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しらんりゅうとう
7 years ago
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1 Folia Pharmacol. Jpn. 146 実験技術 G 小坂田文隆 1, 2, 3, 4) 要約 : G G 1. はじめに Sydney Brenner C. elegans, Sebastian Seung Winfried Denk, Santiago Ramón y Cajal paired recording - - N Torrey Pines Rd, La Jolla, CA, USA fosakada@ps.nagoya-u.ac.jp Title: From the connectome to brain function: rabies virus tools for elucidating structure and function of neural circuits Author: Fumitaka Osakada

Rd, La Jolla, CA, USA - - - E-mail: fosakada@ps.nagoya-u.ac.

2 実験技術 Jeff Lichtman MRI herpes simplex virus type HSV- pseudorabies virus PRV PRV rabies virus RABV wheat germ agglutinin WGA 2. 脳の構造から機能へ A 3. 狂犬病ウイルスの構造と機能 nm nm G Glycoprotein M Matrix N Nucleocapsid P Phosphoprotein L Large, RNA N P M G L A RNA N RNP ribonucleoprotein RNA N N RNA RNP RNP RNase L P RNA RNA polymerase RNA G G ph M RNP

狂犬病ウイルスの構造と機能 nm nm G Glycoprotein M Matrix N Nucleocapsid P Phosphoprotein L

3 図 1 G 欠損狂犬病ウイルスの神経回路トレーシング法 A: 野生型の狂犬病ウイルス(RABV)は, 軸索終末から逆行性に感染し,シナプスを介してウイルス感染を繰り返す.B:G 欠損狂犬病ウイルス(RABVΔG)は, 軸索終末から一次感染するが,その後の二次感染を起こさない.C: 哺乳類動物に, 鳥ウイルスのエンベロープ EnvA の受容体である TVA を標的細胞に遺伝子導入を行う.D:C の後に,EnvA-RABVΔG を注入すると,TVA 発現細胞に特異的に感染が成立する. 周辺の哺乳類細胞には TVA は発現しないので,EnvA-RABVΔG は感染しない.E: 哺乳類動物に, 鳥ウイルスのエンベロープ EnvA の受容体である TVA および狂犬病ウイルスの糖タンパク質である RABV-G を標的細胞に導入する.F:E の後に,EnvA-RABVΔG を注入すると,TVA 発現細胞にのみに感染が成立し, 感染細胞内で RABV-G が補完されることにより, 新たに形成された RABVΔG が標的細胞に単シナプス結合する入力細胞に感染する. 二次感染細胞には RABV-G が存在しないため,さらなるウイルスの伝播は起こらない. RNA RNP mrna RNP RNA polymerase L P A A mrna N P L RNP RNP RNA RNA N RNP RNP M G RNP mrna RNA

周辺の哺乳類細胞には TVA は発現しないので,EnvA-RABVΔG は感染しない.E: 哺乳類動物に, 鳥ウイルスのエンベロープ EnvA の受容体である TVA および狂犬病ウイルスの糖タンパク質である RABV-G を標的細胞に導入する.

4 実験技術図 2 G 欠損狂犬病ウイルスのゲノムベクター A:RABV のゲノムは N,P,M,G,L の 5 つの遺伝子を持つ.RABVΔG は糖タンパク質 G の代わりに外来遺伝子を発現する.B:RABVΔG のゲノムベクターである psadδg-f3 は Multi-Cloning Site(MCS)を 2 つ持ち, 外来遺伝子を 1 つあるいは 2 つ発現することができる. 4. G 欠損狂犬病ウイルスによる神経回路トレーシング RABV-G, RABV-G G RABVΔG BA RABVΔG RABV-G RABV-G RABV-G G pseudotyping pseudotyping EnvA RABVΔG pseudotyping EnvA TVA EnvA RABVΔG EnvA- RABVΔG TVA C D TVA EnvA/TVA EnvB TVB EnvB/TVB G EnvA/TVA EnvB/TVB RABVΔG E F RABVΔG,

B:RABVΔG のゲノムベクターである psadδg-f3 は Multi-Cloning Site(MCS)を 2 つ持ち, 外来遺伝子を 1 つあるいは 2 つ発現することができる. 4.

5 図 3 G 欠損狂犬病ウイルスの作製方法ステップ 1 では,RABVΔG のゲノムベクター(pSADΔG-F3)に導入したい遺伝子を組み込む.ステップ 2 では,cDNA から RABVΔG を再構成する.pSADΔG-X,pcDNA-B19N,pcDNA-B19P,pcDNA-B19L,pcDNA-B19G を B7GG に遺伝子導入し, 上清を回収する.ステップ 3 では,RABVΔG を B7GG 細胞にて増殖させる. 上清を凍結保存すれば, 必要に応じて凍結した上清から RABVΔG を増殖させることができ, 毎回 DNA から再構成する必要はない.ステップ 4 では,BHK-EnvA 細胞を用いて RABVΔG を EnvA で pseudotyping を行い,EnvA- RABVΔG を作製する.EnvB/TVB システムを用いる際には,BHK-EnvB 細胞を用いて EnvB で pseudotyping を行う.ステップ 5 では, 超遠心を 2 回行うことによりウイルスを濃縮する.ステップ 6 では,RABVΔG は HEK293 細胞を用いて,EnvA-RABVΔG は HEK-TVA 細胞および HEK293 細胞を用いて,EnvB-RABVΔG は HEK-TVB 細胞および HEK293 細胞を用いて力価を測定する. 5. G 欠損狂犬病ウイルスの作製法 RABVΔG cdna EnvA EnvB pseudotyping 1)G 欠損狂犬病ウイルスの再構成と増殖 DNA RABVΔG G psadδg-f Addgene B psadδg-f T promoter RNA RABVΔG G RABVΔG BHK T RNA polymerase RABV-G B GG B GG X psadδg-x pcdna-bn pcdna-bp pcdna-bl pcdna- BG Addgene

上清を凍結保存すれば, 必要に応じて凍結した上清から RABVΔG を増殖させることができ, 毎回 DNA から再構成する必要はない.ステップ 4 では,BHK-EnvA 細胞を用いて RABVΔG を EnvA で pseudotyping を行い,EnvA- RABVΔG を作製する.

6 実験技術 cdna RNA N P L RNP B GG B GG T RNA polymerase T promoter psadδg-f RNA pcdna- BN pcdna-bp pcdna-bl N P L N RNA RNP P L RNA RNA polymerase RNP RNA RNA N RNP RNA RNA polymerase mrna N P M L M B GG G RABVΔG B GG G RABVΔG RABV-G RABVΔG DNA B GG in vivo EnvA pseudotyping 2)G 欠損狂犬病ウイルスの pseudotyping RABV-G RABVΔG VSV-G RABVΔG EnvA pseudotyping RABVΔG EnvA-RABVΔG TVA RABVΔG pseudotyping RABV-G RABVΔG EnvA pseudotyping EnvA BHK-EnvA BHK-EnvA RABV-G RABVΔG EnvA RABVΔG EnvA- RABVΔG RABV-G RABVΔG EnvA- RABVΔG RABVΔG TVA RABVΔGTVA RABVΔG BHK-EnvA PBS wash RABVΔG 3)G 欠損狂犬病ウイルスの濃縮および力価測定 RABVΔG EnvA-RABVΔG cm μl RABVΔG HEK EnvA-RABVΔG TVA HEK-TVA EnvA-RABVΔG HEK RABVΔG HEK EnvA-RABVΔG RABVΔG pseudotyping 6. 哺乳類における in vivo への適用 RABVΔG in vivo, RABVΔG GFP

pseudotyping RABV-G RABVΔG EnvA pseudotyping EnvA BHK-EnvA BHK-EnvA RABV-G RABVΔG EnvA RABVΔG EnvA- RABVΔG RABV-G RABVΔG EnvA- RABVΔG RABVΔG TVA RABVΔGTVA RABVΔG BHK-EnvA PBS wash RABVΔG 3)G 欠損

7 図 4 G 欠損狂犬病ウイルスを用いた神経回路解析 A:RABVΔG トレーシング法を用いると, 特定の神経細胞に入力する細胞群を同定し, 神経回路を可視化できる.B:RABVΔG トレーシング法と二光子顕微鏡イメージングを組み合わせることで, 神経接続を持った細胞群の神経活動を評価できる. 例えば, 大脳皮質視覚野において,どの角度の線分に強く反応するかを調べ, 神経回路を構成する全てのニューロンの反応特性を明らかにすることできる.C:RABVΔG トレーシング法と optogenetics を組み合わせることで, 神経接続を持った細胞に摂動を与えることができる. 例えば, 特定の入力細胞の神経活動を特定のパターンで活性化あるいは不活性化した際の,ポストシナプス細胞の応答などを調べることができる. ChR,, B RABV-G EnvA/TVA EnvB/TVB E FA parvalbumin PV PV Cre PV-Cre Cre TVA RABV-G AAV-DIO AAV EnvA-RABV ΔG-GFP EnvA-RABVΔG- GFP TVA PV RABV-G PV GFP Cre Cre TVA RABV-G TVB EnvB pseudotyped EnvB-RABVΔG TVB EnvB-RABVΔG, TVA RABV-G, RABVΔG B D FA RABVΔG GFP GFP B

例えば, 大脳皮質視覚野において,どの角度の線分に強く反応するかを調べ, 神経回路を構成する全てのニューロンの反応特性を明らかにすることできる.

8 実験技術 RABVΔG GCaMP R-CaMP GCaMP RABVΔG-GCaMP AL V GCaMP Boptogenetics chemogenetics ON/OFF C RABVΔG channelrhodopsin archaerhodopsin allatostatin receptor PSAM/GlyR rtta Cre ER T CreER T FLPo RABVΔG RABVΔG optogenetics 7. 最後に optogenetics, RABVΔG 著者の利益相反 : 文 Callaway EM. Curr Opin Neurobiol. ;: -. Osakada F, et al. Nat Protoc. ; :-. Wickersham IR, et al. Neuron. ;: -. Osakada F, et al. Neuron. ;: -. Schnell MJ, et al. EMBO J. ;:-. Mebatsion T, et al. Cell. ;: -. Etessami R, et al. J Gen Virol. ;:-. Wickersham IR, et al. Nat Methods. ; :-. Nhan HL, et al. J Comp Neurol. ; :-. Wall NR, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. ; : -. Choi J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. ; : -. Choi J, et al. J Comp Neurol. ; :-. Marshel JH, et al. Neuron. ;: -. Rancz EA, et al. Nat Neurosci. ;: -. Osakada F, et al. Biol Pharm Bull. ;: 著者プロフィール献

EMBO J. ;:-. Mebatsion T, et al. Cell. ;: -. Etessami R, et al. J Gen Virol. ;:-. Wickersham IR, et al. Nat Methods. ; :-. Nhan HL, et al. J Comp Neurol. ; :-. Wall NR, et al.

表1.eps

表1.eps Vol.1 C ontents 1 2 cell-free EMBO J Proc. Natl. Acad. Sci. USA NatureEMBO J 3 RNA NatureEMBO J Nature EMBO J 4 5 HCV HCV HCV HCV RNA HCV in situ 6 7 8 Nat Struct Mol Biol J Biol Chem Nat Commun J Virol