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けいざぶろうかつもと
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1 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by

2 この講演記録は第 1 5 回日本遺伝子診療学会大会イブニングセミナーにおいて発表された内容資料を ( 株 ) ファルコバイオシステムズがお客様向けに翻訳したものです Dr. Jan P. Schouten Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. 座長の松原先生 ( 東北大学医学部遺伝病学分野 ) ご紹介いただきありがとうございましたそしてここにお招きくださり MLPA 法の技術についてさらなる詳細を話す機会を与えてくださった主催者の方々に感謝いたしますこの日本での素敵な休日と仙台までの旅を一緒にできた私は非常に幸運です家族と一緒に私は美しい都京都から九州の温泉そして広島の宮島と旅行をしてきました松本の美しい自然も見てきましたさらに富士山では日の出の瞬間まで経験しそして最後に東京と仙台の街並を見物してきたわけです私達にとってこの旅行は非常に楽しいものでしたまた私達は日本の美しさとともに日本の人々が友好的で親切にもてなしてくださることにも感銘を受け日本に来ることができて本当に良かったと思いましたまた私はこれまで分子生物学の世界に長くいられたことを非常に幸運だと思っています最初にクローニングの技術ができた時私はアムステルダム大学の学生でしたそしてはじめて DNA シークエンシングが行われた時はじめてサザンブロット法が確立した時そしてまた今やはじめてヒトのゲノムが完全に公開され入手可能になったこの非常に興味深い時にこの分野にいられることを幸運だと感じているのですまた今から数年後には 1,000 人分もしくはそれ以上の完全ゲノム配列にアクセスができるようになり DNA 配列について何が正常で何が異常なのかの概観をつかむことが可能となるかもしれません今非常に大切な時期だと私は思いますそれは今こそ過去 1970 年代から現在に至るまでに得てきたこの知識の全てを遺伝性疾患だけではなくまた特にがんの診断法など遺伝子解析の発展に貢献できる製品に形を変えていく時期であるからなのです私は私達の MLPA 法技術を用いてまた私達の会社 (MRC-Holland 社 ) として何か役に立つことをしたいと思っていますこの会社は 1985 年に設立されて既にずいぶん経ちます私達は酵素や核酸の分野に長年取り組んできました私達はたくさんの様々な技術を開発してきましたが研究ではよくあるようにその大部分は有用なものではありませんでした利用できるものが時には 1 つであったり全くなかったりするでしょうが 10 も新しいことを開発すればちょっとした成功です 1

3 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 1 MLPA 法が成功しまたそれが今年は 100 万人以上の患者検体に用いられていることや 75 ヵ国以上の異なる国々また日本でも多くの研究者に利用されているということで私達は非常に幸運でした松原先生が先ほどおっしゃったようにこれは 2002 年に私が最初に発表しそこから先世界中に広まったのです私達は全く宣伝を行っていませんが過去 6 年間では MLPA 法の有用性ついて記述された 500 以上の学術論文が報告されていますそれらの文献がこの方法論や私達の製品の広告となりそしてそれが世界中に広まっていったというわけです 2002 年以降毎週また時には毎日のように新たな応用法についての要望が私達に届いていますそして私達はできるだけ多くその要望にこたえようと努力しています結果として現在主にヒト遺伝学の分野また分子細胞生物学の分野に MLPA 法が応用された 250 以上の異なる製品が作られておりますそして将来的にはがんの鑑別診断やファーマコゲノミクスまた他の分野も網羅できることを期待しておりますスライド 2 MLPA 法とは何でしょうか? 実は MLPA 法はマルチプレックス PCR の一種といえます MLPA 法では患者サンプルとコントロール用のサンプル双方でマルチプレックス PCR を行いそれらを比較しますこれら 2 つのサンプルのピークの高さまたはピーク面積を比較するといくつかの差があることがわかりますこの症例におけるこれらの差は APC 遺伝子のエクソンにおよぶ欠失によるものです MLPA 反応は様々な異なる遺伝子に設計されたプローブのセットを用いて行いますがそれらは私達の会社から購入可能です例えば APC 遺伝子などのある特定の遺伝子の全エクソンのそれぞれに対するプローブを含むものも入手が可能ですしかしとあるプローブは例えば染色体の各サブテロメア領域またはセントロメア領域もしくはそれぞれ異なる染色体腕上に座位する多くの異なる遺伝子にも設計されていますそして各プローブの設計領域についてはそれぞれ個別にコピー数を決定することができますしたがって今のところ MLPA 法はマルチプレックスなコピー数解析が主な用途となっています 2

4 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 3 M L P A 法を用いると 1 回の反応でゲノム D N A 配列のコピー数変化を最大 50 まで検出することができます後ほどお話しますが MLPA 法はまた mrna 発現のプロファイリングやメチル化状態の判定にも用いることもできるのです MLPA 法は既知の変異の検出にも用いることができますがダイレクトシークエンス法や DHPLC 法のような点突然変異検出法の代わりとして用いることができるような方法ではありませんそれらの手法に付け加えて行ったり補助的な用途で有用していただくための方法ですダイレクトシークエンス法や dhplc 法といった方法論では細胞中にまだ正常アレルが 1コピー分存在している場合もう片方のアレルでは生じている遺伝子の部分的もしくは完全な欠失を検出することはできないでしょうまた MLPA 法においては必要な DNA は少量ですしそして非常に重要な点としては他の多くの手法では困難な 1 塩基単位の配列の違いも識別できるということです一般的な PCR 法では遺伝子と偽遺伝子を見分けるのは困難な場合がありますスライド 4 MLPA 法に用いる機器はほとんどの研究室にありますし私達が機器を売る必要はありませんのでそれが大きな助けとなっています事実私達は現在 MLPA 法を使用している研究室についてはすべからく訪問して案内対応する必要性はありませんでしたとても簡便なプロトコールでシンプルな手法でありますので試薬を私達かもしくは代理店から購入するだけですぐに使用することができるのです 3

5 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 5 では MLPA 法の原理はどのようなものなのでしょうか? MLPA 法は一般的な PCR 法とは異なり検体中の核酸の増幅は行ないません DNA サンプルに添加されたプローブだけを増幅するのです各プローブは 2 本のオリゴヌクレオチド鎖で構成されますがそのうち 1 本はリン酸化されていますそれらは隣り合うようにしてサンプル DNA 上に即座に結合しますそれら双方がサンプル DNA にハイブリダイズすることでライゲーション反応による連結化が可能になりますそしてプローブが一旦ライゲーションされると青いタグのプライマー配列部分になりますがそれらを用いた PCR 増幅が可能になります MLPA 反応においては 50 までのそれぞれ異なるプローブ全てが同じ一組の PCR プライマーで増幅されますそれにより相対的にみて非常に安定性のあるマルチプレックス PCR のシステムを開発することができたのですスライド 6 このスライド上では 2 つの異なるプローブが確認できますがそれらはこのようにそれぞれの標的配列に対しハイブリダイズします結合配列が異なることに加えてそれらにはもう一つ違いもあります各プローブのそれぞれが増幅してできる産物の長さが異なるということです私達の製品においては最も鎖長の短いプローブですと約 130 ヌクレオチドの増幅産物が得られますそして最長のプローブの場合は 500 ヌクレオチドに近い増幅産物となりますそれら全ての増幅産物はキャピラリー電気泳動によって非常に良好に分離されますまた患者サンプルとコントロール用のサンプルとでそれぞれから得られる PCR ピークのプロファイルを比較すると患者サンプルにおける各領域の量的な差がわかるようになるのですこの手法は全体的にいって非常に操作が簡単ですまず DNA を変性させます次にプローブを加えそのプローブを一晩の間ハイブリダイズさせますそして次の日の朝プローブをライゲーションさせるのですそれから PCR 法によってライゲーション産物の増幅を行いその後その PCR 産物を電気泳動で分離しますですから 24 の異なるサンプルを試験するとしても手技にかかる時間は合計でも 2 時間以内となります 4

6 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 7 プローブが PCR 増幅されるためにはそれらのライゲーション反応を必要しますのでライゲーションサイトにおける 1 塩基のミスマッチやプローブ配列とサンプルの配列間のどこかで 1 塩基の相違があるとライゲーション反応が抑制されることで増幅産物の生成が容易に阻害されてしまいます多くの用途においては解析対象の遺伝子なのか相同遺伝子なのかもしくは偽遺伝子なのか識別できることが非常に重要となります特定の点突然変異を検出するためにおいてもそうですが MLPA 法が1 塩基変異に対する感度を持っている理由はその理屈からくるのですライゲーションサイトでミスマッチがあると増幅産物は生成されません完全に一致する場合にライゲーション産物が得られそして増幅産物が生成されるのですスライド 8 スライド 9 このスライドでは遺伝子の全欠失がみられるサンプルをお示ししています ASPA 遺伝子ですがそれは 6 つのエクソンのみで構成されていますホモ欠失のサンプルでは ASPA 遺伝子特異的なピークはまったくみられませんこのスライドではプローブによって検出され得る領域がまったく存在しない場合にはそのバックグラウンドも非常に低くなることがわかります 5

7 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 10 スライド 11 さらに MLPA 法では 1 細胞中において遺伝子が 0 コピーなのか 2 コピーなのかを識別できるだけではありません特に非常に重要であることは 1 コピーから 2 コピーの識別ができるという点ですしたがってプローブが標的とする領域のヘテロ接合性の欠失を検出することができるのです実際にある特定の配列からそれが 0 コピー 1 ~ 3 コピーであるのかもしくは 4 コピーであるかさえ非常に良好に識別することができまた 1 回の反応で 50 の異なる配列に対してそれが可能なのですさすがに 10 や 11コピーもの識別については信頼性はありませんがほとんどの用途においてはそれは必要ではないでしょうもちろんがん組織における遺伝子増幅も検出することが可能ですが強度に遺伝子増幅が生じている場合ですと正確なコピー数は必ずしも容易には決定できませんとはいえ MLPA 法によれば 1 細胞中における遺伝子が 0 コピー 1 ~ 4 コピーなのかについては容易に識別ができます先ほどお話したように MLPA 解析のプロトコールは非常に簡単ですまず DNA を変性させプローブを添加し一晩の間ハイブリダイゼーション反応を行った後 15 分間のライゲーション反応を行いますそれから PCR 増幅を行いキャピラリー電気泳動を行いますそして最後にその結果の分析を行う必要がありますスライド 12 一般のマルチプレックス PCR 法と比較して MLPA 法はずっとより安定した結果を出せるシステムですハイブリダイゼーション反応においては過剰のプローブを使用しますので反応温度や時間に多少の差があってもそれによるピークパターンへの影響はありません PCR 反応にも一組の共通プライマーしか使用しませんので反応条件の差による変化も軽微です 6

8 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 13 また MLPA 法ではピークの高さや面積を相対的に比較して解析するだけですので反応ごとで必ずしもそれぞれ同じ DNA 量を用いる必要もありませんとあるサンプルでは DNA50ng また他のサンプルでは 200ng または 500ng であってもそれらを比較することができるのですしかし一方で大事なことは後ほどそれについてはお話しますが一般の PCR 法と比較して DNA の質がより重要となります MLPA 法では DNA サンプル中の不純物や DNA サンプルの精製法の違いにより敏感なのですそれが原因で異なる研究室で精製された DNA サンプルでは比較が困難な場合があるのですスライド 14 MLPA 法のいくつかの応用例としてはコピー数解析用のプローブと既知の突然変異を検出するためのプローブを一緒に組み合わせることがとても有用となりますこのスライドでお示ししておりますように野生型ではなく逆に変異特異的なプローブを点変異の検出に用いることができますスライド 15 私達のスタート地点でもありましたが現在 MLPA 法の主な用途は遺伝子変異の検出ですみなさんご存じのようにダイレクトシークエンス法 DHPLC 法や新規技術である高感度融解温度曲線解析 (HRM:High Resolution Melting temperature analysis) などが点変異検出用の技術として主に使われていますしかしながらこれらの技術では正常アレルがまだ片方で存在している場合全てのエクソンそれぞれについてそのコピー数変化は検出できませんし遺伝子の全欠失であっても検出ができませんまたそれらはたいていの場合欠失 / 重複変異の規模が検出限界より小さすぎて FISH 法は用いることができません遺伝子を分断させるような欠失や重複変異の多くは 10kb より小さく一方 FISH 用プローブは 100kb の規 7

9 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. 模にも及びます FISH 法はまたマルチプレックスな技術としては現実的ではありませんしたがって遺伝子を不活性化させるような欠失や重複変異の規模が小さいものについては FISH 法で検出するのは非常に困難ですリアルタイム PCR 法は小規模のコピー数変化に対しては感度が低いですし現実的なマルチプレックス法ではありません例えば DMD 遺伝子の 79 エクソン全てに対して欠失変異のスクリーニングを行なうためにはリアルタイム PCR 法では実に多くの異なる試験を行うことが必要となるでしょう遺伝子を不活性化させるような欠失 / 重複変異の頻度に関しては様々な遺伝子ごとで大きく異なりますある遺伝子では検出される全ての変異の 2% または 5% にすぎないこともありますがこれは点変異がずっと多くみられるためですしかし MSH2 遺伝子や SPAST 遺伝子または Parkinson 遺伝子の主要なものについては 20% またはそれ以上で検出される場合もありますそして巨大な DMD 遺伝子については点変異よりもエクソン単位の欠失や重複変異がより頻度が高く全患者の 65% においてその原因としてみとめられますですから私達は研究者の要望にこたえて多くの異なる遺伝子を対象としたプローブミックスを開発してきました私達は今でも新しい遺伝子についての要望を受けていますししばしば稀少疾患に関係する遺伝子についての要望も受けますこのようにして私達は多くの新しい MLPA 製品の開発を続けています強調したい点が 1 つありますがこれは私の考えですが患者それぞれに対してゲノムワイドなスクリーニング方法を用いるよりもむしろ異なる疾患それぞれに対して製品が個別に分れているということが非常に重要であるということですある人が自分の家族に大腸がんの遺伝的な素因がみとめられる可能性があるため検査を受ける場合調べようとしている以外のことは知りたいとは思わないでしょうパーキンソン病の素因を持っているのかまたは若年性アルツハイマーの素因があるのかあえて知りたいとは思わないでしょう仮にそれらがあったことがわかったとしてその事実に耐えるのは非常に難しいことですですから皆さんが検査を行うなら皆さんが知りたい特定の遺伝子についてのみ特化された遺伝子検査を用いるべきなのですルーチン的な検査の場合は皆さんは不必要な情報をたくさん得ようとは思わないでしょう私の考えでは今ますます使われるようになったマイクロアレイ法は研究分野においては完璧なツールです私はそれらが将来的にはさらに広く用いられそこからより多くの事実が得られるようになることを望んでいるのですしかし DNA 検査室での一般的な用途においてはよりシンプルな技術が必要なのですマイクロアレイ法をルーチン検査として使用するにしてもその資金もありませんし全てのアレイ実験の結果を正確に解釈できる専門家は多くないと思いますしたがって私の考えでは特定の疾患に関する遺伝子のみを対象としたより多くの個別に特化された検査が必要だと思いますスライド 16 これは典型的な遺伝子欠失の例ですがこの例では難聴遺伝子を扱っています GJB3 遺伝子欠失により 4 つのプローブのピーク高が 50% の減少を示しています実際にこれはこの遺伝子で頻繁にみられる変異でその他の手法ではなかなか検出されないものとなっているのです 8

10 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 17 スライド 18 MLPA 法のもう 1 つの主な応用法は特に精神遅滞がみられる小児の微細欠失症候群における解析です私達は 21 の異なる微細欠失症候群を 1 つの MLPA キットに組み合わせましたしまたマイクロアレイ法を用いた研究で昨年発見されたばかりの微細欠失症候群もいくつか組み込みましたこれら新規の症候群では多くの症例で明確な表現型がありません私達はこれを精神遅滞がみられる全ての小児に対し最初に行う検査の 1 つとして推奨していますこれは 21の異なる微細欠失症候群がカバーされた一般的なキットである P245 キットですがこれにより微細欠失が検出された場合は別の二次的な MLPA 解析で追加確認することができます特定の微細欠失症候群ごとでより多くのプローブが適用されている個別の MLPA キットがあるのです同様に特に精神遅滞のみられる患者においてサブテロメア欠失におけるコピー数変化を検索することもできます各サブテロメア領域全てについてそれぞれ 1 つずつプローブが設計されている P036 P070 という 2 種類のプローブミックスがありますこれらは DNA をサンプルとしてサブテロメア領域の構造変異の初発のスクリーニング検査として用いられていますこの初発のスクリーニングの後陽性が出ればその検体はいくつかあるサブテロメア領域確認用のプローブミックスを用いて追加確認が可能です例えばこれらのプローブミックスの 1 つでは 9q 10q 11q 12q 領域にそれぞれ 10 ほどのプローブが組み込まれていますこれらの追加確認用のプローブミックスを用いることでサブテロメアの欠失 / 重複変異の範囲についての情報がさらに得られるのですしかし陽性サンプルに対してこれらの確認用プローブミックスを使用する場合であっても別のサブテロメア領域のスクリーニング検査を追加で行うことをおすすめします健常者であってもサブテロメア領域にはコピー数多型が多くみられますのでこれは非常に一筋縄ではいかない方法ですしたがって私達は変異陽性例においては両親にも検査を行うことをすすめていますこどもに何か変化をみつけた場合それが 1Mb または 2Mb もしくはそれ以上の欠失変異の場合であってもそれが真に de novo の変異なのかの確認をしてみてくださいなぜなら健常な両親であってもいく例かは大規模な欠失 / 重複変異がみつかることがあったからですサブテロメア領域用のプローブミックスと同様にセントロメア領域用のプローブミックスがあります例えばそれらはマーカー染色体を指標としたサンプル解析に対して用いられています 9

11 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 19 その他の MLPA 法の用途で非常に重要であるものとしては脊髄性筋萎縮症 (Spinal Muscular Dystrophy; 以下 SMA) における保因者のスクリーニングです SMN1 遺伝子と関連遺伝子である SMN2 遺伝子とはわずか1 塩基の違いしかありません SMN2 遺伝子は実際には偽遺伝子ではありませんがその活性はずっと低い SMN 関連遺伝子ですしかしながら保因者のスクリーニングにおいてはこれら SMN1 および SMN2 遺伝子を識別することが重要なのですスライド 20 そしてこのスライドでお示しのように P060 という特別なプローブミックスがありますがこれは SMA の保因者スクリーニング用で SMN1 遺伝子を定量的に解析するものです (SMN2 遺伝子は解析できません ) 保因者スクリーニングで唯一本当に重要なプローブは SMN1 遺伝子のエクソン 7 を対象としたプローブでありますが SMA 保因者ではこれが 2 コピーから 1 コピーに 50% 減少しますこの疾患については人口の 2 ~ 3% で保因者が存在するのですがいくつかの国では全ての妊婦で SMA 保因者検査が病院で提供されていますもしその女性が保因者であるとわかればその夫も検査がなされそして両親のどちらも保因者の場合必要とされれば出生前診断が提供されますスライド 21 SMA 患者の検査については SMN1 遺伝子だけでなく SMN2 遺伝子のコピー数を解析できる異なるプローブミックスがあります SMN2 遺伝子のコピー数が疾患の進行度合に大変影響するためこの疾患リスクを持つ新生児にとってはそれを知ることも非常に重要なことなのです 10

12 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 22 スライド 23 その他の MLPA 法の重要な用途としてはインプリンティング領域の解析です最初の方で少しお話したように MLPA 法はメチル化解析にも用いることができますがそれがどのような仕組みになっているのかはこの後で説明します MLPA 法には Prader-Willi/Angelman 症候群また Beckwith- Wiedemann/Silver-Russell 症候群を対象としたプローブミックスがありますこれらの症候群に関してヨーロッパでは MLPA 法は現在最も多く用いられている検査手法ですし私達のキット製品は米国やその他の地域でもその利用が増加してきてもいますこれらは両親に検査結果が伝えられるまでに必要な時間がより短くて済むので非常に有用だと思っています多くの国々ではこれらの疾患の検査結果が医師から両親へ伝えられるのに数ヵ月を要しておりますそれはサザンブロット法で検査が行われていたりまた患者のサンプルがいくつか集まってから検査室がこれらの検査を開始したりしているからです MLPA 法であれば患者 1 人だけまたは 1 組ないし 2 組の患者の検査であっても行えますし検査そのものも大変な作業ではありません将来的に私はファーマコゲノミクスやがんの診断でさらに多くの応用ができることを期待していますがまた微生物学といった分野への応用法もあります私達は現在サルモネラ ( チフス ) 菌や結核菌群の識別に用いられるプローブミックスを開発中です MLPA 法は実にベーシックな方法ですから獣医学分野への応用などその他さらに多くの分野への応用が可能です私達はいくつか新しい応用法への要望を毎週受けていますし少なくとも 1 週間に 1 つはその実現ができるよう努力をしています結果として現在は新しい製品が 1 つは毎週出ているのです Web サイトには約 250 の製品が出ていますがその他とある特定の研究室で検討中であったりまたは現在開発中の製品があと 100 ありますスライド 24 がんの診断領域のお話ですがこのスライドは ERBB2 遺伝子の増幅を示す乳がんサンプルの典型的な結果を示していますこの P004 プローブミックスには ERBB2 遺伝子を対象とした 3 種類の異なるプローブが含まれていますこの 3 つのプローブ全てが ERBB2 遺伝子の増幅を示していますその他のプローブについては ERBB2 遺伝子付近の他の遺伝子についても増幅を示してはいますがまた同じく TOP2A 遺伝子については増幅を示していません例えばオランダのがん協会などでは患者に対する最良の治療を決定する上でこういった結果を用いております 11

13 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 25 ERBB2 遺伝子領域に加えて P004 プローブミックスには乳がん患者の治療に対して重要となる他の多くの遺伝子も対象として組み込まれていますこのスライドは別の乳がん組織において同じ P004 プローブミックスを用いて得られた結果を示していますこれはがん組織に BRCA1 遺伝子の欠失がみられた患者でつまりその疾患の遺伝的な原因が示唆されるということを示しています同様に BRCA2 遺伝子についてもまたその他の重要な遺伝子についても同じプローブミックスに対象として組み込まれています可能な限り最良の製品を共に開発するためには MLPA 法のユーザーと私達の会社との意思伝達が大切だと思います私達が取り組んでいる全ての分野の専門家になることはできません私達は全ての遺伝性疾患または微細欠失症候群と同様に出生前診断がんの全種類結核菌のどれをとってもその専門家ではないのですこれらの製品は全てユーザーと私達の共同で開発してきましたそしてもし皆さんにいい考えがあったりアドバイスがあったりすれば遠慮せずに私達に e- メールでアドバイスをください皆さんのお考えを教えて欲しいと思いますスライド 26 MLPA 法の利点は品質管理が比較的簡単であるということですまた構成試薬は全て液体でそれらの生産のバッチサイズはかなり大きくすることができますさらに全てのプローブミックスには反応の塩梅をみることができる異なるコントロール用プローブが含まれていますまた私達は将来人工の陽性コントロールサンプルも供給できれば望ましいと思っております既知の欠失 / 重複変異がみられる患者サンプルを得ることはとても困難ですしまた顧客にそのようなサンプルを配ることはできませんそれで私達は現在人工的なコントロール試料についての取り組みをしているのです 12

14 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 27 スライド 28 プローブミックス中に含まれるコントロールプローブのいくつかをここにお示ししますそれらは実際の解析対象となる増幅産物より短いフラグメント位置にピークが出ますたいていの場合実際の解析対象となる増幅産物は 130 ヌクレオチドから始まって最大約 500 ヌクレオチドまで続きます 1 つのプローブミックスでは最大 50 までのプローブを組み込むことができますが実際の解析対象となる増幅産物の短いフラグメントの側に異なるコントロールプローブのフラグメントが位置していますと 82 ヌクレオチドの 4 つの短いフラグメント (Q- フラグメント ) は添加した DNA サンプル量の指標となりますそれらはほとんど見えないこともありますがそれは十分な DNA 量が添加されたときですしかし DNA 量が不十分なときはそれらが顕著にあらわれてきますので注意となります 2007 年以降は DNA サンプルの変性が不完全であった場合に顕著となるコントロール (D-フラグメント ) も加えていますスライド 29 そして最終的に 2008 年の初頭から X または Y 染色体に特異的なコントロールを追加していますこのスライドでは女性のサンプルなので Y 染色体のプローブシグナルは無く X 染色体プローブのシグナルのみがあらわれています 13

15 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 30 現在私達は多くの様々なプローブミックスを販売しておりますがしかしもちろん多くの人は研究目的で MLPA 法を用いたいと考えておりますしまた私達の会社の市販製品には頼ろうとしない人も多いのです当然 MLPA 法を全くの研究用途で用いることは可能です私達はプローブの調製に関して特殊な方法を持っていて増幅産物の非常に長いプローブの生産も可能なのですが一方で複雑な方法で作らなければなりません全てのプローブについて私達は M13 ファージ DNA にクローン化していますそしてこの M13 ファージ DNA から 1 本鎖 DNA を調製しますこの DNA は制限酵素消化して調製しますその開発行程には時間がかかり高い費用もかかりますしかしそのおかげで 1つのプローブミックスの中でたくさんの異なるプローブを用いることができるようになるのですそして現在では約 10,000 のプローブをフリーザーに保管していますこれらは素晴らしいコレクションではありますが研究を行う上ではまだ十分なものではありません研究目的での用途においてはそれぞれの研究室で合成の MLPA プローブを用いることで独自のものを用意することができます高品質のオリゴヌクレオチドを提供している会社ならどこからでも可能ですが全プローブについて 1 領域あたりそれぞれ 2 つずつの合成オリゴヌクレオチドを注文するだけのことですこれを使用した経験のある方の1 人が松原先生で丁度うかがったのですが GLDC 遺伝子用のプローブをご自身で開発されたそうですこのように各々の研究室でそういったことが可能なのですプローブの設計に必要な情報の全ては私達の Web サイトに掲載されていますしかし合成オリゴヌクレオチドのプローブには品質的な限界があります長鎖の合成オリゴヌクレオチドとなると私達が行っているような M13 ファージ DNA 由来のオリゴヌクレオチドよりも品質が落ちるのですこのことが理由で合成オリゴヌクレオチドプローブの長さは約 90 ~ 160 ヌクレオチドに限定されるのですがその範囲ですとおそらく 15 から 18 ぐらいの異なるプローブが設計できます私達は最近 P200 と P300 というプローブミックスの販売を開始しましたがこれに皆さんが独自で作成した合成プローブミックスを加えることができるようになっていますこれら P200 P300 プローブミックスに含まれるプローブは全てリファレンス用でまた DNA 量を検定できるコントロール用のプローブ (Q-フラグメント ) も含まれていますスライド 31 合成 MLPA プローブの例がこちらです太字の部分が PCR プライマー用の配列を表していてその隣からがサンプル DNA にハイブリダイズする配列ですそして私達の Web サイトにある設計ルールにしたがっていただければこれらの合成 MLPA プローブの設計は非常に簡単です 14

16 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 32 例えばこの P300 プローブミックスにご自身の合成プローブを加えることができます P200 についてもまったく同様ですが P200 にはこのスライド上の矢印が示している 5 つのプローブは含まれません 86 ヌクレオチドと 175 ヌクレオチドの間は完全に空いていますですからそこにはかなり多くの合成プローブを加えることができますスライド 33 またこれらのプローブミックスには DNA 量の指標となるコントロール用のプローブ (Q-フラグメント) も含まれていますサンプル DNA を全く加えずに反応させた場合はこれら 4 つのプローブシグナルのみが認められますサンプル DNA がまったく存在しないかもしくはサンプル DNA の量が不十分な場合はそれらが顕著にあらわれてくるわけですスライド 34 P200 および P300 プローブミックスには X 染色体または Y 染色体を対象としたプローブが含まれていますさらに DNA の変性が不完全な場合の指標となるプローブ (D-フラグメント ) がそれらには含まれていますゲノムの領域の中には特に CpG アイランドなど他の領域と比較して非常に変性が困難な領域がありますのでこれらはコントロール用プローブとして有用です 15

17 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 35 サンプル中の塩濃度が高かったりまたは鉄やマグネシウムイオンの量が少ない場合 CpG アイランドが完全に変性されないことがしばしばあります TE や水に溶かした DNA で変性を行う場合は全く問題ありませんしかし例えばサンプル中の塩化ナトリウム濃度が 80mM であったりもしくは塩化マグネシウムが 0.2mM とか少量の場合サンプル DNA の 98 熱変性が不完全となり CpG アイランドに設計されたコントロールプローブのシグナルが低下しますスライド 36 DNA コピー数解析の用途のご紹介に続いてこれからメチル化の定量に関する MLPA 法 (MS-MLPA) の応用例についてご説明したいと思いますメチル化の定量については 2 つの重要な分野への用途があります第一には例えばがん抑制遺伝子のプロモーター配列の転写制御に関わるメチル化です第二には Prader-Willi/Angelman 症候群の責任領域である染色体 15 q11 領域や Beckwith-Wiedemann 症候群の責任領域のようなインプリンティング領域に関る DNA のメチル化などですスライド 37 メチル化解析のプロトコールは一般的な MLPA 法のものにとてもよく似ていますそれは非常に簡単ですしそしてそれによってメチル化についての情報だけでなくコピー数変化についての情報も得られますいくつかの用途においてはその性能があることは非常に重要なものとなります例えば Prader- Willi/Angelman 症候群では症例の大部分はコピー数変化によるものですが最大 30% 程度がメチル化状態の変化によるものとされていますですから特にこれらの疾患では両方の解析を行うことが不可欠なのです 16

18 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 38 メチル化解析で特別に行っている操作としては MLPA 反応だけでなくメチル化感受性の制限酵素消化も行っていることですそしてこの制限酵素消化はサンプル DNA に対して行うのではなくサンプル DNA とプローブのハイブリッドに対して行います実際にはライゲーション反応と制限酵素消化は同時に一緒に行われますではなぜそうするのかということについてお話しします一般的な MLPA 法とごく同様にまずサンプル DNA の変性処理を行いその後プローブを加え一晩の間ハイブリダイゼーション反応を行います次の日の朝からは反応行程は 2 つに分かれます 1つは一般的な MLPA 法とちょうど同じようにライゲースで処理する行程ですこの反応によりコピー数変化の情報が得られますもう 1つはライゲースと HhaⅠ HpaⅡといったメチル化感受性制限酵素を用いて反応させる行程ですサンプル DNA がメチル化されていればハイブリッド形成された配列はメチル化感受性制限酵素では切断されませんそして 2 つのプローブはライゲーションされ PCR 増幅可能な DNA 断片となるのですしかしサンプル DNA がメチル化されていなければ添加された制限酵素がプローブとサンプル DNA のハイブリッドを切断しますそして結果として PCR 増幅され得る DNA 断片が形成されないのですこのプロトコールにしたがえばホルマリン固定組織やパラフィン包埋組織から抽出された DNA についてもメチル化状態の変化が検出できますこの種の組織から抽出した DNA はしばしばそして少なくとも部分的には変性しています DNA 変性が起こっていると制限酵素による切断ができませんしかしプローブとサンプルでハイブリッドを形成することで DNA を二重鎖にするとそのサンプル DNA がメチル化されていなかった場合には切断が起きますスライド 39 このスライドはがん抑制遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態の測定試験を行った場合それがどのような感じに見えてくるかを示したものです私達の使用するプローブミックスには用いられる HhaⅠ 酵素の認識部位をもたないリファレンス用のプローブがいくつか含まれていますこれらのプローブについては制限酵素消化の有無に関らずシグナルが生成されますこれらのリファレンス用プローブの間にはこの酵素の認識部位を有するその他のプローブがありますがこれらはがん抑制遺伝子のプロモーターの CpG アイランドに対して設計されていますおわかりのように血液由来の DNA を用いた場合はこれらのプローブは完全に消化されそして結果としてプローブのシグナルは完全に消失していますこれは血液由来の DNA においてはこれらの領域がまったくメチル化されていないからです 17

19 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 40 しかし MS-MLPA 反応において血液から得た DNA とがん組織から得た DNA とで比較しますとこのスライドの場合はリンパ腫の検体なのですががん抑制遺伝子のプロモーター配列に特異的なプローブに関してピークがあらわれているのがおわかりでしょうそして DLBCL25 の場合は 4 つもの異なるピークが現れていますこれはこの特殊なサンプルにおいては 4 つの遺伝子についてそれらのプロモーター領域がメチル化されていたからなのですこういったものは例えばがんの再発スクリーニングなどがんの診断に有用化できます私達は現在尿から分離させた細胞中の DNA メチル化状態の変化を指標にして再発膀胱がんが検出できるような検査の開発に取り組んでいますスライド 41 MS-MLPA 法のもう 1 つの用途はインプリンティング領域の解析ですこの症例ではインプリンティングされた染色体 15q11 領域の解析を行っています制限酵素反応を行っていない場合と行った場合とで比較をするといくつかのプローブについてシグナルがおよそ 50% に減少していることがわかります矢印で示されているプローブは全て MS-MLPA 用で染色体 15q 領域のインプリンティング領域上に設計されておりそれらのシグナルは制限酵素反応時には 50% まで減少しますその理由はこれらの領域はインプリンティング領域であり正常細胞中では父親由来のアレルはメチル化されており一方もう片方のアレルつまり母親由来の方はメチル化されておらず 1 コピー分のシグナルしか得られないからですこの 50% のシグナルの減少は健常者由来の DNA ではみられますが Prader-Willi 症候群の患者由来 DNA で解析するとそのいくつかについては両アレルともメチル化されている状態のため MS-MLPA プローブがまったく制限酵素消化されませんそして Angelman 症候群の患者由来 DNA で検査すると染色体 15q11 領域のメチル化特異的なプローブのシグナルは完全に消失しますそれはサンプル DNA 中の両アレルともが非メチル化状態のためですこの Prader-Willi/Angelman 症候群検査用の ME028 プローブミックスにはがん抑制遺伝子のプロモーター領域に設計された制限酵素消化に関するコントロール用のプローブが含まれていますこのスライドで * 印で示されているものがそれですこれらの遺伝子は血液由来 DNA ではたいていの場合メチル化されておらずその結果そのプローブシグナルは完全に消失しますこれは制限酵素消化が完全にうまく行われていることを示しています 18

20 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 42 MS-MLPA 法はとても簡単にメチル化状態とコピー数変化を同時に検出できますそして Prader-Willi/Angelman 症候群 Beckwith-Wiedemann 症候群 Silver-Russell 症候群に関しては少なくともヨーロッパでは現在最も広く行われている検査方法ですスライド 43 また MLPA 法では mrna の定量が可能となるプローブミックスを作成することもできますしかし異なる組織ごとでは mrna の発現が非常に多様なので適切なプローブの作成はより困難となりますですからある特定の mrna 用プローブミックスを開発する場合は特定の組織由来の RNA 用に最適化する必要がありますそのため現段階ではわずか一握りのプローブミックスしか製品がありません DNA 解析の方に戻ると既知の変異を検出できるプローブミックスを作成することも可能ですが同様にこれもまた非常に複雑ですその主な理由はたいていの遺伝子変異は世界中の集団に等しく分散していないからです少なくともほとんどの遺伝子では日本における変異検出頻度は西洋インドネシアもしくはアフリカなどでみとめられる変異検出率とは完全に異なりますですから MLPA 法による既知の変異検出に関しては人種特異的なプローブミックスが必要となるでしょうそれは可能なのですがしかしとても多大な作業となるのです 19

21 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 43 もちろん MLPA 法には欠点もありますこのテクニックで全てを行えるわけではありません 1 つ例を挙げれば二倍体の雌性細胞と三倍体の雌性細胞の識別はできませんこれは全ゲノム DNA 配列の相対的な量関係についてはこれらの細胞においては同じだからなのです MLPA 法では様々なプローブで検出される DNA 配列の相対的な量をみているだけなのですもう 1 つの欠点は一般的な PCR 法と比較して MLPA 法はサンプル中の不純物に対してより敏感だということですただ一般の研究室ではどんどん DNA 抽出が自動化に切り替わってきておりますがその品質は継続的に改善され続けていますのでこの問題はだんだん小さなものとなってきています実際 QIAGEN 社のような DNA 精製法の開発を行っている会社は現在 MLPA 法も使って抽出サンプルが MLPA 法のような用途に適するかどうかを判断しています MLPA 反応のデータ解析については必ずしも簡単というわけではありませんが無料で入手いただけるソフトウェアパッケージがありますこの Coffalyser ソフトは私達の Web サイトからダウンロードできますしかし現段階ではまだ本当に使い勝手の良いソフトとはいえず私達はその改善に取り組んでいるところですまたいくつかの大学や企業から入手または購入可能なソフトもあります最後に特定のプローブについて白人のサンプル DNA では全く問題なく作用するけれども例えば中国南部の人種から得たサンプルでは問題が起こるということが有り得ます現段階の公共のデータベースでは異なる人種の健常者におけるコピー数多型や一塩基多型について得られる情報が不足しています幸いにも私達はプローブの性能について顧客からたくさんのフィードバックをもらっていますこの顧客からのフィードバックによってまた製品の改善を試みるのですただこの欠点としてはもし皆さんが同じ製品を今から 1 年後もしくは 2 年後に買ったとしてもプローブミックス中の 1 つか 2 つぐらいはプローブが変更されている可能性があるということです私達は今からの 2 年間で全てのプローブミックス製品が多くの異なる人種から得られたサンプルで十分に検証が行われることそして私達の製品が本当に長い間変わること無く残り続けることを希望しています特に 2002 年に私達が最初の MLPA 製品を発売し始めたときには健常者におけるコピー数多型や一塩基多型についての情報は本当にごくわずかしかありませんでした今はずっと多くの情報が得られるようになってきていますので過去に比べより優れたプローブを設計することが可能になってきているのです 20

22 第 15 回遺伝子診療学会大会イブニングセミナー Ⅰ スライド 45 MLPA 法の利点をまとめてみましょう MLPA は小規模の DNA コピー数変化の検出に特に有用ですそして一度の反応で最大 50 までのゲノム配列を解析することができますまた操作も簡単で多量の DNA は必要としませんしかし 1 細胞相当の DNA 量では解析することはできませんしサンプルの調製に WGA(Whole Genome Amplification) 法を組み合わせた用い方はできませんがほとんどの調製法では十分な DNA 量以上のものが得られますさらにわずか 1ヌクレオチドしか異ならない配列を識別することができますまた重要なこととしては必要な装置はサーマルサイクラーとキャピラリーシークエンサーのみでたいていの研究室また少なくともたいていの大学病院では既に利用しているものであるということですどの用途の製品であっても同じ試薬と同じプロトコールが使えますそして多くの検体を同時に試験できます 1 つか 2 つのサンプルでも試験できますしまた 96 サンプルであっても 1 日で試験することもできるのですそして各試薬は非常に安定です実際に全ての酵素類バッファー類プローブや PCR プライマーが全部そろった試薬キットを室温で 3 ヵ月そのまま放置したとしてもまだちゃんと使用することができるのですですから全ての酵素類特にプローブミックスは -20 で何年間も保管しておくことができるのです製品の品質管理上とても重要な点はプローブのシグナルを得るには 2 つの異なるオリゴヌクレオチドの存在が必要だということです私達の研究室で調製ミスが起こった場合はいつもあるプローブのシグナルがあらわれないことで明確にわかってきますそしてまた全ての試薬が液体であることも品質管理を容易にしています最後に MLPA 反応の全体的なコストはわずかです現在キャピラリー電気泳動の消耗品コストを入れて 1 回の反応につき約 20 ドル程度ですスライド 46 しかし先で述べたように限界もあります 1 細胞の試料からは MLPA 法に用いることはできません WGA 法と組み合わせて用いることはできません均衡型転座を検出することもできません MLPA 法は完全には染色体分析の代替となることはできないでしょうしかし現在オランダでは出生前羊水検査は主に MLPA 法によって行われています例えばただダウン症候群の疑いのみを調べる場合は染色体分析の代わりに多くの症例で MLPA 解析が行われます最後に新しい MLPA 法アッセイの開発には時間がかかり困難なのですが研究用として独自に合成プローブのセットを作成することができますのでもちろん私はこれを試みていただくことをお勧めしますしかし世界の他の研究室にとっても有用と期待されるようなまた今から数年は役立てることができると思われる用法について皆さんがアイデアをお持ちの場合は是非私達に連絡してください私達は現在の MLPA 法の幅をさらに超えていくのに役立つような新しいプローブミックスの共同開発に常に関心があります現在私たちは約 250 の異なる MLPA 製品を販売していますが毎週平均 1 つは新しい製品を発売しています私達の業績はヒト遺伝学の分野が中心ですがこれまでお話したように RNA の分野についても MLPA 法の可能性はあるのです 21

23 Detection of DNA copy number changes and methylation changes by MLPA and MS-MLPA. スライド 47 スライド 48 最後にアムステルダムの真ん中の古い学校の建物にある私の研究室のスライドをお見せします MRC-Holland 社の研究室は私のオフィスのごくすぐ近くにあって実は私の家にも非常に近いです家から研究室までまた研究室からオフィスまで歩いて 1 分以内で行けます幸運にも私達は多くの様々な国籍の立派な若者たちとチームを構成しています彼らのほとんどはとても若くまた非常に意欲的ですそして私達は皆さんのためにこれからも新しい製品を開発できることを嬉しく思っておりますどうもありがとうございました Detection of DNA copy number changes and methylation changes by 22

24 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Detection of DNA copy number changes and methylation changes by

MLPA 法 Q&A 集

MLPA 法 Q&A 集目次 1. MLPA 法の導入 Q1. 導入にあたり何が必要になりますか? Q2. 実験にはどのようなサンプルが必要でしょうか? Q3. サンプルDNAはどれくらい用意すれば良いですか? Q4. キャピラリーシーケンサが自施設に無い場合でも実験はできますか? Q5. FFPE 検体でも実験はできますか? 2. 実験のセットアップ Q1. 実験において重要なポイントはありますか?

この講演記録は 第 1 5 回日本遺伝子診療学会大会イブニングセミナーにおいて発表された内容 資料を ( 株 ) ファルコバイオシステムズがお客様向けに翻訳したものです Dr. Jan P. Schouten Detection of DNA copy number changes and meth

この講演記録は第 1 5 回日本遺伝子診療学会大会イブニングセミナーにおいて発表された内容資料を ( 株 ) ファルコバイオシステムズがお客様向けに翻訳したものです Dr. Jan P. Schouten Detection of DNA copy number changes and meth