PCR実験の手引き

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1 PCR 実 験 の 手 引 き PCR はごく 微 量 の DNA を 出 発 材 料 として 高 感 度 の 検 出 を 短 時 間 で 行 うことができる 技 術 です その 応 用 分 野 は 広 く 分 子 生 物 学 の 基 盤 技 術 として 利 用 されている 他 食 品 環 境 分 野 における 遺 伝 子 検 査 や 法 医 学 分 野 における DNA 鑑 定 にも 応 用 されつつあり 今 後 もさらに 広 範 な 分 野 で 活 用 されると 期 待 されます PCR の 実 験 操 作 は 決 して 難 しいものではありませんが PCR で 正 しい 結 果 を 得 るためには その 原 理 や 留 意 点 について 理 解 しておく 必 要 があります 本 冊 子 では PCR の 原 理 や 基 礎 知 識 とともに 実 際 に 実 験 を 行 う 際 のポイントについて 解 説 します 目 次 はじめに 3 < 理 論 編 > 1.DNA とは? 4 2.PCR の 原 理 6 3.PCR 反 応 について 7 4.アガロースゲル 電 気 泳 動 について 9 5.PCR 酵 素 について 14 < 実 践 編 > 1.PCR 反 応 系 の 構 築 16 2.PCR 反 応 19 3.アガロースゲル 電 気 泳 動 24 4.PCR 結 果 の 判 定 実 験 環 境 の 整 備 29 関 連 製 品 32

2 2 PCR 実 験 の 手 引 き

3 PCR 実験の手引き はじめに PCR とは PCR は Polymerase Chain Reaction ポリメラーゼ連鎖反応 の頭文字を取った用語で ごく微量 の DNA を出発材料として 高感度の検出を短時間で行うことができる技術です この方法を用いるこ とにより DNA の特定の領域を数時間で 100 万倍に増幅することが可能です PCR Polymerase Chain Reaction ポリメラーゼ連鎖反応 DNAの特定の領域を数時間で100万倍に増幅する方法 PCR の用途 PCR は 汎用性の高い技術であり さまざまな分野で活用されています 例えば 分子生物学の分野 では未知 既知の DNA クローニングや塩基配列の決定(サイクルシーケンス)に使用したり 医療分野 で癌やエイズなどの研究 診断 食品分野での微生物検査 遺伝子組み換え作物の検定 米 肉の品 種鑑定 法医学分野での親子鑑定 犯罪捜査に用いるなど 多くの例が挙げられます また 近年では PCR 反応中の増幅産物をリアルタイムでモニタリングするリアルタイム PCR が広く 使われるようになり サンプル中に標的となる DNA が存在するかしないかという定性分析の他に mrna や mirna の定量解析も行えるようになっています PCR : ごく微量のDNAを出発材料として 高感度の検出を短時間で行うことができる 定性解析 分子生物学 未知 既知のDNAのクローニング 構造 機能解析 塩基配列の決定 サイクルシーケンス) 医療分野 癌やエイズなどの研究 診断 法医学分野 親子鑑定 犯罪捜査 定性解析 食品分野 微生物検査 遺伝子組換え作物の検定 米 肉の検査 広い分野で使用 されている技術 定量解析 PCR反応中の増 幅産物をモニタ リングするリア ルタイムPCR (qpcr) mrna発現解析 mirna解析など 3

4 PCR 実験の手引き 理論編 １ DNA とは DNA とは DNA デオキシリボ核酸 Deoxyribonucleic acid は 遺伝子情報を担う物質です DNA は細胞内の核に存在しています 核の中には染色体があり その染色体の中に DNA があります DNA は デオキシリボースという糖と リン酸と塩基から構成されており 塩基にはアデニン(A) グ アニン(G) チミン(T) シトシン(C)の 4 つの種類があります この塩基は下図に示すように A と T G とＣがそれぞれ水素結合した相補的結合をしており 二重らせん構造を取っています DNA : デオキシリボ核酸 (Deoxyribonucleic acid) 遺伝子情報を担う物質 核 染色体 DNA 細胞 デオキシリボース(糖)とリン酸と塩基か ら構成されている 塩基 はアデニン (A) グアニン(G) チ ミン(T) シトシン (C)の4種類で 必ず AとT, ＧとCが水素結合した(相補的結合) 二重らせん構造となっている T C T A C G A A G A T G C T DNA の構造と方向性 DNA は 前述の通りデオキシリボースとリン酸と塩基から構成されており デオキシリボースの 1 位に塩基が 位にリン酸が結合したものがヌクレオチドと呼ばれる DNA の最小単位です DNA が DNA 合成酵素 DNA ポリメラーゼ により複製される際には デオキシリボースの 位の水酸基にヌクレ オチドのリン酸基を結合させることで DNA を伸長させていきます すなわち 位から 位の方向 に DNA は伸長していきます このように DNA には方向性があり 二本鎖を形成した DNA は 下図のように と の方向性を示 した模式図で表されます CH2 塩基 O DNAには方向性があり DNAの複製を行う酵素で あるDNAポリメラーゼは デオキシリボースの 位の水酸基にヌクレオチドのリン酸基を結合させ ることでDNAを伸長させる O 水酸基 HO P O O リン酸基 CH2 O 4 塩基 O 二本鎖のDNAはこのようにあらわさ れることが多い

5 PCR 実験の手引き DNA の合成 細胞が分裂する際には DNA が複製することで情報を伝達していきます PCR はこの DNA 複製の仕組 みを利用しています DNA 複製の際には まず DNA ヘリカーゼという酵素によって DNA の二重らせん構造が巻き戻され 一 本鎖 DNA 結合タンパク質が結合することにより 一本鎖 DNA が安定化します 次に プライマーゼと いう酵素により プライマーとして働く短い RNA が合成され このプライマーをとっかかりにして DNA ポリメラーゼという酵素が働き DNA が合成されていきます DNA 合成は 片側の鎖の塩基配列に従い A に対しては T G に対しては C と 相補的な塩基配列と なるように dntp(デオキシリボヌクレオチド三リン酸)を結合していきます 以上の反応により 1 つの DNA からまったく同じ二つの DNA が合成されます 細胞が分裂する際 DNAは 複製 により情報を伝達し ていく PCRはこの仕組みを利用している DNAヘリカーゼ 一本鎖DNA結合 タンパク質 ポリメラーゼ プライマーゼ 複製方向 RNAプライマー DNAの複製とそれに関与するタンパク質 左図のDNA複製においては 1. DNAヘリカーゼにより DNAの二重らせん構造の 巻き戻し 2. 一本鎖DNA結合タンパク質との結合による一本鎖 DNAの安定化 3. プライマーゼにより プライマーとして働く短鎖 のRNAが合成 4. プライマーをとっかかりとしてDNAポリメラーゼ が働きDNAが合成 5. DNA合成は 片側の鎖の塩基配列に従い 相補的 な塩基配列となるようにdNTPを結合 6. これにより一つのDNAからまったく同じ二つの DNAが合成される DNA 複製の過程を PCR に当てはめると 細胞内での DNA ヘリカーゼによる DNA の二重らせん構造の巻 き戻し 一本鎖 DNA 結合タンパク質との結合による一本鎖 DNA の安定化の部分は PCR では熱変性によ り二本鎖 DNA を一本鎖にし 熱により安定化するステップに対応します 次の 細胞内でのプライマーゼによる短鎖 RNA 合成の部分は PCR では人工合成した一本鎖 DNA であ るプライマーを目的の鋳型 DNA に結合させるステップに対応します 最後に 細胞内でプライマーをとっかかりとして DNA ポリメラーゼが働き相補的な DNA が合成され る部分は PCR では鋳型 DNA に結合したプライマーから DNA ポリメラーゼによる伸長反応で DNA が合成 されるステップに対応します 細胞内 1. DNAヘリカーゼにより DNAの二重らせん 構造の巻き戻し 2. 一本鎖DNA結合タンパク質との結合による 一本鎖DNAの安定化 3. プライマーゼにより プライマーとして働く 短鎖のRNAが合成 4. プライマーをとっかかりとしてDNAポリメ ラーゼが働きDNAが合成 5. DNA合成は 片側の鎖の塩基配列に従い 相補的な塩基配列となるようにdNTPを結合 PCR 熱変性により二本鎖DNAを 一本鎖にし 熱により安定化 人工合成した一本鎖DNAであ るプライマーを 反応液を冷 却して目的の鋳型DNAに結合 DNAポリメラーゼにより 鋳 型DNAに結合したプライマー の末端より伸長反応 鋳型 となる一本鎖DNAに相補的な 塩基配列が複製 5

6 PCR 実験の手引き ２ PCR の原理 ① まず 増幅を行いたい領域を設定し プライマーを設計します プライマーは増幅を行いたい領 域を挟むようにペアで設計します プライマー プライマー 増幅を行いたい領域 ② ステップ 1 では 鋳型となる二本鎖 DNA を熱変性させて一本鎖 DNA に解離させます DNA は塩基 間の水素結合により二本鎖になっていますが 94 から 98 に温度を上昇させると その塩基間 の水素結合が切断され 二本鎖 DNA が一本鎖に解離します 94 ~98 に温度を上昇させる と 塩基間の水素結合が切断され 二本鎖DNAが一本鎖に解離する ③ ステップ 2 では 一本鎖になった DNA にプライマーを結合させます 温度を 50 から 65 に下げ ると 一本鎖になった DNA は再び二本鎖に戻ろうとしますが 反応液に加えてあるプライマーは 元の DNA よりも短く 量も多いため 元の DNA が二本鎖に戻るよりも優先して鋳型の DNA に結合 します この時 塩基の A-T, G-C の相補性により 特定の位置にプライマーは結合します プライマー 50 ~65 A-T, G-Cの相補性により特定の位置 にプライマーが結合する ④ プライマーは 元のDNA よりも短く 添加量も多 いため 元のDNAが二本 鎖に戻るよりも優先して 元のDNAに結合する ステップ 3 では DNA ポリメラーゼによって プライマーから元の DNA の相補鎖が合成されます 6

7 PCR 実験の手引き 温度を DNA ポリメラーゼの至適温度まで上昇させると DNA ポリメラーゼによる合成反応が開始さ れます 68 ~72 DNAポリメラーゼにより元のDNAの塩 基配列を基にして相補鎖が合成される ⑤ DNA合成酵素は 方向にのみ合 成を行う 以上の３ステップの反応を繰り返し行うことにより理論的には n 回で 2 の n 乗倍に目的の領域が 増幅されます こうして DNA が数時間で 100 万倍に増幅されます n回繰り返すと 2 n倍で目的の領域 が増幅される DNAが数時間で 100万倍に増幅!! ３ PCR 反応について １ PCR サイクルの各ステップについて 熱変性 通常 サンプルに含まれる鋳型 DNA は二本鎖 DNA であり そのままでは DNA 伸長反応に用いること はできません そこで 熱で一本鎖 DNA に解離(変性)してからサイクルを進めます これが十分でな いと増幅効率が低下し 逆に温度が高すぎたり 長すぎたりすると 酵素の失活を早めることになり ます ゲノム DNA を鋳型とする場合は 初期熱変性を完全に行うため時間を長めに設定します(95, 1 3 分) なお サイクル中の熱変性は増幅産物の解離が目的であるため 1 30 秒程度で十分です 7

8 PCR 実 験 の 手 引 き アニーリング 変 性 した 鋳 型 にプライマーが 結 合 するステップです アニーリング 温 度 はプライマーの 配 列 に 依 存 し 反 応 の 至 適 化 において 重 要 なポイントとなります 温 度 設 定 が 高 かったり 時 間 が 短 かったりす るとアニーリングが 不 十 分 になり 増 幅 効 率 が 低 下 しますが 温 度 を 低 くしすぎると 非 特 異 的 な 増 幅 が 増 加 します 通 常 はプライマーの Tm 値 ±5 の 範 囲 で 設 定 します Tm 値 ( 近 似 値 )はプライマーを 構 成 する 塩 基 配 列 から 算 出 することができます Tm 値 : 二 本 鎖 DNA の 50%が 解 離 して 一 本 鎖 となる 温 度 伸 長 反 応 使 用 する 耐 熱 性 DNA ポリメラーゼの 性 質 反 応 条 件 鋳 型 DNA の 性 質 により 伸 長 反 応 時 間 を 変 えま す 1kbp あたり 1 分 設 定 というのがよく 使 われますが 反 応 性 の 高 い 酵 素 であれば 伸 長 時 間 を 短 くす ることも 可 能 です サイクル 数 通 常 は 25 サイクルから 40 サイクルに 設 定 します サイクルを 繰 り 返 すにつれて DNA ポリメラーゼ の 活 性 の 低 下 反 応 基 質 (dntp, プライマー)の 減 少 枯 渇 反 応 副 産 物 の 蓄 積 による 合 成 反 応 の 阻 害 増 幅 した DNA 鎖 同 士 の 再 会 合 によるプライミング 効 率 の 低 下 などの 原 因 で 反 応 がそれ 以 上 進 まなく なります また 必 要 以 上 のサイクル 数 の 反 応 を 行 うと 非 特 異 的 な 増 幅 を 生 じる 場 合 があります 2)PCR に 必 要 な 構 成 物 プライマー 鋳 型 DNA に 相 補 的 な 塩 基 配 列 を 持 つ 合 成 オリゴヌクレオチド ( 短 い 一 本 鎖 DNA) 増 幅 したい 領 域 を 挟 むように 2 か 所 に 設 計 します バッファー DNA ポリメラーゼが 最 適 な 環 境 で 働 くことができるよう ph や 塩 濃 度 を 整 えるために 使 用 メーカー ごとに 反 応 特 性 を 改 善 するための 工 夫 がなされています Mg 耐 熱 性 DNA ポリメラーゼが 働 くために 必 要 となります キットや 酵 素 に 付 属 している buffer に 適 切 な 濃 度 となるように 加 えられています dntp (deoxyribonucleotide -triphosphate) DNA を 合 成 するために 必 要 な 原 料 datp, dgtp, dctp, dttp の 4 種 類 からなる 混 合 物 で キットや 酵 素 に 添 付 されています あるいは バッファーや Mg とともに 反 応 用 の 混 合 物 として 適 切 な 濃 度 で 混 合 されていることもあります 8

9 PCR 実験の手引き ４ アガロースゲル電気泳動について １ アガロースゲル電気泳動の原理 寒天の主成分であるアガロースを使用した電気泳動により 核酸 DNA をその大きさに応じて分離 する方法です PCR が終了したのち 反応産物が目的のものであるかどうかを確認するために行います アガロースは二種類の糖が結合しあって網目状の構造をとっており その網目を DNA が動いていく 際に 大きな DNA は網目に引っかかりながら移動するため移動速度が遅く 小さな DNA は網目に引っ かかりにくいため移動速度が速いという性質を利用することで DNA を長さによって分離することがで きます DNA は水溶液中ではマイナスの電荷を帯びているため 電場におかれるとプラス極側に移動し ます 色素マーカー (泳動のためのローディングバッファー に含まれている DNAではない) 電流の方向 プラス極 マイナス極 DNAが流れる方向 電気泳動 バッファー (TAE buffer) ２ アガロースゲル電気泳動の用途 PCR 増幅産物の確認法 PCR 増幅産物のサイズの確認 プライマー設計で想定した大きさの増幅断片が得られていることをアガロースゲル電気泳動で確認 します PCR の反応液の一部を泳動の目安となる色素を含み 比重を高めるためのローディングバッフ ァーと混合し アガロースゲルのウェル 窪み)にアプライします 電気泳動を行った後 エチジウム ブロマイドなどで染色を行うと UV トランスイルミネーター上で DNA が確認できますので 写真撮影を 行います 増幅断片の大きさは 同時に泳動するサイズマーカーより確認します 反応産物 マーカー マーカー 電気泳動 想定サイズの フラグメント 反応液 電気泳動後エチジウムブロマイド などで染色 UVトランスイルミ ネーター上で確認 写真撮影など 9

10 PCR 実験の手引き 制限酵素サイトの有無とその位置の確認 PCR 増幅産物のサイズだけでなく 増幅フラグメントに含まれる制限酵素サイトの有無を確認するこ とで より確実に目的の増幅断片が得られていることを確認することができます PCR 増幅断片中に制限酵素サイトがある場合 それを利用します 以下の模式図では PCR 増幅産物 中に制限酵素 X で認識されるサイトが存在します PCR の後 反応液を精製し その制限酵素 X で増幅 フラグメントを消化した後 電気泳動を行うと 目的の増幅断片が得られている場合は想定される大 きさに切断されたフラグメントが確認されます 制限酵素 X認識サイト 制限酵素X 未処理 処理 プライマー #1 プライマー #2 電気泳動 PCR 精製 制限酵素Xに よる消化 反応液 マーカー マーカー 反応液の一部をローディングバッ ファーと混和し アガロースゲル のウェル(窪み)にアプライする 補足 塩基配列の決定 PCR 増幅産物の塩基配列を決定して 目的の産物が得られていることを確認することもできます 増幅産物を精製したのち PCR に使用したプライマーでシーケンス解析を行うと 増幅産物の塩基配列 がわかりますので その配列より目的の増幅産物であることを確認できます ただし 非特異増幅が あると下図のようなきれいなピークにならず 複数のピークが混在する結果となり 塩基配列は確認 できません 精製 反応液 増幅産物を回収 DNAシーケンサーによる 塩基配列解析 ３ アガロースの種類と使い分け アガロースゲル作製法による分類 各種アガロースゲルをバッファーに溶解しゲルメーカーで作製 Agarose L03 (製品コード 5003) Prime Agarose LE 1-20K(製品コード 5800A) Prime Agarose PCR-Sieve (製品コード 5810A)など 10

11 PCR 実 験 の 手 引 き アガロース 用 途 一 覧 電 気 泳 動 用 のアガロースとしてさまざまな 種 類 のものが 市 販 されています PCR 増 幅 サイズや 実 験 目 的 に 適 したものを 選 択 して 使 用 します 例 えば 電 気 泳 動 後 のゲルから DNA を 回 収 する 際 には 高 純 度 なアガロースを 使 用 します PrimeGel Agarose LE 1-20K PrimeGel Agarose LE 1-20K GAT PrimeGel Agarose GOLD 3-40K PrimeGel Agarose LMT 1-20K PrimeGel Agarose LMT 1-20K GAT PrimeGel Agarose PCR-Sieve PrimeGel Agarose PCR-Sie ve HRS PrimeGel Agarose LMT PCR-Sieve GAT 使 用 濃 度 0.6~2% 0.6~2% 0.3~ 1.8% 0.75~1.5% 0.75~1.5% 2~5% 1.8~5% 2~5% 核 酸 分 離 範 囲 200 bp ~20 kb 200 bp~ 20 kb 500 bp ~40 kb 200 bp~ 20 kb 200 bp~ 20 kb 20 bp~ 1,500 bp 10~ 1,200 bp 10~1,500 bp GAT グレード *1 低 融 点 (LMT) DNA 回 収 ブロッティング パルスフィール ド 電 気 泳 動 高 移 動 度 高 分 離 能 In-G el 反 応 制 限 酵 素 処 理 ライゲー ション PCR タンパク 質 泳 動 *1 GAT:Genetic Application Tested 遺 伝 子 工 学 実 験 用 の 高 品 質 保 証 タイプ 11

12 PCR 実 験 の 手 引 き アガロースの 分 離 能 アガロースの 種 類 やゲル 濃 度 によって DNA サイズの 分 離 能 が 異 なります 目 的 の PCR 増 幅 サイズに 合 ったものを 選 択 して 使 用 します 1 kb 以 上 の 核 酸 電 気 泳 動 PrimeGel Agarose LE 1-20K LE 1-20K GAT PrimeGel Agarose GOLD 3-40K PrimeGel Agarose LMT 1-20K LMT 1-20K GAT( 低 融 点 タイプ) 12

13 PCR 実 験 の 手 引 き 1 kb 以 下 の 核 酸 電 気 泳 動 PrimeGel Agarose PCR-Sieve 13

14 PCR 実験の手引き ５ PCR 酵素について １ PolⅠ型とα型 市販の PCR 用の DNA ポリメラーゼは下表のように 2 種に大別されます PolI 型の酵素は 高熱性真正細菌由来のもので -exonuclease 活性を持っています この酵 素による PCR 産物は 末端に da を付加する特性があります 製品としては Taq シリーズ EmeraldAmp などがあります α型の酵素は 超高熱性古細菌由来のもので -exonuclease 活性を持っています この酵素 による PCR 産物は 末端は平滑になっています 製品としては PrimeSTAR シリーズ Tks Gflex などが あります -exonuclease は 核酸を鎖の 末端から 末端の方向に加水分解する酵素です -exonuclease は 核酸を鎖の 末端から 末端の方向に加水分解する酵素です PCR酵素のタイプ Pol Ｉ 型(family A) α型 (family B) 由来 高熱性真正細菌 超高熱性古細菌 - exonuclease活性 - exonuclease活性 増幅産物の末端形状 da付加 平滑 製品例 Taqシリーズなど PrimeSTAR シリーズ Tks GflexTMなど ２ α型酵素の校正活性 DNA ポリメラーゼは 側から 側に DNA を合成していきますが 稀に誤った塩基を取り込むこと があります -exonuclease 活性を有するα型酵素では その活性によって誤って取り込まれた 塩基が削り取られ 正しい塩基が取り込まれて伸長反応が再開されます 従って α型酵素は DNA 合成における正確性が -exonuclease 活性を持たない Pol I 型酵素に比べて格段に高いという特 性があります PCR を使用してクローニングを行うといった場合には α型酵素の使用がお勧めです DNAポリメラーゼは DNAを側から側 に合成するが 稀に誤った塩基が取り込ま れることがある - exonuclease活性を有するα型酵素で は 誤って取り込まれた塩基が削り取られ 正しい塩基が取り込まれて伸長反応が再開 される DNA合成における正確性は - exonuclease活性を持たないpol I型酵素に 比べて格段に高くなる 14

15 PCR 実験の手引き ３ Hot Start PCR 法 Hot Start 法とは PCR において サイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する 非特異増幅を防ぎ 目的断片の増幅効率を高める方法です この方法では 抗 DNA ポリメラーゼ抗体 を結合させたり 化学修飾を行うことで DNA ポリメラーゼ活性を抑制させた状態の酵素を使用します この状態では DNA ポリメラーゼ活性が抑制されていますので PCR 反応前の非特異的な反応が抑えら れており 最初の PCR 反応時に温度が上昇することで 抗体が変性して酵素から外れたり 化学修飾 が外れることにより DNA ポリメラーゼの活性が回復し 特異性の高い PCR が進むようになります 活性型 DNAポリメラーゼ DNAポリメラーゼ 不活性型 DNAポリメラーゼ抗体 変性 DNAポリメラーゼ抗体 DNAポリメラーゼ抗体がDNAポリメ ラーゼと結合し 常温時におけるポリメ ラーゼ活性が抑制 PCR反応前の非特異 的な反応が抑えられている 15

16 PCR 実験の手引き 実践編 １ PCR 反応系の構築 このステップの操作フロー このステップでは まず塩基配列情報を入手して プライマーを設計します 設計したプライマー は 合成後 使用に適した濃度に溶解して保存します プライマー設計に使用する便利なツールな ども併せてご紹介します 1. 塩基配列情報等の入手 2. プライマーの設計 3. プライマーの合成と保存 １ 塩基配列情報の入手 塩基配列情報の入手方法 PCR を行う場合は ターゲットとなる塩基配列情報が必要になります 塩基配列情報が明らかな場合 は その情報を基にして増幅したい領域 プライマーを設計したい範囲を決めます 配列情報が手元 にない場合は GenBank や DDBJ などのデータベース等より周辺配列を含む配列をダウンロードしたり 過去に同様な実験が行われている場合は 論文を入手してその情報を参考にしたりします 遺伝子情報データベース いくつかの遺伝子情報データベースが公開されており これらを利用して配列情報を入手すること ができます NCBI は アメリカの国立研究センターが管理するバイオテクノロジーに関する情報を収 集したデータベース管理サイトです 通常 遺伝子配列が決定されると ここに登録されます NCBI のデータベースを利用する際には NCBI の web page にアクセスし 簡易検索バーに目的の遺 伝子配列の遺伝子名を入力して検索を行います 遺伝子情報のデータベースの利用 NCBI 米国の国立研究センターが管理する バイオテクノロジーに関する情報を収集した データベース管理サイト NCBI 16 検索 検索バー

17 PCR 実験の手引き ２ プライマー設計 プライマー設計のポイント PCR では プライマーの設計が非常に大切です プライマーの配列は 増幅効率や感度 特異性など の反応の成否を決定する重要な要因となるためです プライマーの設計にあたっては 目的とする場 所以外の鋳型 DNA に結合せず 増幅したい鋳型 DNA の配列に効率よく結合することがポイントになり ます 特異性の高いプライマー設計のために プライマーの長さは 20mer 前後に mer は重合体を構成する単位分子の数を示す時に使用する表現で dntp が 20 個繋がったものと いう意味です 高速な PCR や長いターゲットを増幅するための場合は長めにすると良いですが 長くしすぎるとアニーリング効率が低下します プライマー末端の相補性に注意 プライマー間やプライマー内で 側に相補性を持たないようにします プライマー同士でアニ ーリングをしてプライマーダイマーを形成したりして 目的のターゲットの増幅効率に影響す ることがあります GTCA CAGT GTCA CAGT CAGT GTCA CAGT 末端配列の相補性 プライマーダイマーの形成 GTCA 末端の T は避ける ミスマッチが起こりやすい傾向があるため 末端の T は避けます プライマー内の二次構造に注意 プライマー内で二次構造を取ると プライマーの利用効率が低下するため それを避けるように します GTCA TGAC GTCA CAGT GC 含量 プライマーの GC 含量は 40 60%くらいにします 塩基の偏りに注意 プライマーを構成する塩基(G,A,T,C)がランダムに分布し 部分的に GC リッチ AT リッチになる のは避けるようにします Tm 値 プライマーの Tm 値は くらいになるようにし ペアとなるプライマーは互いに Tm 値の近 いものを選ぶようにします Tm 値 Tm 値とは melting temperature を意味しており 融解温度と訳されます DNA においては 二本鎖 DNA の半分が変性し 一本鎖 DNA の状態になる温度のことをいいます プライマーで得られた値は PCR のアニーリング温度を設定する際の参考になります 17

18 PCR 実験の手引き Tm 値の予測値は下記の式で求めることができます これ以外に nearest neighbor 法を用いると実際 の値に近い Tm 値が求められます ただし これらの計算値は予測値ですので 実際の Tm 値とは相違 があるということは認識しておいてください Tm ( ) = (GC %)-(500/n) Tm ( ) = 4 (G+C)+2 (A+T)+35-2n GC% : プライマーの GC 含量 (%) n : プライマーの長さ A, G, T, C : プライマーを構成する各塩基の個数 プライマー設計ソフトウェア プライマー設計には インシリコモレキュラークローニング インシリコバイオテクノロジー社 等の市販のプライマーを設計するソフトウェアを利用すると便利です インシリコモレキュラークローニング (IMC) インシリコバイオロジー社 タカラバイオ株式会社のWeb Page 製品情報 解析機器 消耗品 ソフトウェア インシリコバイオテクノロジー社製品 (一般 アカデミック) をご参照ください プライマー設計ツール 市販のプライマー設計ソフトウェアの他にフリーで使用できるプライマー設計ツールもあります Primer 3 DNA 配列から PCR プライマーを設計 NCBI Primer-BLAST Primer3 と BLAST を使用して Primer を設計 特異性の確認 設計したプライマーについて プライマーおよびそのプライマーによる増幅領域が標的遺伝子に特 異的であることを BLAST 検索で確認します BLAST とは Basic Local Alignment Search Tool のことで DNA の塩基配列あるいはタンパク質のア ミノ酸配列のシーケンスアライメントを行うためのアルゴリズムのことです ある配列についてシー ケンスデータベースもしくはライブラリに対して検索することにより ある閾値以上のスコアで類似 するシーケンス群を発見することができます 18

19 PCR 実 験 の 手 引 き 3)プライマー 合 成 と 保 存 方 法 プライマーの 合 成 プライマー 合 成 は メーカーに 発 注 します タカラバイオでも 承 っておりますので ご 利 用 下 さい プライマーの 保 存 方 法 合 成 されたプライマーは 凍 結 乾 燥 品 あるいは 希 望 した 濃 度 の 溶 液 状 態 で 納 品 されます プライマーの 溶 解 や 希 釈 は DNase の 問 題 をさほど 考 えないのであれば EDTA を 含 まない 溶 液 で DNase の 問 題 を 考 えるのであれば TE buffer(te 0.1 buffer : 10mM Tris-HCl, ph mM EDTA)を 使 用 するのが 良 いでしょう DNase の 活 性 に 必 要 な 金 属 イオンが EDTA によりトラップされますので DNase の 活 性 が 抑 制 されます 合 成 されたプライマーを 適 当 な 濃 度 に 調 整 する 場 合 は 製 品 に 添 付 されたデータ(モル 数 )を 参 考 に します また 保 存 する 場 合 は 保 存 用 の 高 濃 度 溶 液 と 使 用 濃 度 の 溶 液 に 分 けて 凍 結 保 存 します 2.PCR 反 応 このステップの 操 作 フロー このステップでは PCR 反 応 液 を 調 製 して PCR 反 応 チューブに 分 注 し PCR 装 置 にセットして 反 応 を 開 始 します 遺 伝 子 検 査 で 必 須 となるピペットマンの 操 作 法 についても 併 せて 解 説 します 1) 準 備 するもの 試 薬 類 DNA サンプル( 鋳 型 ) プライマー PCR 試 薬 19

20 PCR 実 験 の 手 引 き 器 具 類 器 具 名 称 1 マイクロピペット 用 途 少 量 の 液 体 の 分 取 等 に 使 用 す る 器 具 です 扱 う 液 量 に 応 じ て 適 切 なサイズのものを 使 用 します(20μl 用 200μl 用 1000μl 用 等 ) 2 マイクロピペット 用 チップ マイクロピペットの 先 端 に 取 り 付 けて 使 用 する 消 耗 品 で す エアロゾルによるコンタ ミネーション 防 止 のため 疎 水 性 フィルター 付 きチップの 使 用 をお 勧 めします mlチューブ DNA 抽 出 やPCR 反 応 液 の 調 製 等 に 使 用 します DNase RNaseフリーの 製 品 ま たは オートクレーブ 滅 菌 し たものを 使 用 します mlチューブ PCR 反 応 に 使 用 するシングル タイプのチューブです DNase RNaseフリーの 製 品 ま たは オートクレーブ 滅 菌 し たものを 使 用 します mlチューブ(8 連 ) PCR 反 応 に 使 用 する8 連 タイプ のチューブです DNase RNaseフリーの 製 品 ま たは オートクレーブ 滅 菌 し たものを 使 用 します 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap ( 製 品 コード NJ200) 0.2 ml Hi-8-Tube ( 製 品 コード NJ300) 0.2 ml Hi-8-Dome Cap ( 製 品 コード NJ301) 0.2 ml Hi-8-Flat Cap ( 製 品 コード NJ302) 上 記 製 品 はオートクレーブ 不 要 です 20

21 PCR 実 験 の 手 引 き 6 攪 拌 機 (Vortex) 試 薬 の 混 合 等 に 使 用 します 7 8 パーソナル 卓 上 微 量 遠 心 機 (1.5 ml 用 ) パーソナル 卓 上 微 量 遠 心 機 (8 連 用 ) 反 応 液 をチューブに 分 注 後 チューブ 壁 などに 飛 散 した 反 応 液 をスピンダウンするとき に 使 用 します 0.2 mlチューブや8 連 チュー ブをスピンダウンする 際 に 使 用 します 9 アルミラック (1.5 ml 用 0.2 ml 用 ) 1.5 mlと0.2 mlのpcrチューブ に 対 応 したものがあると 便 利 です 氷 上 にセットして 冷 却 しなが ら 反 応 液 を 調 製 できる 金 属 タ イプがお 勧 めです 10 アイスボックス 発 泡 スチロール 製 などのアイ スボックスにクラッシュアイ スを 入 れて 使 用 します 反 応 液 調 製 時 に 試 薬 や 反 応 液 のチューブを 立 てて 冷 却 し 試 薬 の 劣 化 を 防 ぎます 11 PCR 装 置 逆 転 写 反 応 やPCR 反 応 に 使 用 します 2)マイクロピペッターの 操 作 マイクロピペッターのモデルと 推 奨 使 用 量 マイクロピペッターには 容 量 範 囲 が 異 なる 複 数 のモデルがあります 分 取 する 容 量 に 適 したもの を 使 用 してください 21

22 PCR 実 験 の 手 引 き マイクロピペッターの 操 作 法 * マイクロピペッターの 種 類 により 操 作 法 が 異 なる 場 合 があります 詳 細 は 取 扱 説 明 書 をご 参 照 く ださい 1 容 量 モニターを 見 ながら リングを 回 して 容 量 を 設 定 する 容 量 を 増 やす 方 向 にセットするときは いったん 希 望 の 目 盛 を 越 えてから 戻 して 合 わせる 2 マイクロピペッターを 垂 直 に 持 ち チップラックを 片 方 の 手 で 押 さえながら 軽 くトントンと 叩 く ようにしてチップを 固 定 する 3 プッシュボタンを 最 初 に 止 まるところまで 押 し この 状 態 を 保 持 したままチップの 先 端 を 液 体 ( 試 料 )の 中 に 差 し 込 む 4 ゆっくりとプッシュボタンを 戻 し(ばねの 力 で 自 然 に 戻 る) 液 体 ( 試 料 )を 吸 引 する 急 激 に 戻 さ ないように 注 意 5 チップの 先 端 を 液 体 ( 試 料 )から 静 かに 引 き 上 げる この 操 作 によりチップ 内 に 設 定 した 容 量 の 液 体 ( 試 料 )が 保 持 される 6 チップの 先 を 加 えたいチューブや チューブ 内 の 溶 液 に 浸 し プッシュボタンを 最 初 に 止 まると ころまでゆっくりと 押 し 下 げる 7 プッシュボタンをさらにもう 一 段 押 し 下 げ チップ 内 の 液 を 完 全 に 吐 出 する 8 そのままの 状 態 でチップを 引 き 上 げたのち プッシュボタンを 元 に 戻 す 9 イジェクターボタンでチップを 外 して 廃 棄 する コンタミネーションを 避 けるため チップは 一 回 ごとに 替 える 操 作 の 注 意 点 1 液 量 に 応 じたマイクロピペッターを 選 択 する 2 チップは 完 全 に 装 着 する 3 正 しい 持 ち 方 で 使 用 する 4 液 を 吸 い 上 げるときは チップを 浸 す 深 さに 注 意 する 5 吸 入 する 際 はゆっくりと 吸 い 取 る 6 チップの 中 に 液 体 が 入 った 状 態 でピペッターを 横 に 傾 けたり さかさまにしない 7 最 大 目 盛 以 上 最 小 目 盛 以 下 に 設 定 しない 8 粘 度 の 高 い 溶 液 や 揮 発 性 の 高 い 溶 液 微 量 を 測 り 取 る 際 は チップ 内 の 液 量 を 目 で 確 認 しなが ら 行 う 9 吸 排 出 の 際 は チップ 内 の 液 面 の 状 態 を 確 認 しながら 作 業 する 10 コンタミネーションを 避 けるため チップは 一 回 ごとに 替 えて 使 用 する 11 正 確 さを 必 要 とする 場 合 は マイクロピペッターのバリデーションを 行 う 必 要 がある 3) 試 薬 調 製 準 備 PCR 反 応 液 の 調 製 は 氷 上 で 行 いますので アイスボックスを 用 意 します PCR に 必 要 な 試 薬 類 は 使 用 前 にフリーザーから 取 り 出 して 酵 素 類 はそのまま 氷 上 に 立 てておきます バッファーやプライマ ー 等 は 凍 結 していますので 室 温 で 溶 かし よく 混 合 してから 氷 上 に 立 てておきます すべての 試 薬 は 使 用 前 に 小 型 遠 心 機 で 軽 くスピンダウンしてください 実 験 エリアについて PCR 反 応 液 の 調 製 はエリア 1 で 行 い 最 後 の 鋳 型 添 加 はエリア 3 で 行 います( 5. 実 験 環 境 の 整 備 参 照 ) 22

23 PCR 実 験 の 手 引 き 反 応 液 の 調 製 PCR 反 応 液 は 1 反 応 分 ずつ 別 々に 調 製 するのではなく 鋳 型 以 外 の 試 薬 を 含 むマスターミックスを 必 要 本 数 +α 分 まとめて 調 製 します そうすることにより 分 取 の 誤 差 を 小 さくし 試 薬 のロスを 防 ぐことができます エリア 1 で 実 施 1 マスターミックス 調 製 用 の 1.5 ml チューブを 用 意 する 2 マスターミックスを 調 製 する 例 えば 以 下 のように 11 反 応 分 のマスターミックスを 調 製 します (PCR 組 成 は 使 用 する 試 薬 に よって 異 なります ) 試 薬 を 添 加 する 順 番 は 基 本 的 には 容 量 の 大 きいものからとし 途 中 で 間 違 える 可 能 性 もありますので PCR 酵 素 など 高 価 な 試 薬 は 後 で 添 加 します 試 薬 1 反 応 分 11 反 応 分 滅 菌 水 33.5 μl μl 10X PCR バッファー 5.0 μl 55.0 μl dntp Mixture (2.5mM) 4.0 μl 44.0 μl F-Primer 1.0 μl 11.0 μl R-Primer 1.0 μl 11.0 μl PCR 酵 素 0.5 μl 5.5 μl Total 45.0 μl 495 μl 3 4 マスターミックスを 混 合 する マイクロピペッターによる 緩 やかなピペッティングで 混 合 するか 軽 くタッピングして 混 合 しま す 激 しく 混 合 すると PCR 酵 素 が 失 活 しますので 攪 拌 機 (ボルテックス)による 混 合 はできま せん PCR 用 0.2mL チューブを 必 要 本 数 用 意 し ふたにサンプル 名 を 記 入 する ドーム 型 キャップのチューブを 使 用 する 場 合 は ふたの 中 央 に 記 入 すると PCR 反 応 中 に 消 えてし まうことがあるので 下 図 の 場 所 に 名 称 や 印 を 記 入 します このあたりに 番 号 を 記 入 このあたりに 印 をつける 5 6 PCR 用 0.2mL チューブにマスターミックスを 45μL ずつ 分 注 し 軽 くふたをする ネガティブコントロールのチューブに 滅 菌 蒸 留 水 を 5μL 加 えふたをする エリア 3 で 実 施 7 エリア 3 に 移 動 して 鋳 型 を 5μL 加 えふたをする 8 チューブ 内 に 溶 液 が 飛 散 している 場 合 は 卓 上 遠 心 機 でスピンダウンする 4)PCR 反 応 PCR 装 置 に PCR 条 件 を 入 力 し PCR 反 応 液 を 調 製 したチューブをセットして PCR 反 応 を 開 始 します 23

24 3.アガロースゲル 電 気 泳 動 PCR 実 験 の 手 引 き このステップの 操 作 フロー このステップでは まずアガロースゲルを 作 製 し 次 に 電 気 泳 動 を 行 います 電 気 泳 動 後 は エチ ジウムブロマイド 等 で DNA を 染 色 して UV トランスイルミネーター 等 を 用 いて DNA を 可 視 化 し 写 真 撮 影 を 行 います 1) 準 備 するもの アガロース 1 TAE buffer(tris-acetate-edta buffer) 20 倍 濃 度 50 倍 濃 度 などで 市 販 されている < 調 製 する 場 合 > Tris(hydroxymethyl)aminomethane 242 g 酢 酸 57.1 ml 0.5M EDTA 100 ml 上 記 をイオン 交 換 水 に 溶 解 し 全 量 を 1L とする (50 濃 度 ) 使 用 する 際 は イオン 交 換 水 で 50 倍 に 希 釈 (1 TAE)して 使 用 する 電 子 レンジ 平 底 フラスコ エチジウムブロマイド 溶 液 (10mg/ml, Ethidium bromide ; EtBr) 蒸 留 水 に 10mg/mL となるように 溶 解 する 遮 光 して 保 存 する エチジウムブロマイドは DNA と 結 合 すると 紫 外 線 を 照 射 することにより 発 光 する これを 利 用 し て 電 気 泳 動 後 の DNA を 検 出 するために 用 いられる エチジウムブロマイドは 変 異 原 性 が 指 摘 され ているため 取 り 扱 う 場 合 は 手 袋 を 使 用 し ゲルやエチジウムブロマイドに 触 れた 器 具 は 指 定 の 専 用 容 器 に 集 める エチジウムブロマイドを 含 む 溶 液 は 使 用 済 み 染 色 液 の 容 器 に 集 め 適 宜 処 理 を 行 う 代 替 として SYBR 系 の 色 素 がある ゲルメーカー サブマリン 電 気 泳 動 漕 DNA マーカー UV トランスイルミネーター 24

25 PCR 実 験 の 手 引 き 10 泳 動 写 真 撮 影 装 置 (パワーサプライ) 2)アガロースゲルの 作 製 1% アガロースゲル(160 ml)を 作 製 する 場 合 の 手 順 を 以 下 に 示 します アガロースの 溶 解 1 平 底 フラスコに 1 TAE バッファーを 160mL 量 り 取 る フラスコは 各 種 あるが 三 角 フラスコは 突 沸 しやすいため 平 底 フラスコを 用 いるとよい g のアガロースを 加 える 3 アガロースを 分 散 させるため 攪 拌 してしばらくそのまま 置 いておく 口 にラップを 軽 くかけて おく 4 電 子 レンジで 完 全 に 溶 かす 耐 熱 手 袋 または 軍 手 をはめ 溶 解 開 始 直 後 は 吹 きこぼれしやすいので 注 意 する 5 電 子 レンジで 完 全 に 溶 かす 電 子 レンジに 入 れて 20 秒 ~60 秒 ごとに 様 子 を 見 る 泡 が 出 てきたら 加 熱 を 止 めてよく 攪 拌 する これを 繰 り 返 し 完 全 に 沸 騰 するようになったら 1~3 分 間 沸 騰 させる これにより 完 全 にアガ ロース 粒 子 が 水 和 する 光 にかざしてアガロースの 粒 が 完 全 に 見 えないことを 確 認 する (オート クレーブを 使 用 して 溶 かす 方 法 もある ) 6 加 熱 終 了 後 容 器 を 電 子 レンジより 取 り 出 し 室 温 においてゆっくり 冷 却 する 7 エチジウムブロマイド 先 染 めの 場 合 は 70 くらいに 冷 めたところにエチジウムブロマイド 溶 液 を 加 える( 終 濃 度 0.5μg/mL) 後 染 めの 場 合 は 何 も 加 えなくてよい 25

26 PCR 実 験 の 手 引 き ゲルメーカーで 固 化 させる 8 ゲルが 手 で 触 れるくらいまで 冷 えたら ゲルメーカーに 流 し 込 む ゲルの 厚 さは 5 mm くらいになるようにし ゲルメーカー 板 の 高 くなっているところを 指 で 押 し ゲルメーカー 板 の 下 に 回 り 込 んだゲルや 空 気 を 押 し 出 す 気 泡 等 がある 場 合 はチップ 等 で 取 り 除 く コームはあとからセットしてもよい 9 室 温 で 静 置 し ゲルを 固 化 させる 10 ゲルが 固 まったらコームを 注 意 深 く 抜 く 11 当 日 使 用 しない 場 合 は コームを 外 し ゲルの 乾 燥 を 防 ぐためにゲルメーカー 台 ごとラップに 包 み 冷 蔵 保 存 する また コーム 板 を 外 したゲルをタッパー 等 に 入 れ 泳 動 バッファーに 沈 め て 保 存 することもできる 3) 電 気 泳 動 電 気 泳 動 1 ゲルをサブマリン 電 気 泳 動 槽 にセットし 1 TAE バッファーをゲルが 完 全 に 浸 る 程 度 に 満 たす 2 先 染 めのゲルの 場 合 は エチジウムブロマイドを 泳 動 バッファーに 添 加 しておく (エチジウムブ ロマイドはプラス 極 側 からマイナス 極 側 に 移 動 するので プラス 極 側 に 多 めに 加 えておくとよい) 3 電 極 を 泳 動 槽 に 取 り 付 ける この 時 DNA はプラス 極 に 向 かって 流 れていくので プラス 極 とマイ ナス 極 の 方 向 を 間 違 えないようにする 4 泳 動 したい DNA 溶 液 とローディングバッファーを 混 合 し ゲルのウェル(ゲルを 作 製 した 際 コー ムで 付 けたへこんだ 穴 )にアプライする 5 電 源 ボタンを 押 して 泳 動 を 開 始 する 26

27 PCR 実 験 の 手 引 き バンドの 可 視 化 と 写 真 撮 影 1 先 染 の 場 合 泳 動 終 了 後 そのままをトランスイルミネーターに 載 せ UV を 照 射 する DNA のバンド 像 が 確 認 されるので その 状 態 を 写 真 撮 影 する ( 写 真 撮 影 する 場 合 は フィルターを 付 けて 撮 影 する) 2 後 染 めの 場 合 1 TAE バッファーで 0.5μg/mL となるように 希 釈 したエチジウムブロマイド 溶 液 (あるいは 1 TAE バッファーで 希 釈 した SYBR Green I 溶 液 )を 用 意 し そこに 泳 動 の 終 わったゲルを 入 れる ゆ っくり 15 分 くらい 振 とうして 染 色 を 行 い その 後 トランスイルミネーターに 載 せ UV を 照 射 する DNA のバンド 像 が 確 認 されるので その 状 態 を 写 真 撮 影 する ( 写 真 撮 影 する 場 合 は フィルター を 付 けて 撮 影 する) 色 素 の 移 動 度 PCR 反 応 液 をゲルにアプライする 際 に 混 和 するローディングバッファー 中 には 泳 動 の 目 安 となる 色 素 として BPB(ブロモフェノールブルー)や XC(キシレンシアノ ル)などが 含 まれている 各 濃 度 アガロースゲルにおける 移 動 度 (bp) L03,H14 Prime Agarose LE 1-20K(XC) Prime Agarose PCR-Sieve(XC) 0.50% 1% 2% 3% 4% 5% 15,000 5,000 2, L03,H14 Prime Agarose LE 1-20K(BPB) Prime Agarose PCR-Sieve(BPB) 0.50% 1% 2% 3% 4% 5% 1, DNA 分 子 量 マーカー 早 見 表 27

28 PCR 実験の手引き ４ PCR 結果の判定 １ 結果の判定 電気泳動の結果が得られたら PCR 増幅産物の有無と増幅サイズを確認します PCR 増幅産物のバンド が検出されても 目的のサイズと異なる場合は 陰性の判定となります また バンドの濃さは PCR 増幅産物の量を反映していますので ある程度 初期鋳型量の指標となります M M サイズマーカー 反応液1のPCR産物 反応液2のPCR産物 反応液3のPCR産物 反応液4のPCR産物 増幅産物が得られていない 想定されるサイズの増幅産物が得られている 同上 増幅産物は得られているが 想定されるサイ ズの増幅産物ではない ２ 反応条件の至適化 電気泳動の結果 目的の増幅産物が得られていなかったり 非特異的な増幅が多かった場合には 反応条件の至適化を行います 至適化を行うことにより 目的の増幅産物量の増加 非特異的増幅の 低減 時間の短縮 サンプル 酵素等の節約によるコスト低減などが期待できます 増幅が認められない場合 非特異的増幅が認められ る場合 増やす あるは減らす 減らす アニーリング時間 長くする 短くする アンーリング温度 下げる 上げる サイクル数 増やす 減らす 伸長反応時間 長くする 短くする プライマー量 増やす 減らす プライマーの再設計 効果あり 効果あり Hot Start 効果あり 効果あり 鋳型DNA量 28

29 PCR 実 験 の 手 引 き 5. 実 験 環 境 の 整 備 1)コンタミネーションの 原 因 PCR は 非 常 に 高 感 度 な 検 出 法 であるため 混 入 したのが 微 量 の DNA であったとしても それが 増 幅 され 判 定 結 果 に 大 きな 影 響 を 及 ぼすことがあり コンタミネーションに 十 分 注 意 する 必 要 があります DNA が 混 入 するケース 1 外 から 入 り 込 む DNA (ヒトの 皮 膚 髪 の 毛 微 生 物 ( 常 在 菌 ) ) 2 抽 出 した DNA サンプル 間 のクロスコンタミネーション 3 前 回 行 った PCR 等 の DNA 実 験 で 残 存 している DNA ( 増 幅 産 物 等 ) 混 入 した DNA の 由 来 1 実 験 台 ピペッター チップ チューブ 立 てなど 日 常 で 使 用 する 器 具 2 使 用 する 試 薬 酵 素 3 サンプル DNA 溶 液 2)コンタミネーションの 防 止 対 策 1 2 PCR のサンプル 調 製 時 反 応 液 調 製 時 はグローブをつけて 操 作 する ピペッターからの 混 入 を 防 ぐため エアロゾル 防 止 チップを 用 いる 通 常 のチップ フィルター 付 きチップ エアロゾル 気 体 の 中 に 微 粒 子 が 多 数 浮 かんだ 状 態 フィルター これによりエアロゾルによるコンタミネーションを 防 止 溶 液 の 入 ったチューブ 類 は 開 ける 前 に 簡 単 に 遠 心 する チューブのふたを 開 けるときは 内 ぶた 等 に 触 れないように また 飛 沫 が 発 生 しないように 注 意 する 反 応 液 調 製 の 際 は サンプル DNA をいちばん 最 後 に 加 える PCR 反 応 液 調 製 検 体 からの 鋳 型 DNA 調 製 PCR 反 応 液 への 鋳 型 の 添 加 電 気 泳 動 のための 場 所 をそれぞれ 別 にし 機 器 器 具 等 も 部 屋 ごとに 用 意 する 実 験 設 備 内 で 試 料 の 流 れを 一 方 通 行 にすることで 反 応 液 への 増 幅 産 物 の 混 入 を 防 ぐことができる 29

30 PCR 実 験 の 手 引 き エリア 1 反 応 液 の 調 製 分 注 を 行 うエリア 増 幅 産 物 や 検 体 の 入 ったチューブの 開 閉 は 避 ける エリア 2 検 体 の 調 製 を 行 うエリア 増 幅 産 物 の 入 った チューブの 開 閉 は 避 ける エリア 3 反 応 液 への 検 体 の 添 加 と 反 応 を 行 うエリア エリア 4 反 応 産 物 を 解 析 するエリア 解 析 のために 持 ち 込 んだ 増 幅 産 物 の 入 ったチューブは 持 ち 出 さないようにする 専 用 白 衣 試 薬 調 製 用 クリーンベンチ (エリア1) 反 応 産 物 を 電 気 泳 動 により 確 認 (エリア4) 鋳 型 調 製 など 通 常 の 実 験 エリア (エリア2) 鋳 型 添 加 用 クリーンベンチ (エリア3) 7 8 1~3 のエリアは 別 々の 実 験 室 を 設 けることができれば 理 想 的 ですが 上 図 のように 一 部 屋 の 中 にクリーンベンチを 設 置 してエリア 分 けすることも 可 能 です エリア 4 は 必 ずエリア 1~3 とは 別 の 実 験 室 にしてください 各 エリアで 使 用 するマイクロピペットやチップ 白 衣 や 手 袋 は エリア 専 用 とし 共 通 での 使 用 を 避 けてください 特 にエリア 1 には 鋳 型 となる DNA が 存 在 することのないよう 細 心 の 注 意 を 払 います 必 ずポジティブコントロール ネガティブコントロールを 用 意 し 反 応 を 行 う これにより 毎 回 の PCR の 評 価 を 行 うことができ コンタミネーションやその 他 の 異 常 に 気 が 付 き 時 間 や 費 用 のロスを 少 なくすることができる Uracil - N glycosylase(ung)の 使 用 使 用 可 能 な 酵 素 は 限 られるが TaKaRa PCR Carryover Prevention Kit(code : 6088)などを 使 用 することで 以 前 行 った PCR 増 幅 産 物 のキャリーオーバーによる 偽 陽 性 を 抑 制 することができる dttp の 代 わりに dutp を 含 む 基 質 を 用 いて PCR を 行 い 増 幅 産 物 にウラシル 塩 基 を 取 り 込 ませ る この 増 幅 産 物 のキャリーオーバーに 対 して UNG 処 理 して PCR を 行 うことで キャリーオーバー した 増 幅 産 物 は 分 解 され 鋳 型 とはならず ウラシルを 含 まない 検 体 由 来 の DNA のみが 鋳 型 と 30

31 PCR 実 験 の 手 引 き なる コンタミネーションが 発 生 したら 万 が 一 コンタミネーションが 発 生 した 場 合 は 考 えられる 原 因 にひとつひとつ 対 処 してください 試 薬 へのコンタミネーションが 疑 われるときは 新 しいものに 取 り 替 える 必 要 があります 実 験 台 や 器 具 類 は 十 分 洗 浄 をして 滅 菌 を 徹 底 するようにしてください 31

32 関 連 製 品 一 覧 PCR 装 置 PCR 実 験 の 手 引 き 製 品 名 用 途 製 品 コード 容 量 価 格 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch A4 サイズに 収 まるコンパクト な PCR 装 置 (グラジェント 機 能 付 き) TP350 一 式 580,000 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient グラジェント 機 能 付 き 96 ウェ ルプレート 対 応 PCR 装 置 TP600 一 式 550,000 PCR 装 置 関 連 製 品 ( 消 耗 品 ) 製 品 名 用 途 製 品 コード 容 量 価 格 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap 0.2 ml チューブドーム 型 キャ ップ NJ200 1,000 本 9, ml Hi-8-Tube 8 連 チューブ NJ strips 16, ml Hi-8-Dome Cap 0.2 ml Hi-8-Flat Cap 8 連 チューブドーム 型 キャッ プ 8 連 チューブフラット 型 キャ ップ NJ strips 4,400 NJ strips 4,400 TaKaRa 96 well PCR Hi-Plate 96 ウェルプレート NJ 枚 (8 連 12/ 枚 ) 40,700 TaKaRa PCR Hi-Caps (8 連 ) 96 ウェルプレート 用 キャップ NJ 本 6,050 電 気 泳 動 装 置 製 品 名 用 途 製 品 コード 容 量 価 格 Mupid -2plus サブマリン 型 の 電 気 泳 動 装 置 M-2P 一 式 40,760 アガロースゲル 製 品 名 ターゲット 製 品 コード 容 量 価 格 Agarose LO3 TAKARA 1,000 bp 以 上 の DNA の 分 離 解 析 に 適 したアガロース g 17, B 500g 78,000 PrimeGel Agarose LE 1-20K PrimeGel Agarose PCR-Sieve 200 bp~20,000 bp までの 広 範 囲 なサイズの DNA の 分 離 とブ ロッティングに 適 した ルー チン 利 用 のアガロース TAE Buffer 中 では 3%ゲル 濃 度 で 300 ~ 1,200 bp TBE Buffer 中 では 3%ゲル 濃 度 で 100~800 bp の DNA を 分 離 する ことができる 5800A 100g 24, A 100g 48,000 キャリーオーバー 防 止 関 連 製 品 製 品 名 用 途 製 品 コード 容 量 価 格 TaKaRa PCR Carryover Prevention Kit 以 前 に 行 った PCR 増 幅 産 物 の キャリーオーバーによる 偽 陽 性 を 防 止 回 46,000 32

33 本 冊 子 で 紹 介 した 製 品 はすべて 研 究 用 として 販 売 しております ヒト 動 物 への 医 療 臨 床 診 断 用 には 使 用 しないようご 注 意 ください また 食 品 化 粧 品 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 譲 渡 再 販 譲 渡 のための 改 変 商 用 製 品 の 製 造 に 使 用 することは 禁 止 されていま す 本 冊 子 の 内 容 の 一 部 または 全 部 を 無 断 で 転 載 あるいは 複 製 することはご 遠 慮 ください 本 冊 子 に 記 載 されている 社 名 および 製 品 名 は 特 に 記 載 なくても 各 社 の 商 標 または 登 録 商 標 です 本 冊 子 記 載 の 価 格 は2016 年 3 月 7 日 現 在 の 希 望 小 売 価 格 です 価 格 に 消 費 税 は 含 まれておりません ライセンス 情 報 については 弊 社 ウェブサイトにてご 確 認 ください TaKaRa テクニカルサポートライン TEL FAX 東 京 支 店 TEL FAX 関 西 支 店 TEL FAX