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1 グルカンの 結 合 グルコ-ス 結 合 グルコ ス 比 の 定 量 方 法 ( 理 学 研 究 科 技 術 部 ) 土 居 幹 嗣 ( 理 学 研 究 科 高 分 子 科 学 専 攻 ) 奥 田 寛 上 山 憲 一 mdoi@tech.sci.osaka-u.ac.jp 1.はじめに 技 術 部 は 大 阪 大 学 理 学 研 究 科 の 中 で 学 生 や 教 員 の 教 育 研 究 を 支 援 するだけでなく 大 学 法 人 化 に 伴 い 社 会 に 開 かれた 活 動 をする 技 術 部 を 目 指 して 日 夜 努 力 している その 一 環 で 技 術 部 分 析 室 が 一 年 前 から 行 ってきた 固 体 核 磁 気 共 鳴 装 置 (NMR)を 使 った 一 般 社 会 に 対 する 活 動 を 紹 介 したい 話 は 突 然 技 術 部 の 分 析 室 のホ-ムペ-ジを 見 た 東 京 築 地 の 水 産 会 社 からのメ-ルが 入 り 始 まった 酵 母 の 細 胞 壁 を 原 料 としたサプリメントの 糖 部 分 の 架 橋 構 造 を 固 体 NM Rで 検 出 できないかということが 質 問 の 内 容 であった 糖 の 固 体 NMRの 論 文 は 多 く 報 じ られているが 架 橋 を 定 量 した 報 告 例 はない 過 去 にポリエチレンの 架 橋 に 固 体 NMR が 使 われてきた 例 がある そこで 試 しにと 送 られてきた 試 料 を 測 定 してみると 糖 の 架 橋 部 と 直 鎖 部 とが 一 見 容 易 に 識 別 できることが 判 明 した これは 短 期 で 解 決 する 課 題 と 思 わ れ 安 易 に 測 定 の 条 件 を 吟 味 しながら 進 めていた しかし これが 後 に 事 務 室 に 指 摘 され る 国 立 大 学 独 立 法 人 としての 規 約 に 抵 触 し 迷 惑 を 掛 けることとなった 簡 単 な 測 定 依 頼 が 研 究 の 深 みに 嵌 ってしまった 苦 い 例 である 実 は 糖 の 架 橋 部 と 直 鎖 部 を 容 易 に 識 別 でき たのであるが 糖 の 定 量 が 研 究 課 題 になってしまうほど 困 難 な 分 析 であったグルカンは グルコ-スを 構 成 単 位 とする 多 糖 類 であり グルカンの1 種 である -グルカンは 免 疫 賦 活 活 性 や 抗 腫 瘍 活 性 等 の 種 々の 生 理 活 性 を 有 していることが 知 られている なかでも 一 部 が -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンは 優 れた 生 理 活 性 を 有 していることが 知 られて おり 健 康 食 品 や 医 薬 等 の 有 効 成 分 として 注 目 を 浴 びている -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカン は パン 酵 母 やキノコ 類 等 から 抽 出 す ることのできる 天 然 に 存 在 する 多 糖 類 であり 図 1に 示 すように -(1,3)グリ コシド 結 合 したグルコ-スを 単 位 とす る 主 鎖 と -(1,6)グリコシド 結 合 によ って 主 鎖 に 結 合 する 分 岐 鎖 とからなる 直 鎖 状 の -(1,3)-グルカンや -(1,6) 図 1. -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカン. 1

2 -グルカンは 水 に 可 溶 であるが -(1,6)で 分 岐 した 架 橋 -(1,3)-グルカンは3 次 元 的 に 広 が った 架 橋 構 造 を 有 しており 一 般 的 に 水 やジメチルスルホキシド その 他 の 溶 媒 に 不 溶 である -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンを 健 康 食 品 や 医 薬 に 使 う 場 合 -グルカンとしての 純 度 や -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンの(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 決 定 することは 非 常 に 重 要 である この 比 が 架 橋 の 程 度 を 決 め 製 品 の 安 全 性 や 効 能 に 非 常 に 大 きな 影 響 を 与 え 得 るためである 2. 従 来 の 糖 の 分 岐 の 分 析 法 これまで 一 般 的 なグルカンの 構 造 は 化 学 分 解 した 後 に GS/MS(ガスクロ-マススペク トラム)による 分 析 方 法 が 用 いられている または 架 橋 グルカンについては -グルカ ンの 純 度 のみならず -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンの(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 決 定 する 方 法 として 結 合 位 置 に 特 異 的 に 働 き 結 合 を 切 断 する 酵 素 を 用 いて 切 断 された 可 溶 性 の 単 一 糖 鎖 を 吸 収 スペクトルで 分 析 する 方 法 や 蛍 光 標 識 した 物 質 と 複 合 体 をつくらせて 分 析 する 方 法 も 使 われている 1,2) すでに 上 記 のようにして 切 断 された 可 溶 性 の 単 一 糖 鎖 を 溶 液 NMR 法 により 分 析 する 方 法 も 報 告 されている 3) 溶 媒 に 溶 解 させた -(1,6) 分 岐 した -(1,3)-グルカンついて 溶 液 NMR 測 定 を 行 なった 例 はあるもの の 3) このNMR 測 定 デ-タに 基 づいて(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 決 定 した 例 はない これらの 方 法 はいずれも -グルカンを 切 断 するという 前 処 理 を 必 要 とし 操 作 が 非 常 に 煩 雑 であるという 問 題 がある また 分 析 に 非 常 に 長 い 時 間 を 要 するという 難 点 もある 3. 固 体 装 置 を 使 った 分 析 法 の 開 発 これらの 問 題 を 解 決 するために 比 較 的 短 時 間 で 測 定 試 料 に 前 処 理 を 施 さなくても 非 破 壊 的 に -グルカンの(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 定 量 する 方 法 とし て 固 体 NMR 装 置 を 使 う 方 法 を 開 発 した 残 念 ながら 分 岐 -(1,6)の 13 Cシグナルは 独 立 した 位 置 には 現 れない そこで 独 立 して 観 測 される 直 鎖 -(1,3)の 側 鎖 13 Cシグナルの 減 少 度 によって 定 量 することにした 具 体 的 には 試 料 に 含 まれる -グルカンの(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 定 量 する 方 法 を 採 用 し 架 橋 試 料 の 固 体 13 C-CP/MAS NMRスペクトルを 測 定 し グル コ-スのC-1 炭 素 ピ-クの 積 分 強 度 Aと (1,3) 結 合 グルコ-スのC-6 炭 素 ピ-クの 積 分 強 度 Bとの 間 の 積 分 強 度 比 A/Bを 算 出 し 100%の(1,3)グルコ-ス 結 合 をもつ 基 準 試 料 の 積 分 強 度 比 Ao/Boの 算 出 値 で 補 正 する これにより 精 度 の 高 い(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グル コ-ス 比 を 求 めることができた このような 間 接 的 な 補 正 が 必 要 な 理 由 は 不 均 一 なプロ トン 照 射 による 13 Cシグナルの 強 度 低 下 が 起 こることによるが 装 置 を 含 め 試 料 管 のサイ 2

3 ズを 同 一 にしてもパルスディレイ 時 間 (PDT)およびコンタクト 時 間 (CT)などに 左 右 さ れることがわかってきたからである さらに 糖 の2 次 構 造 や3 次 構 造 で 13 Cシグナルが 異 方 性 による 化 学 シフトや 水 素 結 合 によるシフトで 複 雑 になりこれらを 配 慮 した 条 件 で 測 定 す ることも 必 要 であることがわかった そこで 適 当 な 基 準 試 料 を 選 び 種 々の 条 件 下 での 13 Cシグナルの 強 度 を 基 準 にして 補 正 値 を 得 る 基 準 試 料 の 補 正 値 Ao/Boと 測 定 したいグルカ ン 試 料 の 積 分 強 度 比 A/Bと(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 と 結 びつける 下 の 関 係 式 に 当 てはめることにより (1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 求 めた 関 係 式 は (1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 =(A/B) (Bo/Ao)-1 である 4. 使 用 した 固 体 装 置 とサンプルの 調 製 固 体 13 C-NMRの 測 定 のために 理 学 研 究 科 内 に 設 置 されているChemagnetics 社 製 JNM- CMX-300 装 置 を 使 用 した この 装 置 の 13 C 共 鳴 周 波 数 は75 MHzになる 試 料 管 直 径 は4 mm あるいは7.5 mm 測 定 温 度 は30 スキャン 回 数 は256 回 PD 時 間 は15s コ ンタクト 時 間 を1.0 msの 条 件 で 測 定 した 図 2にこの 装 置 の 写 真 を 示 す また 比 較 のた めに 他 の 装 置 例 えば 日 本 電 子 株 式 会 社 製 J MN-ECA-920( 13 C 共 鳴 周 波 数 は MH z)を 使 用 したが ピ-ク 分 離 はやや 良 くなる ものの 波 形 分 離 による 定 量 のためにはそれほ ど 改 善 されない 結 果 が 得 られた 図 2.Chemagnetics 社 製 JNM-CMX-300W 装 置. この 固 体 13 C- 核 磁 気 共 鳴 スペクトル 測 定 のために 使 われた 測 定 モ-ドは 13 C-CP/MAS( Cross Polarization ) 法 およびDP/MAS(Direct Polarization on 13 C with 1 H Decouple ) 法 であり 前 者 ではPD 値 およびCT 値 の 最 適 を 見 出 し 後 者 では 現 れるシグナルのT1 値 の 長 いものの6 倍 程 度 すなわち100 sで 測 定 し 試 料 および 基 準 物 質 を 同 一 条 件 で 測 定 し た パン 酵 母 菌 の 細 胞 壁 をそのまま 測 定 試 料 管 に 詰 め 水 を 含 ませて2 次 構 造 および3 次 構 造 を 崩 して (1,6) 結 合 グルコ-スおよび(1,3) 結 合 グルコ-スから 構 成 される -グルカンの それぞれの 特 徴 的 なシグナルを 観 測 した これにより 試 料 に 含 まれる -グルカンの(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 比 較 的 短 時 間 で 従 来 の 化 学 的 あるいは 酵 素 分 解 法 に 比 べて 正 確 に 定 量 することができる 従 来 のよう 試 料 を 化 学 的 な 前 処 理 を 施 す 複 雑 3

4 さはなく 分 岐 して 溶 媒 に 溶 けない 試 料 でも 固 体 状 態 のまま 直 接 測 定 できるため 固 体 試 料 の 本 来 の 状 態 を 忠 実 に 反 映 した 定 量 値 を 得 ることができることがわかった 5. 酵 母 細 胞 壁 の 固 体 スペクトルの 測 定 測 定 モ-ドとして 固 体 13 C-CP/MAS 法 と 固 体 DP/MAS 法 の2 法 を 併 用 した 13 C-CP/M AS 法 による 測 定 では グルコ-スの 炭 素 ピ-クのシグナル 強 度 が 向 上 し 短 時 間 で 測 定 値 が 得 られる 利 点 があるが 構 造 的 に 堅 い 部 分 と 柔 らかい 部 分 でシグナル 強 度 が 異 なる そ のためコンタクト 時 間 の 最 適 条 件 を 求 め その 条 件 で 常 に 対 象 資 料 の 面 積 強 度 を 基 準 物 質 の 積 分 強 度 で 補 正 し 同 一 プロトン 照 射 条 件 と 試 料 管 サイズの 条 件 を 満 たしたのち 純 度 を 算 出 する 必 要 がある 一 方 固 体 DP/MAS 法 では 感 度 が 悪 く シグナル/ノイズが 大 きい ために 長 時 間 の 積 算 が 必 要 であるが 補 正 因 子 は1に 近 く そのままの 積 分 強 度 比 が 使 え るはずであるが 実 際 にはT1の 長 い 部 分 に 合 わせた 測 定 では プロトン 照 射 が 十 分 で 無 い 場 合 があり T1の 短 い 部 分 のシグナル 強 度 は 低 下 するためにこの 場 合 にも 補 正 値 を 使 う 必 要 がある 試 料 を 入 れる 試 料 管 の 直 径 は 3.2 mm 4 mm 5 mm または7.5 mm のもの を 使 用 することができるが デ-タの 積 算 時 間 の 短 縮 には 直 径 の 大 きいもの 程 良 い しか し 装 置 によってはプロトン 照 射 が 均 一 ではなくなり 補 正 値 は1からずれる また 試 料 管 の 回 転 速 度 は できる 限 り 高 いことが 好 ましいが 現 有 装 置 では 直 径 5 mmの 試 料 管 を 用 いた 場 合 5~10 khzの 回 転 速 度 である また CP/MAS 測 定 では 外 部 磁 場 に 対 して 試 料 管 をマジック 角 (54.7º)で 回 転 させる 必 要 があり この 調 整 にも 技 術 を 要 する 化 学 シフトの 外 部 標 準 物 質 としては 固 体 NMR 装 置 において 通 常 用 いられているものと してテトラキス(トリメチルシリル)シラン(TTMSS)を 使 うことが 多 く TMS(テト ラメチルシラン)スケ-ルに 換 算 すると0.2 ppmに 現 れる 固 体 13 C-CP/MAS-NMRにおいて 試 料 分 子 の 官 能 基 の 部 分 で 堅 い 部 分 と 柔 らかい 部 分 と の 間 でシグナル 強 度 が 異 なることがわかった これはプロトン 照 射 が 不 均 一 なときには 著 しく 異 なるためであり グルカンでは 糖 の 環 構 造 内 のC-1 炭 素 と 側 鎖 に 存 在 するC-6は 緩 和 時 間 が 異 なり C-1シグナルは 強 く C-6シグナルは 弱 く 現 れる また C-1とC-6のシグナ ル 比 が 装 置 に 依 存 する 値 であることから 構 造 の 明 確 な100%の(1,3) 結 合 グルコ-スを 基 準 物 質 として 使 い このシグナル 比 を 補 正 してより 精 度 の 高 い(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 を 求 める 必 要 がでてきた 6. 定 量 精 度 を 上 げるための 基 準 物 質 基 準 物 質 として 100% -(1,3) 結 合 グルコ-スであり 直 鎖 状 で 水 可 溶 なカ-ドランを 選 び 溶 液 13 Cおよび 1 H-NMRで -(1,3) 結 合 グルコ-スの 固 体 状 態 での 特 徴 的 なシグナル を 確 認 した このカードランは 武 田 薬 品 製 の 純 粋 に 近 いものであるが もともと 大 阪 大 学 4

5 産 業 科 学 研 究 所 教 授 の 原 田 篤 也 先 生 が 発 見 されたもので 大 阪 大 学 には 縁 の 深 い 糖 物 質 で ある 水 溶 液 中 の 13 Cシグナルは 固 体 の 場 合 とほとんど 同 じ 化 学 シフトを 示 し C-1は ppm C-3は87.3 ppm C-5は77.9 ppm C-2 は74.9 ppm C-4は68.7 ppm C-6は6 1.5 ppmに 現 れる また 溶 液 C-H/MQC-2D-NMRスペクトルを 測 定 することにより 従 来 カードランの 13 Cシグナルのシフト 値 から 経 験 的 に 帰 属 されていた 13 Cシグナルがすべて 論 理 的 に 帰 属 できた 図 3にカ-ドランの 固 体 13 C-CP/MASスペクトルとそのシグナルをN MR 解 析 ソフトDeltaにより 得 られた 波 形 分 離 結 果 を 示 す シグナル 強 度 は 測 定 条 件 のPD 時 間 (2 s~16 s)に 対 してほとんど 変 化 はないが コンタクト 時 間 に 対 しては 図 4のよう に 大 きく 変 化 する このC-1シグナルAoとC-6シグナルBoの 比 Ao/Boが1 msで 最 大 であるこ とから この 条 件 におけるAo/Bo=1.1を 補 正 因 子 として 得 た 図 3.カ-ドランの 固 体 13C-CP/MAS-NMRス ペクトル(PD=15 s,コンタクト 時 間 =1.0 ms)と 波 形 分 離 による 面 積 強 度 の 解 析. 図 4. 固 体 13C-CP/MAS-NMRスペクトルにおけ るコンタクト 時 間 とシグナル 強 度 との 関 係. 7.パン 酵 母 細 胞 壁 の(1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 含 有 比 の 分 析 パン 酵 母 細 胞 壁 の -グルカン 部 分 の 13 C-CP/MAS-NMRスペクトルの 具 体 例 を 示 す 水 に 不 溶 である 試 料 はNMR 測 定 にあたり 前 処 理 はなされておらず そのままの 乾 燥 した 状 態 と 湿 気 を 含 んだ 状 態 で 測 定 した 混 入 している 脂 質 の 13 CシグナルはDP/MAS 法 では 観 測 さ れるがCP/MAS 法 では 観 測 されない また タンパク 質 の 13 Cシグナルも 糖 部 分 の 13 Cシグ ナル 領 域 (50 ppmから125 ppm)から 離 れているために スペクトルの 解 析 より 定 量 分 析 できる 図 5は 一 部 -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンを 含 むパン 酵 母 菌 の 細 胞 壁 の 13 C-CP/MAS-NMRスペクトルの 一 例 である (1,3)グルカン 部 のC-6シグナルは61.6 ppm 5

6 に 現 れる ただし 100% -(1,3)グルカンであり 分 岐 のないパスツランの 13 C-CP/MAS-N MRスペクトルを 参 考 にすると 分 岐 した(1,6)グルカン 部 のC-6は70.2 ppmに 現 れている と 考 える また いずれのC-1も104.0 ppmに 現 れるC-3シグナルは87.5 ppmと85.2 ppmに 重 なって 現 れ C-5およびC-2は76.9 ppmと74. 1 ppmにそれぞれ 現 れる またC-4は68.8 ppm に 現 れる これらの 化 学 シフト 値 を 基 にしてシ グナルを 合 成 し 波 形 分 離 法 によりC-1とC-6の 積 分 強 度 比 からA=1.0 B=0.9が 得 られた(C T 時 間, 1 ms; 待 ち 時 間, 5s) これにAo/Boの 補 正 因 子 を 掛 けて (1,6) 結 合 グルコ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 は0.10になり アノマ- 部 分 の -(1,3)-グルカンの 純 度 は90%になる なお 試 料 が 含 有 する 水 分 量 に 依 存 して 分 離 能 は 幾 分 変 化 するが スペクトルのプロファ イル 自 体 に 変 化 はほとんどなく (1,6) 結 合 グル 図 5. -D-(1,6) 分 岐 した -D-(1,3)-グルカンを 含 むノ-ルウエ 産 パン 酵 母 菌 の 細 胞 壁 の コ-ス/(1,3) 結 合 グルコ-ス 比 の 定 量 性 に 影 響 13 C-C P/MAS-NMRスペクトル はない 8.まとめ 以 上 のように 糖 そのものの 構 造 的 な 特 徴 のためにプロトン 照 射 が 完 全 ではなく 機 械 的 な 要 因 のみならず 糖 の3 次 元 構 造 を 壊 す 条 件 下 でカ-ドラン 基 準 物 質 と 比 較 すること が 最 も 良 いことがわかった この 定 量 法 は 一 部 -(1,6)で 分 岐 した -(1,3)-グルカンを 含 む パン 酵 母 菌 の 細 胞 壁 の 分 岐 の 程 度 を 決 定 する 初 めての 方 法 ではあるために 4) N 水 産 会 社 と 共 に 特 許 を 共 同 出 願 した もちろん この 分 析 の 前 段 階 では 固 体 試 料 のまま 脂 質 やタンパ ク 質 含 量 の 決 定 もできるため この 有 用 性 も 糖 の 分 析 に 役 立 つものと 考 えている 9. 謝 辞 本 研 究 は 中 島 水 産 ( 株 )との 共 同 研 究 であり 謝 意 を 表 します 参 考 文 献 1)B. V. McCleary, R. Codd, J. Sci. Food Agric-55, (1991). 2)M. Iza wa, US Patent 6,008,054 (2000). 3)Y. T. Kim, E. H. Kim, C. Cheong, D. L. Williams, C. W. Kim, S. T. Lim, Carbohydr. Res. 328, (2000). 4) 土 居 奥 田 上 山 井 上 児 玉 ; 特 許 (2006). 6

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