 and E. coli after a mild thermal pasteurization process of raspberry puree. Food Microbiol; 25(7): ,

24 14 Baert L, Uyttendaele M, Vermeersch M, Van Coillie E, Debevere J et al.: Survival and transfer of murine norovirus 1, a surrogate for human noroviruses, during the production process of deep-frozen onions and spinach. J Food Prot; 71(8): , Fino VR, Kniel KE et al.: UV light inactivation of hepatitis A virus, Aichi virus, and feline calicivirus on strawberries, green onions, and lettuce. J Food Prot; 71(5): , Hudson JB, Sharma M, Petric M et al.: Inactivation of Norovirus by ozone gas in conditions relevant to healthcare. J Hosp Infect; 66(1):40-45, Park GW, Boston DM, Kase JA, Sampson MN, Sobsey MD et al.: Evaluation of liquidand fog-based application of Sterilox hypochlorous acid solution for surface inactivation of human norovirus. Appl Environ Microbiol; 73(14): , Lages SL, Ramakrishnan MA, Goyal SM et al.: In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect; 68(2): , Belliot G, Lavaux A, Souihel D, Agnello D, Pothier P et al.: Use of murine norovirus as a surrogate to evaluate resistance of human norovirus to disinfectants. Appl Environ Microbiol; 74(10): , Macinga DR, Sattar SA, Jaykus LA, Arbogast JW et al.: Improved inactivation of nonenveloped enteric viruses and their surrogates by a novel alcohol-based hand sanitizer. Appl Environ Microbiol; 74(16): , Buckow R, Isbarn S, Knorr D, Heinz V, Lehmacher A et al.: Predictive model for inactivation of feline calicivirus, a norovirus surrogate, by heat and high hydrostatic pressure. Appl Environ Microbiol; 74(4): , Poschetto LF, Ike A, Papp T, Mohn U, Böhm R, Marschang RE et al.: Comparison of the sensitivities of noroviruses and feline calicivirus to chemical disinfection under field-like conditions. Appl Environ Microbiol; 73(17): ,

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