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ぜんまはぎにわ
7 years ago
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4 藤井酵素免疫測定法によるビテロジェニンの定量ラボラトリーズ μlを添加する時間振とル数に応じて算出する筆者は標識抗体としてう後上記同様 TBS-Tで回振とう洗沖し Gではなくビオチン標識 'を用酵素標識 I Lの基質溶液汁を添加する基質としてオルトフェいている I Gから抗原との結合に関与しない PD 和光純薬工業などを用ニレンジアミン領域を除いた 'を用いることにより非いる場合は暗箱に入れて時々発色状況を観察し特異結合を軽減させることができるまたピオパックグランドが発色し始めたら水道水で流水洗チン標識を施すことにより必要に応じて市販の浄して発色を止める筆者は本法で μ/ L以アビジンに結合した様々な酵素あるいは蛍光物質下の Vの発色が肉眼で確認出来ればなどの利用が可能となり応用範囲が格段に広がト分に抗体価が上がったと判断している L H v JW るさらに酵素よりも分子量が小さいピオチン D f f v 巴 I V f 巴I y f -v を標識することにより抗原抗体反応における立体障害を軽減する効果も期待できるビオチン標識 'は以下の方法で作製するまず精製した IGの一部を脱塩用カラムエコノノミック DGカラムノイオラッドラボラトリーズなどを用いて M 塩化ナトリウムを含む M酢酸ナトリウム緩衝液注8H4に溶媒交換し分画分子量 kdの限外ろ過ミリポアなどによって濃縮して / L前後に調整なお得られた抗血清が卵黄蛋白質前駆物質するここで用いる IG量は穴プレート枚卵抽出液と反応する雌特異蛋白質正常雄血を目安に計算するブタ胃由来ペプ当たり清や未熟雌血清とは反応しないが成熟雌血清と反シン和光純薬工業などを 4/ Lとなるよ E 処理応する及びエストロゲン誘導蛋白質う添加し穏やかに撹枠溶解して 7Cで "' 魚血清と反応するという Vの定義を満たす蛋時間消化する白質を特異的に認識することを確認しておく必要 kd と kd 及びペプシン kd がある抗血清の特異性はドットプロッテインを分離するため '" kdを分画範囲としてグ法でも大まかには調べられるが認識する蛋白 S HR / カバーするゲ /レろ過カラム質を確認するために卵抽出液正常雄血清成 GEヘルスケアバイオサイエンスなどで分熟雌血清ベフシン消化後 ' E処理魚血清精製 Vなどを試料としたウエスタンブロッティング法の実施を推奨す脱塩カラムで I G溶液を酢酸ナトリウム緩衝液に溶媒交換る同法は市販のゲルパジェノレ SPG-L アトーなど泳動装置ラピダスミニスラブ電気泳動装置アトーなどプロッティング装置ホライズブロットアトーなどを必要としブタ胃由来ペプシンを 4 j L添加撹祥それらの機器には丁寧な取扱説明書が添付されているのでここでの説明は省略するまたブロッテインク守膜のバンドの検出は上述のドットプロットでの検出法に準じ莫のサイズに合わせてスケー P B Sを用いたゲルろ過により ' を精製ノレアップすれば良い ' の倍量の B 7 N H Sを添加モル比で標識抗体の作製得られた抗血清から市販のプロテイン Aある ~4 時間穏やかに償枠いはプロテイン Gカラム HT P A あるいは HT P G HP GEへ/レスケアバイオサイエンスなどを用いカラムの取扱説明書に準じて I Gを精製する精製する I G量は穴プレート枚当たりを目安にしサンプ P f 合 fig ' ' w f - 4一一

ト分に抗体価が上がったと判断している L H v JW るさらに酵素よりも分子量が小さいピオチン D f f v 巴 I V f 巴I y f -v を標識することにより抗原抗体反応における立体障害を軽減する効果も期待できるビオチン標識 'は以下の方法で作製するまず精製した IGの一部を脱塩用カラムエコノノミック DGカラムノイオラッドラボラ

7 酵素免疫測定法によるピテロジェニンの定量藤井値と設定添加量との誤差は 78以下で濃度が / Lのとの吸光度に有意差は認められずそこ低下するに従い著しく増大した 74: :! : : はブランクの吸光度吸光度で ~ の範囲で求めた回帰式 8 4:! : : の平均値プラス標準偏差の倍 R= に各添加量の吸光度を当てはめるとかっブランクよりも有意に高い値を示したまた 7% 以下にまで低下した同範囲の誤差が ~ /L の範囲で R =の回帰式が得 8土 7A 同回帰式に各濃度の吸光度をられた 4 はブランクの吸光度 8土当てはめて得た計算値と設定濃度との誤差はの平均値プラス標準偏差の倍かっブランクよ 78/ L以下で著しく大きくなったまた最低量であるの吸光度目目 8 りも有意に高い値を示したさらに全ての試験区で変動係数は % 未満であったこれらの結の HRPでは果から今回用いた比活性4/ 口口 A胃 k U 凋仏誤差を % まで許容すればを境界として諒の広い範囲で酵素活性が測れることが明らかになった y= x - y= x -4 7 T L D L 以種類の回帰式を用いることにより ~ 8 マコガレイビテロジェニンの酵素免疫測定法筆者がマコガレイ Vのサンドイツチ法を検 Vを用い各濃度 4連で前述の① ⑬に従い吸光 / Lとブランク度を測定したその結果 I 4 一一一一一一一一 A ε 凶C凶 R二 y = x - ~ H R P R v f q y f x HRP y q A k 8 w * E =I v - v I v X 討した事例を紹介する ~ 8/L の精製コ = 一-吋よ 4 B y 二 x 凶巳円崖Z R二 B y= x - 7 R= 8 ー E ~ ' D > - 8 D4 R w q y f HR P y x y D f y f A 8 E f q : v f 8 D4 7S v f / L A / L B EL SA f v V E fq : : v f - 7一一

L以下で著しく大きくなったまた最低量であるの吸光度目目 8 りも有意に高い値を示したさらに全ての試験区で変動係数は % 未満であったこれらの結の HRPでは果から今回用いた比活性4/ 口口 A胃 k U 凋仏誤差を % まで許容すればを境界として諒の広い範囲で酵素活性が測れることが明らかになった y= x - y= x -4 7 T

8 藤井:酵素免疫測定法によるビテロジェニンの定量そこで ~ /L の範囲で求めた回帰式濃度を計算する必要がある 7 B R= 8 に各濃度の吸光度を当ては本稿で例示した酵素 HRP と発色基質めた結果同濃度範囲の誤差が %未満に減少し PD の組み合わせでは他の実験条件にもよ 8 各濃度区の変動係数は / L た / Lオーダー以下の定量下限値が期待できるがを除き全て % 未満であったこれらの結果かるさらなる高感度化の工夫が種々報告されてい / Lを境界として種類の回帰式を用らるが河野石川いることにより Av A k P C j タカラ ~ /L の範囲で Y がバイオなどを変えた発色法あるいは同じ HRP 定量できることが明らかになったでも発光基質酵素 C IP① おわりに S S ① ELTSA S タカラバイオなど C EUSAにおける各反応は反応時間温度抗に変更することなどによっても高感度化が期待原や抗体の質や量などによって影響を受ける従っできるまた酵素の代わりにランタノイドを標て新しい ELISAの系を確立するためには識した市販のアビジン DELIA E I 酵素免疫測定法で示したこれらの条件を参考と v パーキンエノレマージャパンを用いして独自に最適条件を見つけ出す必要があるることによりパックグランドの低い蛍光検出法なお抗原抗体反応時の温度については抗体産である時間分解蛍光免疫測定法への変更も可能で生に用いたウサギの体温に近い C前後が至適温ある藤井らしかし発光法や度と考えられインキュベーターなどで温めると蛍光法は発色法よりも高価な試薬や検出機器を時間短縮が期待できるしかしながら加温する必要とするのでそれらも総合的に勘案して目的とプレートに温度差を生じて縁辺部の試料穴ほどに合った方法を選択することが重要である値が高くなるいわゆるエッジ効果が現れる場合がある従って急激な温度変化のない室温で反解説応させる方がより安定した結果を得ることがで注採血 :供試魚を飼育水で希釈した麻酔液きるなお気温が低い場合は空調により室温オイゲノーノレの場合は ~ 倍希釈にをC以上に保つことが望ましいまた冷蔵保浸潰して十分に麻酔を施した後濡れたタオルな存した溶液をすぐに使うとピペッティング誤差どを巻いて魚体を固定する尾柄部を露出させの原因となるため必要量だけ取り出して時間体高の最も狭まった部分付近の腹側から注射針をほど放置し室温に戻してから使用する必要があ挿入し斜め前方に穿刺する鱗が邪魔な場合はるピペッティングは一定の順番とリズムで行ピンセットなどで取り除くか鱗の隙聞から穿刺うことを心がけ試料穴聞の反応時間を出来るだする針先が脊椎骨に当たる感触が確認できたらけ均等にするさらには常に標準液 Y濃度ピストンをゆっくりヲして採血する注射器テ既知の血清の希釈系列でも可を試料とともに測ルモやニフロなどのサイズは必要とする血液定しその都度求めた回帰式によって試料の Y 量や魚の大きさによって異なるが最大採血量が魚体重の約 7 日 * 8 % 魚種によって多少異なるであることを目安に選択するとよい注射針も魚の y= x- 4 8 口 y= x- 7 大きさなどによって G~ 8G 内径 ~ 8 η の範囲で選択されることが多い供試魚が極めてぞ小さくて注射器採血が困難な場合は尾柄部を切と4 断し出血箇所にへマトクリット管を当てることにより毛細管現象によって採血できるまた高 7 8 V / L 濃度の E 曝露によって腹水が貯まる場合には注射器で採水するか開腹して PMSやアプロチ 8 R v f v 旬巴 y閃右芯 ω お引叩 q 日川 7 A k 川附 I η 川 78 w 巾叩 * E = v - v : v X 責して回収し Y ニンを含む氷冷した TBSに浸精製用の材料とすることができる j 主 K I U: K k I U カリクレイン阻害活性の略 KIUは H8 室温 - 8- 時

EUSAにおける各反応は反応時間温度抗に変更することなどによっても高感度化が期待原や抗体の質や量などによって影響を受ける従っできるまた酵素の代わりにランタノイドを標て新しい ELISAの系を確立するためには識した市販のアビジン DELIA E I 酵素免疫測定法で示したこれらの条件を参考と v パーキンエノレマージャパンを用いして

パナテスト　ラットβ2マイクログロブリン

パナテスト　ラットβ2マイクログロブリン研究用試薬 2014 年 4 月作成 EIA 法ラット β 2 マイクログロブリン測定キット PRH111 パナテスト A シリーズラット β 2- マイクロクロフリン 1. はじめに β 2 - マイクログロブリンは, 血液, 尿, および体液中に存在し, ヒトでは腎糸球体障害, 自己免疫疾患, 悪性腫瘍, 肝疾患などによって血中濃度が変化するといわれています. また,β 2 - マイクログロブリンの尿中濃度は,