Ascidiella aspersa DNA manual ver5

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1 ヨーロッパザラボヤ 判 定 DNA 検 査 方 法 マニュアル Ver.5 作 成 日 :2013 年 4 月 30 日 ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa と 形 態 で 判 定 されたホヤについて これの DNA の Specific PCR や 塩 基 配 列 を 分 析 することによっても ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa と 判 定 することができる また 形 態 で 種 査 定 できなかったホヤについても DNA の Specific PCR や 塩 基 配 列 を 分 析 することによって 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara か ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa か またはその 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. Scabra (A. scabra の 隠 蔽 種 )かを 判 定 できる DNA の 分 析 は ミトコンドリア DNA の CO1 遺 伝 子 を 利 用 した Specific PCR (Polymerase Chain Reaction)または PCR-ダイレクトシーケンシング 法 で 行 う 得 られた Specific PCR や DNA 塩 基 配 列 のパターンから 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara であるか ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa であるか またはその 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であるかを 判 定 する *PCR では 鋳 型 DNA が 微 量 存 在 しても 増 幅 される したがって 目 的 外 の DNA( 特 に PCR 増 幅 産 物 )の 混 入 に 注 意 を 払 う 必 要 がある また DNA は 人 間 の 皮 膚 表 面 から 分 泌 されている DNA 分 解 酵 素 (DNase)により 分 解 されるので 本 酵 素 の 混 入 を 防 止 しなければならない これ らの 点 を 考 慮 し 使 い 捨 てのチューブ チップ 等 を 使 用 し DNA や DNase 等 が 混 入 しないよう 注 意 して 用 いる 1. 試 料 の 準 備 検 査 に 用 いるホヤの 成 体 は 生 きている 個 体 を-20 以 下 で 冷 凍 する 試 料 は -20 以 下 に 冷 却 して 絶 命 させた 後 そのまま 冷 凍 保 存 する または 100%エタノールで 固 定 した 後 -20 で 保 存 する * 水 逆 浸 透 膜 精 製 した RO 水 又 は 蒸 留 水 を Milli-Q 等 で 17 MΩ/cm まで 精 製 した 超 純 水 をオートク レーブで 分 以 上 で 滅 菌 したものなど DNA DNase 等 が 混 在 していないもの 本 Specific PCR および PCR-ダイレクトシーケンシングによる 検 査 では 特 に 断 り 書 きがない 限 り このような 水 を 使 用 すること 2.DNA 抽 出 精 製 DNA 抽 出 にはいくつかの 方 法 があるが TNES(10 mm Tris-HCl ph 7.5; 125 mm NaCl; - 1 -

2 10 mm EDTA;1% sodium dodecyl sulfate (SDS))- 6 M Urea 緩 衝 液 とフェノール クロロホ ルムを 用 いた 抽 出 法 は 応 用 範 囲 が 広 く 魚 介 類 の DNA 抽 出 で 実 績 がある そこで 本 抽 出 法 について 以 下 に 記 す なお 市 販 の DNA 抽 出 キットでも DNA が 良 好 に 抽 出 できる 物 もあるため そのようなキットを 用 いて DNA を 抽 出 してもよい 2.1 TNES - 6 M Urea 緩 衝 液 とフェノール クロロホルムを 用 いた 抽 出 法 入 水 管 出 水 管 図 1 ホヤの 解 剖 図 被 嚢 を 取 り 去 り 腹 正 中 で 切 り 開 いたところ 図 1 の 四 角 部 分 の 筋 肉 組 織 をハサミとピンセットで 50 mg ほど 摘 出 する 摘 出 後 の 残 りの 検 体 *1 は-20 以 下 で 保 存 する 摘 出 した 筋 肉 組 織 を 500 μl の TNES 6 M Urea 緩 衝 液 の 入 った 1.5 ml マイクロチューブに 投 入 後 20 mg/ml の Proteinase K *2 を 10 μl 加 えて 軽 く 撹 拌 して 混 和 し 37 で 1 晩 静 置 する 攪 拌 する 際 は チューブの 蓋 に 緩 衝 液 が 付 かないよう 注 意 する 次 に 500 μl のフェノール クロロホルム *3 を 加 え 転 倒 混 和 後 ミキサーで 軽 く 攪 拌 し ローテーター にマイクロチューブを 設 置 する これを 10 rpm で 10 分 間 回 転 させて 攪 拌 した 後 15,000 rpm (>7,500 g)で 10 分 間 室 温 遠 心 する 水 層 ( 上 層 )を 新 しい 1.5 ml マイクロチューブに 移 す この 時 中 間 層 とフェノール クロロホルム 層 ( 下 層 )を 混 入 しないように 注 意 する 再 度 500 μl のフェノール クロロホルムを 加 え 上 記 と 同 様 に 攪 拌 遠 心 する 水 層 ( 上 層 )を 新 しい 1.5 ml マイクロチューブに 移 す この 時 中 間 層 とフェノール クロロホルム 層 ( 下 層 )を 混 入 しないように 注 意 する 4 に 冷 却 した 500 μl のジエチルエーテル *4 を 加 え 約 30 秒 転 倒 混 和 する なお ジエチルエーテルを 加 えた 直 後 は ジエチルエーテルが 白 濁 するが これが 元 の 透 明 色 に 戻 るまで 転 倒 混 和 する 15,000 rpm(>7,500 g)で 30 秒 室 温 遠 心 する ジエチルエー テル 層 ( 上 層 )を 取 り 除 き 専 用 の 廃 液 瓶 中 に 入 れる この 時 なるべく 水 層 ( 下 層 )を 混 入 し ないように 注 意 する 再 度 4 に 冷 却 した 500 μl のジエチルエーテルを 加 え 上 記 と 同 様 に 転 倒 混 和 遠 心 する ジエチルエーテル 層 ( 上 層 )を 取 り 除 き 専 用 の 廃 液 瓶 中 に 入 れる 次 に - 2 -

3 -20 に 冷 却 した 1 ml の 100%エタノールを 加 え -80 で 15 分 以 上 -20 で 1 時 間 以 上 静 置 す る 15,000 rpm(> 7,500 g)で 15 分 間 冷 却 遠 心 (4 )する マイクロチューブをゆっくり と 傾 けて 上 澄 み 液 を 捨 てる -20 に 冷 却 した 1 ml の 70%エタノールを 加 え 15,000 rpm(> 7,500 g)で 15 分 間 冷 却 遠 心 (4 )する 上 記 と 同 様 に 上 澄 み 液 を 捨 て 再 度 -20 に 冷 却 した 1 ml の 70%エタノールを 加 え 遠 心 する 上 記 と 同 様 に 上 澄 み 液 を 捨 て 2~3 分 間 真 空 乾 燥 あるいは 約 1 時 間 風 乾 する この 時 完 全 に 乾 燥 しないように 注 意 する 300 μl の 0.1 TE 緩 衝 液 *5 または TE 緩 衝 液 を 加 えて 軽 く 混 和 後 4 で 一 晩 静 置 して 完 全 に 溶 解 する その 後 しばら く 検 査 に 使 用 しない 場 合 や 長 期 保 存 する 場 合 は -20 以 下 で 保 存 する 本 抽 出 法 により 抽 出 した DNA 試 料 は RNA も 含 むが PCR 等 への 利 用 において 特 に 問 題 はない RNA を 分 解 する 場 合 は DNA を 完 全 に 溶 解 した 後 100 μg/ml の RNAse A *6 を 10 μl 加 えて 37 で 1 時 間 静 置 する *1 TNES (10 mm Tris-HCl, ph7.5; 125 mm NaCl; 10 mm EDTA; 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)) - 6 M Urea 緩 衝 液 360g の Urea 10 ml の 1 M Tris (ph 7.5) 20 ml の 0.5 M EDTA 7.3 g の NaCl をビーカ ーに 入 れ 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 約 900 ml 加 え 加 温 しながらスターラーで 攪 拌 する Urea は 溶 解 すると 吸 熱 反 応 するため Urea が 完 全 に 溶 解 するまで 加 温 する 10 g の SDS を 少 量 ずつ 加 えて 溶 解 する 全 量 が 1,000 ml となるよう 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 加 えた 後 オ ートクレーブで 滅 菌 する 室 温 で 長 期 間 保 存 できる なお 市 販 の ISOHAIR(( 株 )ニッポン ジーン)を 使 用 しても 良 い *2 20 mg/ml の Proteinase K 20 mg/ml となるように 水 に 溶 解 し 分 注 して-20 で 凍 結 保 存 する 使 用 する 毎 に 溶 解 し 使 用 後 は 凍 結 保 存 する *3 フェノール クロロホルム 0.1% 8-hydroxyquinoline で 着 色 した 1 M Tris-HCl (ph 8.0) 飽 和 フェノールとクロロホルムを 1 : 1 (v/v)で 混 合 する 4 で 遮 光 保 存 する 有 害 であるので 手 袋 を 着 用 する 揮 発 物 を 吸 い 込 まない 等 して 取 り 扱 いの 際 は 注 意 する *4 ジエチルエーテル 有 害 な 有 機 溶 媒 であるので 揮 発 物 を 吸 い 込 まない 等 取 り 扱 いの 際 は 注 意 する *5 TE 緩 衝 液 各 最 終 濃 度 が 10 mm Tris-HCl (ph8.0) 1 mm EDTA (ph8.0)となるように 水 ( 滅 菌 してなく て 良 い)で 調 整 し オートクレーブで 滅 菌 する 室 温 で 保 存 できる *6 100 μg/ml の RNAse A 100 μg/ml となるように 水 に 溶 解 し 分 注 して-20 で 凍 結 保 存 する 使 用 する 毎 に 溶 解 し - 3 -

4 使 用 後 は 凍 結 保 存 する RNAse は 不 活 化 しにくい 酵 素 であり 除 染 が 難 しい そのため 実 験 室 内 に 拡 散 しないように 注 意 する 3 DNA 試 料 原 液 中 の DNA 純 度 の 確 認 並 びに DNA 試 料 液 の 調 整 と 保 存 上 記 抽 出 法 で 抽 出 した DNA は 特 に 問 題 なくそのまま PCR に 使 用 できるが 抽 出 した DNA の 純 度 と 濃 度 を 紫 外 部 吸 収 スペクトルを 測 定 して 算 出 する また 抽 出 した DNA が PCR の 鋳 型 として 利 用 できる 長 さであるか アガロースゲル 電 気 泳 動 で 確 認 する 3.1 紫 外 部 吸 収 スペクトルの 測 定 DNA 試 料 の 適 当 量 を 取 り 原 液 もしくは 必 要 に 応 じて DNA 溶 液 と 同 じ 溶 液 で 10~100 倍 希 釈 した 希 釈 液 について 200~300 nm の 範 囲 で 紫 外 部 吸 収 スペクトルを 測 定 し 230 nm 260 nm 及 び 280 nm の 吸 光 度 (O.D. 230 O.D. 260 O.D. 280)を 記 録 する 次 いで O.D. 260 が 1 のときの DNA 濃 度 を 50 ng/μl DNA として DNA 試 料 原 液 の DNA 濃 度 を 算 出 する また O.D. 260 / O.D. 280 を 計 算 する この 比 が 1.7~2.0 になれば DNA が 十 分 に 精 製 されていることを 示 す 得 ら れた DNA 濃 度 から DNA 試 料 原 液 を 以 後 の PCR に 必 要 な 濃 度 に 水 で 希 釈 して DNA 試 料 液 と し -20 以 下 で 冷 凍 保 存 する 冷 凍 保 存 した DNA 試 料 液 は 融 解 後 直 ちに 使 用 する なお DNA 試 料 原 液 の 濃 度 が PCR で 規 定 された 濃 度 (5 ng/μl~10 ng/μl)に 達 しないときは そのまま DNA 試 料 液 として 用 いる 3.2 アガロースゲル 電 気 泳 動 DNA 試 料 原 液 をアガロースゲル 電 気 泳 動 により 分 離 し 抽 出 した DNA のバンドを 確 認 する アガロースゲルの 作 成 必 要 量 のアガロースを 秤 量 し TAE 緩 衝 液 *を 加 え 電 子 レンジ 等 で 加 熱 して 目 視 でアガロー スの 粒 子 が 全 く 確 認 できなくなるまで 溶 解 する 次 に ゲルを 50 前 後 まで 冷 やした 後 ゲルメ ーカーにゲルを 流 し 込 み 室 温 で 十 分 に 冷 やし 固 めてゲルを 作 成 する ゲルはすぐに 使 用 するの が 望 ましいが 緩 衝 液 に 浸 して 4 で 数 日 間 保 存 することもできる ゲルの 濃 度 は 500~10 kbp の DNA を 明 瞭 に 分 離 する 濃 度 とする * TAE 緩 衝 液 各 最 終 濃 度 が 40 mm Tris- 酢 酸 1 mm EDTA となるように 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 用 いて 調 整 したもの 電 気 泳 動 TAE 緩 衝 液 を 満 たした 電 気 泳 動 槽 にゲルをセットする DNA 試 料 原 液 (1~5 μl)と 適 当 量 のゲ ルローディング 緩 衝 液 を 混 ぜ 合 わせた 後 ゲルのウェルに 注 入 する また DNA 分 子 量 マーカー (λhind Ⅲ digestion 等 )を DNA 試 料 原 液 を 入 れたウェルの 両 隣 のウェルに 注 入 する(2~9 番 目 のウェルに DNA 試 料 原 液 を 入 れた 場 合 1 及 び 10 番 目 のウェルに DNA 分 子 量 マーカーを 入 - 4 -

5 れる) ゲルへの 試 料 注 入 に 時 間 がかかりすぎると DNA が 拡 散 し 鮮 明 な 結 果 が 得 られにくくな るので 注 意 する 次 に 100 V 定 電 圧 で 電 気 泳 動 を 行 い ゲルローディング 緩 衝 液 に 含 まれる BPB がゲルの 1/3~2/3 まで 進 んだところで 電 気 泳 動 を 終 了 する ゲルの 染 色 ゲルが 浸 かる 量 の TAE 緩 衝 液 が 入 った 容 器 に 泳 動 後 のゲルを 移 し 入 れる 次 に 緩 衝 液 100 ml あたり 5 μl のエチジウムブロミド * 溶 液 (10 mg/ml)を 加 え 容 器 を 振 とう 器 に 乗 せて 軽 く 振 とうしながら 30 分 程 度 染 色 する * エチジウムブロミド 2 本 鎖 の DNA 鎖 の 間 に 入 り 込 む 蛍 光 試 薬 であり 強 力 な 発 ガン 作 用 と 毒 性 がある 取 り 扱 いに は 必 ず 手 袋 をはめ マスクを 着 用 する ゲルイメージ 解 析 ゲルイメージ 解 析 装 置 内 のステージあるいはトランスイルミネーターのステージ 上 に 電 気 泳 動 と 染 色 が 終 了 したゲルをのせて 紫 外 線 (312 nm)を 照 射 する ゲルイメージ 解 析 装 置 の 画 面 ある いは 操 作 パソコンの 画 面 で 電 気 泳 動 パターンを 確 認 する 泳 動 結 果 は 画 像 データとして 保 存 して おく DNA 分 子 量 マーカーと 比 較 して DNA のバンドが 約 20 kbp 以 上 のところにあるのが 望 ましい 4 Specific PCR この 手 法 は 種 特 異 的 プライマー(Species Specific Primer SSP)を 用 いて PCR を 行 い (SSP-PCR) 種 を PCR 産 物 の 長 さの 違 いとして 見 分 ける 手 法 である 第 1 の Specific PCR で 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara であれば 226 bp ヨーロッパザラ ボヤ Ascidiella aspersa であれば 122 bp その 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる また 第 1 の Specific PCR で Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra と 判 定 された 場 合 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれ ば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 第 1 の Specific PCR Specific PCR 反 応 液 は 14.2 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 *1 及 び 2.5 mm dntp *1 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*2 計 7 種 類 0.1 μl (0.5units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ *3 (5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 *4 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 - 5 -

6 に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とす る *1 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp DNA ポリメラーゼに 添 付 されているもの 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られる 物 を 用 いる *2 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10 TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 りである なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい 第 1 の Specific PCR のためのプライマー scabra-f :5 -GGC TTC TTC CYC CTG CAT TC 3 (20 mer) ASW-FL :5 GGT TAC TCC CTC CGG CAT TT-3 (20 mer) zara-f :5 TCC TCC CCT TTC AAG AGG TG-3 (20 mer) aspersa-f2 :5 TTA ATT TCT TAG TGA CAA TGA TAG GT-3 (26 mer) Ascidiella-R :5 TGC AGC CAA CAC MGG AAG AG-3 (20 mer) zara-r :5 GGC AGC TAG CAC TGG CAA TG-3 (20 mer) ASW-R :5 CGC AGC CAA TAC GGG AAG AG-3 (20 mer) *3 Taq DNA ポリメラーゼ TaKaRa EX Taq DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる *4 PCR 増 幅 装 置 Gene Amp PCR System 9700(アプライドバイオシステムズ 社 製 ) icycler サーマルサイク ラー(バイオ ラッドラボラトリーズ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる 4.1 電 気 泳 動 PCR 増 幅 反 応 液 をアガロースゲル 電 気 泳 動 により 分 離 し PCR 増 幅 した DNA 断 片 のバンドを 確 認 する アガロースゲルの 作 成 アガロースゲルの 作 成 と 同 様 に 行 う 電 気 泳 動 電 気 泳 動 と 同 様 に 行 う なお PCR 増 幅 反 応 液 は 適 当 量 (1~3 μl) 使 用 し DNA 分 子 量 マーカーは 100bp DNA Step Ladder 等 を 用 いる - 6 -

7 4.1.3 ゲルの 染 色 ゲルの 染 色 と 同 様 に 行 う ゲルイメージ 解 析 ゲルイメージ 解 析 と 同 様 に 行 う M M 図 2 第 1 の Specific PCR の 電 気 泳 動 図 M:DNA 分 子 量 マーカー 上 から 2,000 bp 1,500 bp 1,000 bp 700 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp (100 bp 50 bp よく 分 離 されていない) 1~3:Ascidiella sp. aff. scabra 4~6:Ascidiella scabra 7~9:Ascidia zara 10~12:Ascidiella aspersa 13:DNA 無 し( 陰 性 対 照 区 ) 第 1 の Specific PCR で Ascidia zara であれば 226 bp ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa であれば 122 bp その 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 第 2 の Specific PCR 第 1 の Specific PCR で Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra と 判 定 された 場 合 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる Specific PCR 反 応 液 は 14.4 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*1 計 5 種 類 0.1 μl (0.5 units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ(5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 - 7 -

8 間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とする *1 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 り である なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい 第 2 の Specific PCR のためのプライマー scabra-f :5 -GGC TTC TTC CYC CTG CAT TC 3 (20 mer) ASW-FS :5 CCA TAA TAG GCA TGA AGG CC-3 (20 mer) ASW-FS2 :5 CCA TAA TAG GCA TGA AGG CT-3 (20 mer) Ascidiella-R :5 TGC AGC CAA CAC MGG AAG AG-3 (20 mer) ASW-R :5 CGC AGC CAA TAC GGG AAG AG-3 (20 mer) 電 気 泳 動 については 第 1 の Specific PCR と 同 様 に 行 う M 図 3 第 2 の Specific PCR の 電 気 泳 動 図 M:DNA 分 子 量 マーカー 上 から 2,000 bp 1,500 bp 1,000 bp 700 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp (100 bp 50 bp よく 分 離 されていない) 1~3:Ascidiella sp. aff. scabra 4~6:Ascidiella scabra 7:DNA 無 し( 陰 性 対 照 区 ) 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 5 PCR-ダイレクトシーケンシング Specific PCR の 判 定 では 不 十 分 と 考 えられる 場 合 や Specific PCR では 判 定 が 出 来 なかった 場 合 には 直 接 シーケンシングして Blast 検 索 等 を 行 い 自 分 の 求 めた 塩 基 配 列 がデータベース 上 - 8 -

9 のどの 配 列 と 最 も 相 同 性 が 高 いかを 調 べることが 出 来 る 5.1 CO1 の PCR PCR 反 応 液 は 14.7 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 *1 及 び 2.5 mm dntp *1 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*2 計 2 種 類 0.1 μl (0.5 units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ *3 (5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 *4 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とする *1 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp DNA ポリメラーゼに 添 付 されているもの 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られる 物 を 用 いる *2 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 り である なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい CO1 の PCR 増 幅 のためのプライマー 対 Asc,CO1-ForA 5' TTA TTC GSS TYG AGT TAT CTC A 3' (22mer) Asc,CO1-RevA 5' TCA AAY AGA AGC ATW GTR ATA GC 3' (23mer) 484 bpのpcr 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる 場 合 がある または Asc,CO1-ForC 5 TTA TTC GGG TTG AGT TAT CTC A 3 (22mer) Asc.CO1-RevC 5 TCA AAA AGA AGC ATA GTA ATA GC 3 (23mer) 484 bpのpcr 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる (Ascidiella scabraはこのプライマー 対 でのみPCR 増 幅 される) または LCO1490Asc 5 TGT CMA CWA AYC ATA ARG ATA TTG G 3 (25mer) HCO2198Asc 5 TAS ACC TCS GGR TGS CYA AAA AAC CA 3 (26mer) 657 bp(ascidiella aspersa Ascidiella sp. aff. scabra)の PCR 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる 場 合 がある または LCO GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3 (25mer) HCO TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3 (26mer) 657 bp の PCR 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる (Ascidia zara はこのプライマー 対 でのみ PCR 増 幅 される) - 9 -

10 プライマーの 配 置 図 CO1 遺 伝 子 LCO1490Asc-> <-HCO2198Asc LCO1490 -> <-HCO2198 Asc.CO1-ForA-> <-Asc.CO1-RevA Asc.CO1-ForC-> <-Asc.CO1-RevC *3 Taq DNA ポリメラーゼ TaKaRa EX Taq DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる *4 PCR 増 幅 装 置 Gene Amp PCR System 9700(アプライドバイオシステムズ 社 製 ) icycler サーマルサイク ラー(バイオ ラッドラボラトリーズ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる PCR 反 応 後 の 電 気 泳 動 については 4.Specific PCR に 記 載 した 通 りに 行 う 5.2 ExoSAP-IT*を 用 いた PCR 産 物 の 精 製 PCR による 増 幅 を 確 認 できたら PCR の 増 幅 産 物 1 サンプルあたり 0.1 μl の ExoSAP-IT が 入 るようにミリ Q 水 で 希 釈 調 整 した 溶 液 を PCR 産 物 に 加 える < 例 >96 サンプルで 96 穴 プレートを 使 用 の 場 合 ( 少 し 多 めに 調 整 ) 9.6 μl の ExoSAP-IT を 288 μl のよく 冷 やしたミリ Q 水 に 加 え 泡 立 てないようによくピペ ッティングした 後 各 サンプルの 壁 面 に 3 μl ずつ 8 連 ピペットで 加 える シリコンマットを 乗 せて 蓋 をした 後 プレートの 壁 面 についた 滴 を 完 全 に 落 とすため 遠 心 機 で 軽 く 回 す サーマルサイクラーを 用 いて 37 (30 min) 80 (15 min)で 処 理 する 増 幅 した PCR 産 物 の 濃 度 が 濃 い 場 合 は ExoSAP-IT で 処 理 した PCR 産 物 にミリ Q を 10~30 μl 程 加 えて 希 釈 する 場 合 もある * 極 めて 熱 に 弱 いデリケートな 酵 素 を 用 いるため 扱 いには 特 に 注 意 する 常 温 に 放 置 したり チ ューブの 下 の 方 を 直 に 手 で 持 ったりしない 5.3 シーケンス 反 応 の 反 応 系 シーケンス 反 応 にはいくつかの 企 業 がキットを 販 売 しているが ここでは BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ 社 )を 例 に 述 べる 反 応 液 は 以 下 の 通 り 調 整 する

11 1 サンプルあたり 96 サンプルの 場 合 Template* μl Bdmix * μl 28.8 μl 5 Buffer* 4 2 μl 192 μl DW 7.2 μl サンプル 数 (96) μl 5μM Primer* μl 48 μl Total 10.5 μl 1,008 μl *1 Template ExoSAP-IT で 精 製 した PCR 産 物 *2 Primer は 5 μm にミリ Q で 希 釈 濃 度 はその 都 度 必 ず 確 認 する *3 Bdmix は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit の Reaction Mixture *4 5 Buffer は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit に 付 属 している 5.4 サーマルサイクラーの 設 定 上 記 サーマルサイクラーを 用 いてシーケンス 反 応 を 以 下 の 通 り 行 う {96 (10sec) 50 (5sec) 60 (4min)} 30 サイクル 4 forever 5.5 シーケンス 反 応 産 物 の 精 製 (エタノール 沈 殿 ) 10 μl の 反 応 産 物 が 入 ったウェルへ 125 mm EDTA 5 μl を 8 連 ピペットで 加 える リザーバーと 8 連 ピペットを 用 いて 冷 凍 庫 のよく 冷 えた 100 %エタノールを 50 μl 加 え 白 いシリコンマットをセットする プレート 攪 拌 機 で 5 秒 間 ほどプレートごとよく 撹 拌 させる プレート 遠 心 機 用 のプレート 台 にセットして 2,150 g 45 min で 遠 心 をかける 遠 心 済 みのプレートを 取 り 出 し 流 しで 上 清 液 を 捨 てる ( 一 回 で 一 気 に 上 清 液 を 捨 てる 絶 対 にプレートを 裏 返 してはならない) プレートを 下 に 向 けてキムタオルに 乗 せ 軽 めに 遠 心 をかけて(50 g で 1 分 ) 壁 面 の 残 った エタノールをキムタオルへ 完 全 に 吸 わせる リザーバーと 8 連 ピペットを 用 いて 冷 凍 庫 のよく 冷 えた 70%エタノールを 50 μl 加 え 白 いシリコンマットをセットする プレート 遠 心 機 用 のプレート 台 にセットして 1,700 g 15 min で 遠 心 をかける 遠 心 済 みのプレートを 取 り 出 し 流 しで 上 清 液 を 捨 てる プレートを 下 に 向 けてキムタオルに 乗 せ 軽 めの 遠 心 で(50 g で 1 分 ) 壁 面 のエタノールを キムタオルへ 完 全 に 吸 わせる 白 いシリコンマットをセットして アルミホイルで 遮 光 して 冷 凍 庫 で 保 存 5.6 シーケンサーへセット(ABI3100 ABI3130xl genetic analyzer の 場 合 ) エタ 沈 済 みサンプルプレートの 各 ウェルに HiDi-ホルムアミドを 10 μl ずつ 加 える プレートごと 10 秒 間 VORTEX をかける

12 遠 心 して 壁 面 についている 液 を 落 とす サーマルサイクラーで 92 2 分 のヒートショック すぐにアルミホイル 等 で 遮 光 して 氷 冷 シーケンサーにセット ABI3100 ABI3130xl genetic analyzer のマニュアルに 従 ってシーケンス 取 得 波 形 データと 塩 基 配 列 データが 得 られる 5. 7 結 果 の 判 定 1- 分 子 系 統 樹 の 作 成 分 子 系 統 樹 作 成 ソフトウェア MEGA5 を install する 次 の 配 列 を 国 際 DNA データベースからダウンロードしたり コピー&ペーストして マルチ ファスタ 形 式 に 並 べる Ascidiella aspersa cytochrome oxidase subunit I mitochondrial pseudogene, partial sequence. (AY116600) Ascidia zara cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence AACAGGTATGGTTATTGGAGATGGTCATACTTACAATGTTATTGTTACTGCCCATGCGTT TGTTATAATTTTTTTTTTTGTTATACCCACAATGATTGGGGGTTTTAGGAATTGGCTCTT GCCTATGATAGTTAGAGCTCCGGATATAGCCTTTCCTCGATTAAATAATATGAGCTTCTG GCTTTTGCCTCCAGCATTTTTTTTTATAGTTATCTCTACCTTAATGGGTAGGGGTGCAAG AACGGGATGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCAAGAGGTGTGGCCCACAGCGGTCCTGCAGT GGATTTTGCTATTTTTTCCCTCCATCTTGCTGGTATTTCGAGCATTCTAGGATCTATTAA TTTTCTTGTTACTATGTGGAATATGAAGGCTAAGGGTATAGAGGCCTATCATATTAGTTT GTTCTGTTGGTCAGTTATCTTTACTACCATCCTTCTAGTGCTGTCATTGCCAGTGCTAGC TGCC Ascidiella scabra cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence GCCGGGTCAGGTGATTAGGGATGGTCAGGTCTATAACGTGGTCGTGACTGCTCATGCTTT TGTTATGATTTTTTTCTTTGTTATGCCCATTATGATTGGTGGGTTTGGTAATTGGTTGTT ACCTATGATAGTAGGGGCTCCGGATATGGCTTTCCCTCGTATGAATAATATGAGTTTTTG GTTACTCCCTCCGGCATTTTTTATGTTGATTATTTCTTCTGTTATTGGGAGTGGAGCAGG TACGGGGTGGACAGTATATCCACCGCTTTCTAGCAATCTAGCCCACGCGGGCCCTGCTGT TGATTGTGCTATTTTTTCTTTACACCTAGCCAGAGTTTCAAGTATTCTTGGGTCTATTAA TTTTTTAGTAACCATAATAGGCATGAAGGCTAAGGGGTTCAGTTACTTGAATTTGAGTTT ATTTTGTTGGTCTGTTATTTTTACTACTATTTTGTTGGTGCTTTCTCTTCCCGTATTGGC TGCG Ascidiella sp. aff. scabra cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence ACCTGGGCAGGTTATTGGTGACGGTCAAGTATATAATGTGGTGGTGACGG

13 CCCATGCCTTTGTTATGATCTTTTTTTTTGTTATGCCCATTATAATTGGT GGGTTTGGGAATTGGTTATTACCTATGATAGTTGGGGCTCCGGATATGGC TTTTCCTCGTATAAATAATATGAGTTTTTGGCTTCTTCCCCCTGCATTCT TTATGTTGATTATTTCTTCTGTGATTAGGACCGGGGCTGGGACGGGGTGG ACAGTATATCCCCCTCTGTCAGGCAACTTAGCCCACGCTGGCCCTGCTGT TGATTGTGCAATTTTTTCTTTACACTTGGCGGGTGTTTCTAGCATTCTCG GGTCTATTAATTTCTTAGTGACGATAATGGGAATAAAAGCACGGGGTTTT AGTTATTTAAATTTAAGTTTATTTTGTTGGTCTGTAATTTTTACTACTAT TTTGTTGGTGCTTTCTCTTCCTGTGTTGGCTGCA ( 自 分 の 決 めた CO1 の 配 列 1) ( 自 分 の 決 めた CO1 の 配 列 2) MEGA5 Align Edit/Build Alignment Create a new alignment OK を 選 択 Are you building a DNA or Protein sequence alignment? で DNA を 選 択 Alignment explorer が 表 示 されるので マルチファスタ 形 式 に 並 べた 配 列 をコピー ペースト する Alignment Align by CLUSTAL W を 選 択 パラメータが 表 示 されるので OK を 押 すと 自 動 的 に Alignment を 行 う Alignment が 終 わったら 名 前 を 付 けてデータを 保 存 する 具 体 的 には Data Exit AlnExplorer Closing Alignment Explorer. Would you like to save the current alignment session to file? と 表 示 されるので はい を 選 択 し ファイル 名 を 入 力 し て 保 存 する(MAS ファイル) Data Open A File/Session を 選 択 し 保 存 してある MAS ファイルを 選 択 して 開 く How would you like to open this MAS file? と 聞 いて 来 るので Analyse を 選 択 MEGA5 のウィンドウの Phylogeny を 選 び 表 示 されるタブから Construct/Test Minimum-EvolutionTree を 選 ぶ Would you like to use the currently active data? と 聞 いて 来 るので Yes を 選 択 選 択 肢 が 表 示 されるので Model/Method から Kimura 2 parameter model を 選 択 する Compute を 押 すと 系 統 樹 が 計 算 される 自 分 の 決 定 した CO1 の 配 列 が Ascidiella aspersa Ascidiella scabra Ascidiella sp. aff. scabra Ascidia zara に 近 縁 であるか 系 統 樹 から 判 断 する 5.8 結 果 の 判 定 2-Blast 検 索 結 果 の 判 定 1 で 自 分 の 決 定 した CO1 の 配 列 が Ascidiella aspersa Ascidiella scabra Ascidiella sp. aff. scabra Ascidia zara のいずれにも 該 当 しないことが 判 明 した 場 合 国 際 DNA データベースに 自 分 の 決 定 した 配 列 を 投 入 して Blast 検 索 し 最 も 相 同 性 の 高 い 配 列 がどの 種 の 配 列 であるかを 調 べることが 出 来 る

14 DNA データベースにアクセスする 左 横 の 検 索 欄 の BLAST をクリック 自 分 の 配 列 を 検 索 配 列 データのところにコピー&ペーストする 検 索 結 果 を WWW で 見 るか で 見 るか 選 択 する 検 索 対 象 DIVISION で Standard divisions の 無 脊 椎 動 物 以 外 のチェックを 全 て 消 す より 詳 細 な 設 定 を 適 当 にセットする 検 索 開 始 ( 入 力 内 容 の 送 信 をクリックする) 例 自 分 の 配 列 が 以 下 のような 100 bp であるとき tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatcagccatgtggta gttttctattcaagaaagcctaatatttt Blast 検 索 の 結 果 は Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value U21670 U Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (CO e-49 EF EF Pseudachorutinae sp. RCG-2004 haplotype 18 c e-14 GU GU Scutovertex sp. 'ianus' isolate SianSch6 cyt e-10 GU GU Scutovertex sp. 'ianus' isolate SianSt1 cyto e-10 AB AB Neomicropteryx bifurca mitochondrial COI gen e-10 GQ GQ Stylocellus sp. Peninsula 5 voucher MCZ DNA e-10 FJ FJ Neoconocephalus triops isolate NtTT5 cytochr e-10 FJ FJ Neoconocephalus triops isolate NtTT4 cytochr e-10 FJ FJ Neoconocephalus triops isolate NEtrioPR3 cyt e-10 FJ FJ Neoconocephalus triops isolate NEtrioPR1 cyt e-10 となり U21670 が 最 も 高 い Score と 圧 倒 的 に 小 さい E-value を 持 つことがわかる 先 頭 の U21670 のリンクを クリックすると LOCUS AMU bp DNA linear INV 03-SEP-2002 DEFINITION Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product. ACCESSION U21670 と 表 示 されることから 自 分 の 塩 基 配 列 は Ascidia mentula の CO1 との 相 同 性 が 高 いことがわかる スコアの 198 (bits)をクリックすれば >U21670 U Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product. Length = 205 Score = 198 bits (100), Expect = 3e

15 Identities = 100/100 (100%) Strand = Plus / Plus Query: 1 tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatca 60 Sbjct: 21 tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatca 80 Query: 61 gccatgtggtagttttctattcaagaaagcctaatatttt 100 Sbjct: 81 gccatgtggtagttttctattcaagaaagcctaatatttt 120 のように 相 同 性 検 索 の 結 果 が 示 される このケースでは 相 同 性 (Identities)は 100%であった 執 筆 者 独 立 行 政 法 人 水 産 総 合 研 究 センター 中 央 水 産 研 究 所 水 産 遺 伝 子 解 析 センター 大 原 一 郎 問 い 合 わせ 独 立 行 政 法 人 水 産 総 合 研 究 センター 中 央 水 産 研 究 所 業 務 推 進 課 神 奈 川 県 横 浜 市 金 沢 区 福 浦 TEL: ( 代 表 ) FAX:

2

2 2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT

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