第 一 章 原 核 ならびに 真 核 生 物 システムを 用 いた 露 地 栽 培 アガリクスの 安 全 性 試 験 アガリクスは 古 Table Results of mouse micronucleus test at 24h after administration (5 mice each)

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1 も と い ま す ろ う 氏 名 ( 本 籍 ) 元 井 益 郎 ( 東 京 都 ) 学 位 の 種 類 博 士 ( 薬 学 ) 学 位 記 番 号 学 位 授 与 の 日 付 学 位 授 与 の 要 件 論 博 第 347 号 平 成 28 年 3 月 18 日 学 位 規 則 第 4 条 第 2 項 該 当 学 位 論 文 題 目 露 地 栽 培 ア ガリクスの 機 能 性 に 関 する 研 究 論 文 審 査 委 員 ( 主 査 ) 教 授 大 野 尚 仁 教 授 杉 浦 宗 敏 教 授 野 口 雅 久 教 授 新 槇 幸 彦 論 文 内 容 の 要 旨 日 本 の 人 口 減 少 と 高 齢 化 は 国 力 と 財 政 に とって 大 き なマイナス 要 因 と なっている 日 本 の 将 来 推 計 人 口 に よれば 2025 年 には 75 歳 以 上 の 人 口 割 合 は 全 人 口 の 18.1% となる 2060 年 には 人 口 は 8674 万 人 にまで 減 少 し 75 歳 以 上 の 人 口 割 合 は 全 人 口 の 26.9%になる また 高 齢 化 に 伴 い 国 民 医 療 費 の 増 加 は 必 至 で あ り 増 加 を 防 ぐ 手 立 ては 喫 緊 の 課 題 で ある その 中 で 注 目 さ れてきたのが 病 気 に な る 前 の いわゆる 未 病 段 階 での 対 策 である 普 段 の 生 活 か らバランスの 良 い 食 事 や 適 度 な 運 動 を 心 がける ことが 病 気 発 症 の リ スクを 減 ら し 健 康 寿 命 を 延 伸 し 結 果 的 に 医 療 費 介 護 費 な どの 抑 制 に 繋 が る 日 本 人 の 食 生 活 は 動 物 性 高 脂 肪 食 な どの 欧 米 型 に 移 行 してい るの で バ ランスの 良 い 食 生 活 の ためには それらを 整 え 補 う 機 能 性 食 品 の 素 材 の 開 発 と 研 究 が 重 要 である アガリクス 学 名 Agaricus brasiliensis は ブラジル 原 産 の 担 子 菌 で あり 日 本 で はヒメマツタケやカワリハラタケなど として 健 康 食 品 素 材 と して 用 いられてきた 申 請 者 は 1995 年 から 20 年 間 に わたり 本 菌 に つ いて 多 面 的 に 開 発 研 究 に 携 わ ってきた 本 研 究 では 独 立 行 政 法 人 産 業 技 術 総 合 研 究 所 特 許 生 物 寄 託 センターに 寄 託 ( 寄 託 番 号 FERM P-17695)された Agaricus brasiliensis KA21 株 ( 以 下 A.brasiliensis と 略 ) を 用 い 露 地 栽 培 ア ガ リクスの 機 能 性 について 検 討 した 本 論 文 は 第 一 章 原 核 な らびに 真 核 生 物 システムを 用 い た 露 地 栽 培 ア ガリクス の 安 全 性 試 験 第 二 章 露 地 栽 培 ア ガ リ ク ス の 機 能 性 臨 床 研 究 第 三 章 ヒ ト 抗 β - グ ル カ ン 抗 体 価 に お け る 露 地 栽 培 ア ガ リ ク ス 服 用 の 効 果 と が ん 患 者 に お け る 抗 β -グ ルカン 抗 体 の 研 究 で 構 成 さ れている

2 第 一 章 原 核 ならびに 真 核 生 物 システムを 用 いた 露 地 栽 培 アガリクスの 安 全 性 試 験 アガリクスは 古 Table Results of mouse micronucleus test at 24h after administration (5 mice each) Cell Counts Percent MPCE per P Value くから 健 康 食 品 素 Group PCE NCE PCE 2000 PCE for MPCE** 材 として 我 国 で 汎 Control Mean 用 されてきたが SD 年 に は 輸 入 Test (1000mg/kg) Mean された 本 菌 由 来 の SD Positive control* Mean 食 品 に よる 健 康 被 SD 害 の 報 告 が なされ *Oral administration of 100 mg/kg cyclophosphamide. 安 全 性 についてさ **P<0.05 was considered statistically significant. らに 詳 細 に 検 証 す PCE : polychromatic erythrocytes ; NCE : normochromatic erythrocytes ; る 必 要 性 に 迫 ら れ MPCE : micronucleated polychromatic erythrocytes. た 申 請 者 は 本 研 究 に 着 手 するにあたり まず 本 菌 株 の 安 全 性 に ついて 検 討 するこ ととした そこで 細 菌 を 用 い る 復 帰 突 然 変 異 試 験 マウス 小 核 試 験 ならびに マウスリンフォーマ TK 試 験 を 実 施 し た 復 帰 突 然 変 異 試 験 で は 検 体 を 粉 末 と して 注 射 用 水 に 懸 濁 し 50 から 5000μ g/plate の 濃 度 範 囲 で 評 価 し た ま た 代 謝 的 活 性 化 を 評 価 す るために S9mix 存 在 下 および 非 存 在 下 で 検 討 した その 結 果 変 異 コ ロニー 数 は 被 験 物 質 中 のアミノ 酸 含 量 相 当 しか 認 められず 変 異 原 性 は 否 定 された マウス 小 核 試 験 では シクロホスファミドを 陽 性 対 象 と して 検 定 し た その 結 果 小 核 の 出 現 頻 度 な らびに 赤 血 球 中 に 占 め る 幼 若 赤 血 球 の 比 率 は いずれも 陰 性 対 照 群 と 検 体 投 与 群 との 間 で 有 意 差 を 認 め なかったこ とから 小 核 の 増 加 作 用 を 示 さないこと が 分 か った(Table) また マウスリンフォーマ TK に 対 しても 細 胞 毒 性 を 示 さなかっ た さらに 共 同 研 究 者 とともに 健 常 人 に 6 か 月 に わたり A. brasiliensis を 摂 取 させたところ 特 別 な 有 害 事 象 は 認 め られなかった (ecam Vol.5(2) ) これらのことから 本 研 究 で 使 用 している A. brasiliensis は 細 菌, 細 胞,マウス, ヒトのいずれにおいても 安 全 が 高 いことを 明 らかとした 第 二 章 露 地 栽 培 ア ガ リクスの 機 能 性 臨 床 研 究 近 年 の 研 究 に より A. brasiliensis は β -グルカン や ビタミン D を 多 量 に 含 むこ とが 報 告 さ れている また 製 品 化 の 過 程 を 工 夫 す ることで ペルオキシダーゼ ポ リフェノールオキシダーゼ ラッカーゼなどの 抗 酸 化 酵 素 を 有 し て いることを 確 認 し ている また これまでの 臨 床 研 究 に おいて A. brasiliensis の 摂 取 に より 免 疫 機 能 を 賦 活 する 結 果 (NK 細 胞 の 活 性 化 )が 得 られている しかしながら A. brasiliensis の Quolity of Life(QOL)の 改 善 を 中 心 とした 機 能 性 に ついては 知 見 が 得 られていない そこで 今 回 A. brasiliensis を 含 有 する 食 品 の QOL 改 善 効 果 を 調 査

3 することを 目 的 として A. brasiliensis 含 有 食 品 を 12 週 間 連 続 摂 取 す るオープン 試 験 を 行 った 登 録 被 験 者 数 は 24 名 とし 被 検 食 品 を 12 週 間 摂 取 させ 肌 の 状 態 排 便 の 状 態 髪 の 状 態 体 の 状 態 お よび 睡 眠 の 習 慣 に ついて 34 のアンケート 調 査 を 行 った 被 験 者 に 摂 取 開 始 から 6 週 後 ( 43 日 目 )および 12 週 後 ( 85 日 目 ) に 体 調 確 認 身 体 測 定 理 学 検 査 唾 液 検 査 特 殊 検 査 の 各 検 査 お よびアンケート 記 入 を 実 施 した ま た 12 週 目 には 上 記 検 査 に 追 加 し て 一 般 臨 床 検 査 ( 血 液 )も 行 っ た そ の 結 果 試 験 期 間 中 に いくつかの 自 覚 症 状 の 訴 えと 他 覚 症 状 が 観 察 された が 症 状 はすべて 軽 度 で あり 重 篤 な 有 害 事 象 は 見 ら れなかった ま た 抜 け 毛 の 量 白 髪 の 量 疲 労 感 倦 怠 感 目 の 疲 れ 肩 こ り 手 足 の 冷 え 日 中 覚 醒 困 難 目 覚 め の 良 さ のスコアが それぞれの 摂 取 前 に 比 べ て 有 意 に 改 善 した また 水 虫 症 状 に 関 して も 改 善 傾 向 を 示 し た こ のように A. brasiliensis は 多 彩 な 生 理 機 能 増 強 効 果 を 示 し た ことから この 効 果 は 主 要 成 分 で あるβ-グ ルカンだけでなく A.brasiliensis に 含 ま れる 特 徴 的 な 成 分 例 えば 味 覚 臭 覚 を 正 常 化 し 食 欲 を 増 す 亜 鉛 疲 労 感 を 和 ら げ るビタミン B 群 ビタミン D などの 関 与 も 考 えられる 第 三 章 ヒト 抗 β-グ ル カ ン 抗 体 価 に お け る 露 地 栽 培 ア ガ リ ク ス 服 用 の 効 果 と が ん 患 者 に おける 抗 β -グ ル カン 抗 体 の 研 究 担 子 菌 子 実 体 の 多 糖 類 に 関 す る 体 系 的 な 研 究 によって A.brasiliensis の 子 実 体 は 10% 以 上 のβ-グ ルカンを 含 み 免 疫 調 節 作 用 を 示 すβ-グルカンの 主 な 構 造 は β- (1,3)-D-グルカン に 高 分 岐 は マウス における 抗 腫 瘍 効 果 腎 臓 の 保 護 作 用 肝 臓 の 保 護 作 用 ラッ トにおける 心 臓 の 保 Figure Comparison of the increase in the anti -BG IgG, IgM, or IgA antibody titer in A. brasiliensis group.the anti-bg IgG, IgM, or IgA antibody titer was measured by ELISA using CSBG-coated plates. The rate of increase in the titer was calculated. *: Anti-BG IgA antibody was significantly increased after taking compared with before taking (p<0.01, paired t -test). 護 作 用 ヒト 臨 床 に お けるNK 細 胞 活 性 化 作 用 糖 尿 病 や 肥 満 の 徴 候 を 軽 減 す る 作 用 など 多 様 な 生 物 学 的 活 性 が 報 告 されている 本 章 では A. brasiliensis の 含 有 す るβ-グ ルカンに 対 し てヒトは 特 異 抗 体 を 有 しているかを 検 討 す る ために 健 常 人 な ら びにがん 患 者 血 清 を 用 いて β-グ ルカンを 固 相 と した ELISA 法 に よって 検 討 した *

4 その 結 果 1) 健 常 人 は A.brasiliensis のβ-グルカンに 対 す る 抗 体 を 有 し てい た また 2) ヒ ト 抗 体 は 病 原 性 真 菌 Candida albicans 由 来 のβ-グ ル カンである CSBG と 交 差 反 応 性 を 示 した これらのことから この 抗 体 は 抗 真 菌 感 染 免 疫 に 寄 与 し ている 可 能 性 のあることがわかった さ らに 3) ボ ランティア 個 々 の 力 価 を 比 較 すると 個 人 差 が 顕 著 であることから β-グ ルカン 感 受 性 に は 個 人 差 があることが 示 唆 された また 4) 抗 体 はクラス ごとに 構 造 的 な らびに 機 能 的 な 特 徴 を 有 し て いるので ク ラス (IgG IgM IgA)ごとの 抗 体 価 を 調 べた と ころ IgG クラスの 抗 β -グルカン 抗 体 の 力 価 が 最 も 高 く IgM および IgA クラスの 抗 体 も 検 出 さ れた また 5)A. brasiliensis 服 用 が 各 ク ラスの 抗 β -グルカン 抗 体 価 に ど のような 変 化 が あるのか 検 討 したところ 増 加 率 に 個 人 差 があるものの IgG は 平 均 増 加 率 が 30.4% IgM49.5% IgA クラスは 服 用 後 有 意 に 増 加 し 最 も 高 い 平 均 増 加 率 90.3 %を 示 した(Figure) また 6) がん 患 者 血 清 を 用 い て 抗 β -グルカン 抗 体 価 を 測 定 した ところ 力 価 は 患 者 ご とに さらに 著 しく 異 なったが 抗 体 価 が 消 失 す ることは 無 かった β -グルカン は 免 疫 機 能 の 強 化 の ために 汎 用 されており 抗 β -グルカン 抗 体 がどのように 関 与 し て いるのか 興 味 深 い β-グルカンに 対 す る 抗 体 が 生 じる 理 由 に ついては 明 確 な 答 え が 無 い 病 原 真 菌 C. albicans と 交 差 反 応 性 を 示 し たことから 常 在 真 菌 ならびに 環 境 中 に 存 在 する 病 原 真 菌 による 感 染 に よって 特 異 抗 体 が 上 昇 した 可 能 性 が ある 共 同 研 究 者 は 小 児 で は 抗 β - グルカン 抗 体 価 が 低 い こと ウシ 胎 児 血 清 で も 著 し く 抗 体 価 が 低 い ことを 報 告 してい る こ れらのことは 環 境 真 菌 の 暴 露 によって 抗 体 価 が 上 昇 した 可 能 性 の あることを 強 く 示 唆 し ている 総 括 アガリクスは ブラジル 原 産 で 日 本 で は ヒメマツタケ や カワリハラタケ として 知 ら れており 機 能 性 食 品 の 原 料 や サ プリメントとして 広 く 使 用 さ れてきた 担 子 菌 の 子 実 体 ( 茸 ) は 菌 株 栽 培 条 件 及 び 産 地 によって 安 全 性 機 能 性 成 分 が 著 しく 異 なる 可 能 性 が あ るので 菌 株 ごと 栽 培 条 件 ご とに 評 価 することが 必 要 で ある 本 研 究 では 原 産 国 で 露 地 栽 培 された A.brasiliensis を 使 用 した 本 研 究 では A. brasiliensis について in vitro 及 び in vivo からその 安 全 性 を 明 らかにし ヒト 臨 床 試 験 を 行 い QOL 改 善 効 果 を 示 す ことを 明 ら かにし た 又 A.brasiliensis の 摂 取 で 抗 β-グ ルカン 抗 体 の 力 価 が 上 昇 することを 見 出 し た 更 に IgA クラスで 最 も 顕 著 な 増 加 が 認 め られたことから 経 口 摂 取 す る こ とによって 皮 膚 や 粘 膜 面 の 感 染 防 御 機 能 を 強 化 し ている 可 能 性 のあることが 示 唆 さ れた 申 請 者 ら の 研 究 グ ル ープでは, 長 年 にわたり 機 能 性 食 品 の 開 発 研 究 を 行 ってきた 20 世 紀 後 半 には 末 期 がん 患 者 の QOL 改 善 効 果 が 強 く 意 識 さ れたが エビデンスレベ ルが 低 く 科 学 的 に は 低 迷 し た 近 年 になって 自 然 免 疫 研 究 が 進 展 すると 共 に 担 子 菌 の 菌 体 成 分 に 対 する 特 異 的 受 容 体 が 発 見 さ れ 機 能 発 現 が 分 子 レ ベ ルで 解 析 さ れるよ

5 うになってきた また, 超 高 齢 社 会 の 到 来 に よって 未 病 への 期 待 が 強 くなったことか ら 機 能 性 食 品 へ の 期 待 がさらに 高 まってきた このような 栄 養 価 を 豊 富 に 含 み 安 全 性 機 能 性 のエビデンス( 科 学 的 裏 付 け)のある 機 能 性 食 品 の 積 極 的 な 摂 取 と その 人 にあった 適 度 な 運 動 が 人 々 の 免 疫 力 増 強 感 染 防 御 に 繋 が り 未 病 から 健 康 に そ して 健 康 長 寿 に 更 に 医 療 費 の 低 減 化 に 繋 がることが 期 待 される 研 究 結 果 の 掲 載 誌 Int. J. Med. Mushrooms,6, (2004); Int. J. Med. Mushrooms, 11, (2009); Int. J. Med. Mushrooms,14, (2012); Int. J. Med. Mushrooms, 9, (2015)

6 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 日 本 は 高 齢 化 が 著 し く 進 みつつあり 国 民 医 療 費 の 増 加 をもたらしている これを 防 ぐ 手 立 て の 実 施 は 喫 緊 の 課 題 であり, 機 能 性 食 品 素 材 を 開 発 することは 予 防 医 学 的 視 点 か ら 重 要 で あ る アガリクス 学 名 Agaricus brasiliensis は ブラジル 原 産 の 担 子 菌 で あり 申 請 者 は 長 年 に わたり 多 面 的 に 開 発 研 究 に 携 わ ってきた 本 研 究 では 露 地 栽 培 ア ガリクス( A. brasiliensis)の 機 能 性 について 検 討 した 第 一 章 原 核 ならびに 真 核 生 物 シ ステムを 用 いた 露 地 栽 培 ア ガリクスの 安 全 性 試 験 では A. brasiliensis の 安 全 性 に ついて 検 討 するため, 1) 細 菌 を 用 いる 復 帰 突 然 変 異 試 験 2) マ ウス 小 核 試 験 な らびに 3) マ ウスリンフォーマ 試 験 を 実 施 した 1) では 検 体 を 粉 末 とし S9mix 存 在 下 および 非 存 在 下 に 検 定 した そ の 結 果 変 異 コ ロニー 数 は 被 験 物 質 中 のアミノ 酸 含 量 相 当 し か 認 め られず 変 異 原 性 は 否 定 された 2) では シクロホスファミドを 陽 性 対 象 と して 検 定 し た その 結 果 小 核 の 出 現 頻 度 な らびに 赤 血 球 中 に 占 め る 幼 若 赤 血 球 の 比 率 は いずれも 陰 性 対 照 群 と 検 体 投 与 群 との 間 で 有 意 差 を 認 め なかった 3) ではリンフォーマに 対 し て 細 胞 毒 性 を 示 さなかった こ れら のことから 本 菌 株 は 十 分 な 安 全 性 を 示 す こ とを 明 らかとした. 第 二 章 露 地 栽 培 ア ガ リクスの 機 能 性 臨 床 研 究 では A. brasiliensis の Quality of Life (QOL)の 改 善 効 果 を 調 査 することを 目 的 と し て 被 検 食 品 を 12 週 間 連 続 摂 取 するオー プン 試 験 を 行 っ た 登 録 被 験 者 数 は 24 名 と し 摂 取 開 始 から 6 週 後 および 12 週 後 に 体 調 確 認 身 体 測 定 理 学 検 査 唾 液 検 査 特 殊 検 査 の 各 検 査 お よ びアンケート 記 入 を 実 施 した ま た 12 週 目 に は 一 般 臨 床 検 査 ( 血 液 )も 行 っ た その 結 果 抜 け 毛 の 量 白 髪 の 量 疲 労 感 倦 怠 感 目 の 疲 れ 肩 こり 手 足 の 冷 え 日 中 覚 醒 困 難 目 覚 めの 良 さ のスコアが それぞれの 摂 取 前 に 比 べて 有 意 に 改 善 し た これらのことか ら 当 該 食 品 は QOL 改 善 効 果 を 有 す ることを 明 ら かにした 第 三 章 ヒト 抗 β -グ ル カン 抗 体 価 における 露 地 栽 培 アガリクス 服 用 の 効 果 とがん 患 者 に お け る 抗 β -グ ル カ ン 抗 体 の 研 究 で は 当 該 食 品 の 摂 取 に よ る 抗 β -グ ル カ ン 抗 体 力 価 へ の 影 響 に つ い て ELISA 法 に よ っ て 検 討 し た そ の 結 果 1) 健 常 人 は A. brasiliensis の β グ ル カ ン に 対 す る 抗 体 を 有 し て いること 2) がん 患 者 血 清 も 抗 β -グ ルカン 抗 体 を 有 するが, 力 価 の 変 動 幅 が 激 し いこと 3) この 抗 体 は 病 原 性 真 菌 Candida albicans 由 来 の 細 胞 壁 β -グ ルカンと 交 差 反 応 性 を 示 し たことから 抗 真 菌 感 染 免 疫 に 寄 与 し て い る 可 能 性 の あ る こ と 4) 当 該 食 品 を 摂 取 す る と 抗 β -グ ル カ ン 抗 体 力 価 が 上 昇 す ることから 真 菌 に 対 す る 感 染 防 御 能 が 上 昇 す る 可 能 性 があることを 明 ら かにし た 以 上, 本 論 文 は A. brasiliensis の 機 能 性 食 品 と しての 安 全 性 と 機 能 性 について 基 礎 的 ならびに 臨 床 的 視 点 か ら 明 ら かにし, 国 民 の 健 康 寿 命 の 延 伸 や 高 齢 化 対 策 として 有 用 な 機 能 性 食 品 素 材 を 開 発 した.したがって 本 論 文 は 博 士 ( 薬 学 ) の 学 位 論 文 として 相 応 し い 価 値 あ るものと 判 断 する

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