CONTENTS MHC Tetramerによる抗原特異的 T 細胞の検出原理... 3 T-Select MHC class I Tetramer 試薬の作製方法... 3 T-Select HLA class I Tetramerの高い特異性... 4 T-Select MHC Tetramer

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1 第5版 研究用 T-Select MHC Tetramer 抗原特異的 T 細胞を特異的に検出できる試薬です T-Select MHC Tetramer T細胞受容体 Th2 Th17 IL-6+TGF-β IL-4 B cell IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 Antibodies MHC分子 Th1 IL-12 Treg TGF-β IL-10 TGF-β IL-2 IFN-γ TNF-α MDSC MHC class II S100A8/A9 Pathogens TLR β2m ペプチド CD4+T IL-17 抗原特異的 T細胞 Dendritic cells CD8+T 蛍光標識物 CTL Perforin Granzyme IFN-γ TNF-α CD1d NKT MHC class I Target cells Cell death T細胞上に発現している T 細胞受容体 T-cell receptor, TCR は MHC 分子とペプチド断片の複合体 (MHC peptide complex) を特異的に認識して結合します CD8 陽性 T 細胞は MHC class I 分子とペプチド断 片の複合体 (MHC class I peptide complex) を認識して ウィルス感染細胞やがん細胞などの標的細胞を 直接攻撃 排除することから 細胞傷害性T細胞 Cytotoxic T Lymphocyte, CTL と呼ばれています 一方 CD4 陽性 T 細胞は MHC class II 分子とペプチド断片の複合体 MHC class II peptide complex を認識 して活性化します CD4 陽性 T 細胞は主にヘルパー T Th 細胞と呼ばれ 細胞性免疫を司る CTL やマク ロファージなどに作用する Th1 細胞と 樹状細胞や B 細胞に作用して液性免疫を賦活化する Th2 細胞が存 在します 1996 年 Altman らは MHC Tetramer 試薬を用いて これらの特異的 T 細胞をフローサイトメ トリーにより 1 個ずつ検出することに成功しました MHC Tetramer 試薬は これまでサイトカインの産生 や細胞傷害性活性の確認などで間接的にしか捉えることができなかった抗原特異的 T 細胞を直接的に検出す ることを可能にしただけでなく 抗原特異的 T 細胞の分離にも利用できるため 抗原特異的 T 細胞の機能や フェノタイプ等の詳細な解析を可能にしました 現在 MHC Tetramer 試薬は 感染症やがんワクチン療法 細胞免疫療法 移植免疫 自己免疫疾患などの基礎研究分野あるいは臨床開発において T細胞免疫応答の モニタリングに欠かす事のできないツールとして広く利用されています

2 CONTENTS MHC Tetramerによる抗原特異的 T 細胞の検出原理... 3 T-Select MHC class I Tetramer 試薬の作製方法... 3 T-Select HLA class I Tetramerの高い特異性... 4 T-Select MHC Tetramer 染色方法... 5 全血の場合... 5 Human PBMC, Mouse Splenocyte の場合... 6 Human CD8 抗体のクローンによる染色性の違い... 6 MHC TetramerはCTLの特異性を直接認識します... 7 末梢血を用いた細胞傷害性 T 細胞の誘導 [MLPC 法 (modified by MBL)]... 7 がん抗原 WT1( 変異型 ) 特異的 CTLの誘導と検出... 8 がん抗原 survivin-2b 特異的 CTLの検出... 9 がん関連 T-Select MHC Tetramerによる染色例 ウィルス 感染症関連 T-Select MHC Tetramerによる染色例 EBV CMV Influenza M HTLV 抗原特異的 CTLの各種測定方法とMBL Kits IMMUNOCYTO CD107a Detection Kit IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit IMMUNOCYTO IFN-γ ELISPOT Kit T-Select MHC IFN-γ Kit T-Select Antibody Gating Kit MHC Tetramer 関連製品 抗 HLA 抗体による HLA 型簡易判定 Clear Back (Human FcR blocking reagent)-tetramer 染色の Blocking 試薬 抗原特異的 CTL 誘導用 peptide 抗原特異的マウスCTLの誘導方法 in vitro stimulation による抗原特異的マウス CTL の誘導 ( インフルエンザウィルス ) Mouse MHC class I Tetramerの染色例 H-2K b OVA Tetramer T-Select Mouse MHC Tetramerを用いたTetramer blocking assay T-Select Mouse MHC class II Tetramer I-A b OVA I-A b ESAT T-Select CD1d Tetramer T-Select MHC TetramerとMBL カスタム作製 MHC class I custom Tetramer Human MHC class II custom Tetramer T-Select MHC Tetramer 使用文献 T-Select MHC Tetramer 製品情報 価格表 関連製品価格表 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

3 MHC Tetramer による抗原特異的 T 細胞の検出原理 T 細胞受容体 (TCR) は 抗原提示細胞 (APC) に発現す る MHC 分子と APC 内でプロセスされた特定のペプチド配 T 細胞受容体 列からなる複合体 (MHC / ペプチド複合体 ) を認識して特異的に結合することで T 細胞を活性化させることが知られています この原理を利用して MHC/ ペプチド複合体を用いた抗原特異的 T 細胞の検出が可能であると考えられました しかし MHC / ペプチド複合体は 単量体 ( モノマー ) の状態では ペプチド MHC 分子 蛍光標識物 β2m 抗原特異的 T 細胞 MHC/ ペプチド複合体の単量体 ( モノマー ) ではTCRとの親和性が く安定して結合できず 特異的 CTLを検出することはできません TCR に対する親和性が低く 両者の結合が不安定であるため そのままでは検出ツールとしての応用は困難でした そこで MHC / ペプチド複合体をビオチン化し ストレプトアビジン によりこれを 4 量体 ( テトラマー ) 化することで TCR との 安定的な結合状態を維持させることで検出ツールとしての応用が可能になりました T-Select MHC Tetramer は FITC PE あるいは APC (allophycocyanin) などの蛍光物質で標識されているため フローサイトメーターや蛍光顕微鏡を用いて 抗原特異的 T 細胞の検出が可能です MHC/ ペプチド複合体を4 量体 ( テトラマー ) 化することでTCRと安定して結合し 特異的 CTLを検出することができます T-Select MHC class I Tetramer 試薬の作製方法 MHC class I Tetramer 試薬の作製には Altman らにより考案された方法が広く用いられています Altman らは MHC class I / ペプチド複合体の 4 量体をプローブとして利用することが抗原特異的 CTL の検出 定量に有用であることを実証しました (Science 1996, 274: 94 96) また Bodinier らは HLA class I heavy chain α3 ドメインに変異 (A245V) を入れることで CD8 分子との非特異的な結合が最小限に抑えられ 特異性が飛躍的に向上することを報告しました (Nat. Med. 2000, 6: ) このことより T-Select Human HLA class I Tetramer は α3 ドメインに変異を入れた HLA class I heavy chain を用いて作製しています 作製過程の概略を右図に示しました 大腸菌リコンビナント蛋白質の MHC class I heavy chain と β2-microglobulin(β2m) に抗原ペプチドを加えてフォールディング操作を行い 可溶性の MHC class I/ ペプチド複合体のモノマーを形成させます 次に 複合体中の MHC class I heavy chain の C 末端にあらかじめ付加しておいたビオチン化配列中のリジン残基を BirA 酵素 (E. coli biotin holoenzyme synthetase) を用いてビオチン化します ビオチン化モノマーは カラムクロマトグラフィーにて精製します 精製ビオチン化モノマーは 蛍光標識したストレプトアビジンと混合することで 4 量体化させ T-Select MHC Tetramer 試薬となります < 作製過程概略 > HLA Peptide モノマー d-biotin β2m MHC class I heavy chain, β2m, ペプチドの Foldingを行い MHC class I/ ペプチド複合体 ( モノマー ) を形成させます MHC class I heavy chainのc 末端リジン残基を BirA 酵素を用いてビオチン化します ビオチン アビジン結合を利用してテトラマー化します 蛍光標識したストレプトアビジン 3 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

4 T-Select HLA class I Tetramer の高い特異性 CD8 分子は 生体内において HLA と CTL の結合を補佐することが知られています そのため HLA 分子には CD8 分子と結合する部位が存在します T-Select HLA class I Tetramer は CD8 分子と非特異的に結合する HLA 分子の α3 ドメイン内の1 箇所に変異を入れています これにより CD8 分子とテトラマー試薬の非特異的な結合が抑制され 245 特異性が飛躍的に向上しました (French Application Number; FR ) < 参考文献 > 1) Gao GF, et al., Nature 387: (1997) 2) Bodinier M, et al., Nat. Med. 6: (2000) α3 domain of HLA-A2.1 1) 染色例 1:HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer 特異 合 位に変異が ていない場合 変異の ていない Tetramer Tetramer 試薬 MHC/peptide 複合体 CD8 目的の特異的 TCR ではない CD8 分子が非特異的に Tetramer 試薬に結合し 非特異的な CD8 陽性細胞も検出してしまいます CD8-FITC HLA-A*02:01 CMV pp65 特異的 CTLを含むライン CD8-FITC HLA-A*02:01 CMV pp65 特異的 CTLを含まないライン 特異 合 位に変異が ている場合 変異を れた T-Select Tetramer CD8 Tetramer 試薬 特異的 TCR MHC/peptide 複合体 特異的 TCR を 的に検出可能です CD8-FITC HLA-A*02:01 CMV pp65 特異的 CTL を含むライン CD8-FITC HLA-A*02:01 CMV pp65 特異的 CTL を含まないライン HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer 試薬で HLA-A*02:01 陽性 CMV 陽性患者末梢血 ( 左 ) と HLA-A*02:01 陰性末梢血 ( 右 ) を染色しました HLA class I heavy chain α3 ドメインに変異を入れた T-Select MHC Tetramer 試薬 ( 下段 ) と 変異を入れていない従来の Tetramer 試薬 ( 上段 ) で 特異性に明らかな違いがあることが分かります T-Select HLA class I Tetramer は HLA class I heavy chain α3 ドメインに変異を入れ CD8 分子との非特異的な結合を最小限に抑えることで 特異性が飛躍的に向上しています French Application Number; FR ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

5 染色例 2:HLA-A*24:02 EBV BRLF1 Tetramer HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し MLPC 法にて誘導した EBV BRLF1 CTL line を HLA α3 ドメインに変異を入れた HLA-A*24:02 EBV BRLF1 (MBL code no. TS-M002-1) と HLA-A*24:02 Negative (MBL code no. TS-M007-1) HLA α3 ドメインに変異を入れていない HLA-A*24:02 EBV BRLF1 にて染色しました その結果 HLA α3 ドメインに変異を入れていない Tetramer では CD8 陽性細胞に非特異的な染色が見られました HLA α3 ドメインに変異を入れた Tetramer では 非特異染色は見られませんでした Negative Tetramer EBV BRLF1 Tetramer α3 ドメイン変異あり α3 ドメイン変異なし CD8(T8)-FITC 本データはリンパ球ゲートかつ 7-AAD 陰性ゲートで解析を行いました T-Select MHC Tetramer 染色方法 全血の場合 1) ヘパリン採血管にて静脈血を採取します 2)200 ml の全血に 10 ml の T-Select MHC を加えます 3) ゆっくりとボルテックスをかけます 4) 室温で 20 分間 あるいは 4 で 30 分間インキュべーションします 5)CD8 抗体等を加え 室温で 20 分間 あるいは 4 で 30 分間インキュべーションします 6)OptiLyse C (MBL code no. A11895, Beckman Coulter 社製分析機器用 ) もしくは OptiLyse B (MBL code no. IM-1400, BD Biosciences 社製分析機器用 ) を用いて溶血 固定処理します 各々の説明書にて推奨の手順に従ってください 7) 溶血 固定プロトコールの最終ステップ後 適量の PBS を加えて再懸濁します 8)400 x g で 5 分間遠心します 9) 上清を注意深く捨て 細胞を 500 ml の PBS に再懸濁します * サンプルは暗室にて 4 で保管し 24 時間以内に分析してください 200 μl whole blood 試薬添加 インキュベーション MHC 10 μl CD8-FITC 20 μl 溶血固定処理 溶血処理が不十分な場合 赤血球の乱反射による非特異的染色像が観察されることがあります CD45 を同時染色してリンパ球ゲートで解析してください PBS に懸濁 フローサイトメーターによる解析 リンパ球ゲート CD45 陽性ゲート HLA-A*24:02 BRLF1 HLA-A*24:02 Negative SSC-H リンパ球ゲートのみ FSC-H CD45-PC5 CD45 染色により赤血球の乱反射をゲートアウトすることで ノイズを低減することができました ( 右図 ) CD8(T8)-FITC リンパ球ゲート and CD45 陽性ゲート 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 5

6 Human PBMC, Mouse Splenocyte の場合 1) 定法に従って細胞を調製し cells/ml の濃度にて 細胞を再懸濁します 2)50 ml の細胞懸濁液に 10 ml の Clear Back(MBL code no. MTG-001) を加え 室温にて 5 分間反応させてください 3)10 ml の T-Select MHC を加えます 4) 室温で 20 分間 あるいは 4 で 30 分間インキュべーションします 5)CD8 抗体等を加え 4 で 20 分間インキュべーションします 6) 適量の FCM buffer [2% FCS/0.05% NaN 3 /PBS] を加え 400 x g で 5 分間遠心します 7) 上清を注意深く捨てます 8) 細胞を 500 ml の FCM buffer もしくは 0.5% パラフォルムアルデヒド /PBS に再懸濁します * サンプルは暗室にて 4 で保管し 24 時間以内に分析してください 細胞 細胞の (2% FCS/0.05% NaN 3 /PBS) Clear Back (Human FcR blocking reagent) ロッキング 理 注 1) 試薬添加 T-Select MHC 10 μl CD8-FITC 20 μl 温で あるいは 4 で 反応 注 1) Human CD8 抗体は クローン SFCI21Thy2D3( 通称 T8)(MBL code no ) のご使用を強く推奨します 他クローンの場合 TCR とテトラマー試薬の結合を阻害または増長する可能性があります Mouse CD8 抗体は クローン KT15 (MBL code no. D271-4) のご使用を強く推奨します 他クローンの場合 TCR とテトラマー試薬の結合を阻害または増長する可能性があります 先にテトラマー試薬で染色後 続けて CD8 にて染色を行うと 染色性が良くなることがあります ご使用になるテトラマー試薬の特異性を判断するために Negative Control Tetramer と 可能ならば Positive Control Tetramer を同時に染色することをお勧めします フローサイトメーターによる解析注 2) 注 2) 培養した場合は 7-AAD Viability Dye ( 死細胞検出試薬, MBL code no. A07704) を加え FSC/FL3 のドットプロット展開より 死細胞を除去して解析してください Human CD8 抗体のクローンによる染色性の違い HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より分離した PBMC を HLA-A*24:02 EBV BRLF1 (MBL code no. TS-M002-1) もしくは HLA-A*24:02 Negative (MBL code no. TS-M007-1) と Human CD8 抗体の 3 種類のクローン (T8, SK1, B9.11) を用いて同時染色しました その結果 クローン T8 では特異的 CTL がスポットで検出されましたが SK1 と B9.11 ではばらつきが大きくなる傾向がありました T8 ( 推奨 ) SK1 B9.11 < 参考文献 > Rita C. et al., Int. Immunol. 14: (2002) HLA-A*24:02 EBV BRLF1 HLA-A*24:02 Negative CD8-FITC 6 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

7 MHC Tetramer は CTL の特異性を直接認識します MHC Tetramer が開発される前までは サイトカインの産生や細胞傷害性活性などで 間接的に特異的 CTL を測定 していました しかし MHC Tetramer が開発されて初めて TCR の立体構造上の特徴 つまり CTL の特異性を直接的に捉えることができるようになりました 末梢血を用いた細胞傷害性 T 細胞の誘導 [MLPC 法 (modified by MBL)] T-Select MHC Tetramer は ウィルス抗原特異的 あるいはがん抗原特異的 CTL の検出用試薬として用いられています しかしながら ウィルス抗原と異なり がん抗原特異的 CTL の数は非常に少なく 採血直後に検出することが非常に難しい場合が多いと考えられます そこで 短期間のペプチド刺激培養後に がん抗原特異的 CTL の血中頻度を算出する方法として考案されたのが 96-well plate を利用した MLPC 法 (Mixed Lymphocyte-Peptide Cultures) です メラノーマ患者に対するワクチン療法の結果 患者末梢血中の特異的 CTL 数が増加することを MLPC 法で確認した Karaniks らの論文 (J. Immunol, 2003, 171:4898) を参考に MBL にて方法を改良し より簡便に より経済的に 健常人末梢血からがん抗原特異的 CTL を誘導する方法を考案しました 遠心室温 3,000 rpm 10 min. 血球 2 希釈 遠心室温 数時間 -15 日培養 日培養 96 well plate Tetramer CD8 刺激時 (day 0) の解析 採 血 ヘパリンナトリウム以外の抗凝固剤の使用は避けてください 採血後は 採血管をよく倒立攪拌してください 直ちに処理できない場合は 室温にて静置してください 血漿分離 分離した血漿は 再度低速遠心後 小分けして 30 に保存し 凍結融解を繰り返さないようにしてください 培養条件 培養 medium: 5% autoplasma/50 U/mL IL-2/2-ME/antibiotics/RPMI1640 抗原ペプチドを 10 mg/ml 加えて 96-well U-bottom plate にマルチピペッターを用いて 100 ml/well でまき込みます 48 時間後に IL-2 入りの medium を 100 ml/well ずつ加えます その後は medium の色を目安に最初の 1 週間は 1 回程度 次の 1 週間は 2 ~ 3 日毎に medium を半量ずつ交換します 加えるペプチドと IL-2 の濃度は至適化されていません ペプチド濃度はペプチドの溶解度や BIMAS 等のスコアを参考に 至適条件の検討が必要です 抗原刺激 ウィルス抗原特異的 CTL を誘導する際は チューブを用いての MLPC 法で可能な場合が多いですが がん抗原特異的 CTL を誘導する際は その存在頻度が低いため 次に示す 96-well plate を利用した MLPC 法をお勧めします 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 7

8 がん抗原 WT1( 変異型 ) 特異的 CTL の誘導と検出 がん抗原 WT1 を例にして 96-well MLPC 法の手順を以下に示しました HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し 96-well MLPC 法にて WT1(mutant) 特異的 CTL を誘導しました ペプチド刺激後 14 日目に T-Select WT1(mutant) Tetramer(MBL code no. TS-M014-1) で染色を行いました まず 96-well plate の 1 つのレーン毎にサンプルをプール (8 well 分 ) し 12 プールをそれぞれ染色しました 次に テトラマー陽性細胞が検出されたレーンから 1well ずつサンプリングを行い テトラマー試薬で染色して特異的 CTL の存在している well を同定しました これらの陽性 well 数より 以下の計算式を用いて 特異的 CTL の採血時における存在頻度を算出しました リンパ球 1-3x10 5 cells/well 96 well plate 5% 自己血漿抗原ペプチド day 2 IL 日培養 レーン毎にサンプルをプールし染色 A B C E D F G H ポジティブレーンについて各サンプルを染色 刺激時 (day 0) の解析 WT1(mutant) Tetramer CD : テトラマー陽性 well ( テトラマー陽性 well 数 ) ( 細胞数 /well) x ( 総 well 数 ) x (day0 の CD8 陽性率 ) 2 2 x 10 5 x 96 x x 10-7 of whole blood CD8 T cell 96 個の well のうち 2 個の well でテトラマー陽性細胞が確認されました 従って 採血時には WT1 特異的 CTL は使用した細胞中に 2 個存在したという判定になります 採血時の CD8 陽性細胞数で割ることで 存在頻度として算出されます 血漿分離前の採血管 8 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

9 がん抗原 survivin-2b 特異的 CTL の検出 サバイビン (survivin) は アポトーシスを抑制する IAP (inhibitor of apoptosis) ファミリーに属する分子で 正常細胞では非常に低いレベルで発現が認められています survivin のスプライスバリアントのひとつである survivin- 2B は 胸腺以外の正常組織では発現が認められませんが さまざまながん細胞で高発現していることが報告されています 札幌医科大学佐藤らが同定した survivin-2b エピトープは正常組織で発現している survivin には存在しない配列であることから がん免疫療法における理想的な標的と考えられています 既に国内では札幌医科大学を中心に このエピトープを用いた臨床試験が進められています 142 aa survivin exon 1 exon 2 exon 3 exon aa survivin-2b exon 1 exon 2 exon 2B exon 3 exon 4 EPDDDPI EEHKKHSSG EPDDDPIGPGTVAYACNTSTLGGRGGRITREEHKKHSSG survivin-2b survivin-2b の参考文献 1) Hirohashi Y, et al., Clin. Cancer Res. 8: (2002) 2) Tsuruma T, et al., J Transl Med. 2: (2004) 3) Idenoue S, et al., Clin. Cancer Res. 11: (2005) 4) Kurotaki T, et al., J. Immunol. 179: (2007) 5) Tsuruma T, et al., J Transl Med. 6: (2008) 染色例 :HLA-A*24:02 survivin-2b HLA-A*24:02 HLA-A*24:02 survivin-2b HIV (Negative) CTL clone 1 CTL clone CD8-FITC Sample: survivin-2bペプチドにて刺激培養したリンパ球 HLA-A*24:02 Survivin-2B CD8-FITC Sample: survivin-2b CTL clone データ提供 : 北海道 立大学法人札幌医科大学病理学第一講座 俊 先生 佐藤昇 先生 染色例 :HLA-A*24:02 Negative Tetramer-FITC/survivin-2B の 2 重染色がん抗原では特に 染色可能なサンプル量が限られている場合があります 希少なサンプルを有効に利用したいとの御要望により HLA-A*02:01 および HLA-A*24:02 の Negative Tetramer-FITC をラインナップしております PE もしくは APC 標識された目的の Tetramer 試薬と この FITC 標識の Negative Tetramer を 2 重染色することで 細胞が目的のテトラマー試薬特異的に染色されていることを 1 本のサンプルで確認できます 例 :1x10 6 /sample を染色に使用する場合 Negative 目的の 目的の Tetramer 用 Negative Tetramer 用で 計 2x10 6 個の細胞が必要です Negative Tetramer-FITC 目的の 目的の Tetramer と Negative Tetramer が同時に染色できるので 1x10 6 個の細胞で解析可能です TS-M027-3 T-Select HLA-A*02:01 HIV gag Tetramer-SLYNTVATL-FITC TS-M007-3 T-Select HLA-A*24:02 HIV env Tetramer-RYLRDQQLL-FITC CD8-PC5 HLA-A*24:02 survivin-2b HLA-A*24:02 survivin-2b 以下の試薬で染色を行いました HLA-A*24:02 Negative Tetramer-FITC HLA-A*24:02 survivin-2b CD8-PC5 CD8 陽性細胞集団をゲーティングして解析 1. 1 HLA-A*24:02 Negative Tetramer-FITC データ提供 : 北海道 立大学法人札幌医科大学病理学第一講座 俊 先生 佐藤昇 先生 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 9

10 がん関連 T-Select MHC Tetramer による染色例 染色例 :HLA-A*24:02 WT1 Tetramer HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より PBMC を分離 し MLPC 法にて WT1 (mutant) 特異的 CTL を誘導してテトラマー試薬により染色しました 図は左から T-Select HLA-A*24:02 Negative Tetramer, HLA-A*24:02 WT1 (wild) Tetramer, HLA-A*24:02 WT1 (mutant) Tetramer による染色像です 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します SSC-H 7-AAD FSC-H A*24:02 Negative (TS-M007-1) A*24:02 WT1 (wild) A*24:02 WT1 (mutant) (TS-M014-1) 染色例 : がん抗原 Tetramer 試薬 CD8 (T8)-FITC 健常人末梢血より PBMC を分離し MLPC 法にてがん抗原特異的 CTL を誘導してテトラマー試薬により染色しました 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します HLA-A*24:02 WT1(mutant) (TS-M014-1) HLA-A*24:02 htert (TS-M010-1). 8 HLA-A*02:01 NY-ESO-1 (TS-M011-1) 1. CD8 (T8)-FITC ウィルス 感染症関連 T-Select MHC Tetramer による染色例 EBV 染色例 :HLA-A* 24:02 EBV Tetramer T-Select HLA-A*24:02 EBV Tetramer には 5 種類のエピ トープに対する試薬がラインナップされています ( 下段 ) そして T-Select HLA-A*24:02 EBV mix Tetramer (MBL code no. TS- M009-1, 上段左 ) にはこれら 5 種類の試薬がミックスされており EBV mix.2 Negative. 1 本の試薬で 5 種類の EBV 特異的 CTL が染色できます 各エピトープの反応性には個人差があり EBV mix で検出された陽性像がどのエピトープに由来するものかは 5 種類のテトラマーで染色することにより知ることができます ( ) の数字は HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血で 採血直後に各テトラマーにより陽性が検出された人数を示します ( 陽性検出者数 / 検討者総数 ) EBV BRLF1 (7/13).1 EBV EBNA3A (5/13). 1 EBV EBNA3B (3/13). EBV BMLF1 (3/13). EBV LMP2 (2/13) CD8 (T8)-FITC ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

11 CMV 染色例 :HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer HLA-A2 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し 直後に T-Select HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer (MBL code no. TS ) による染色を行いました TS は HLA-A*02:01 のほか HLA-A*02:06 にも反応しましたが HLA-A*02:07 には反応しませんでした 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します A*02:01 A*02:06 A*02:07 Donor 4 Donor 6 Donor 8 Donor 5 Donor 7 Donor 9 < 参考文献 > Morita Y, et al., Bone Marrow Transplant 36: (2005) CD8(T8)-FITC 染色例 :HLA-A*24:02 CMV pp65 Tetramer HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し 直後に T-Select HLA-A*24:02 CMV pp65 Tetramer (MBL code no. TS ) による染色を行いました 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します HLA-A*24:02 の場合 採血直後は特異的 CTL が検出されないケースもあります 陽性率には個人差がありますが おおむね HLA-A*02:01 CMV pp65 と比較して低い傾向があります しかし 下図に示す通り MLPC 法で誘導することにより CMV 特異的 CTL を検出することが可能です Donor 1 Donor 2 Donor 3 CD8 (T8)-FITC 染色例 :HLA-A*24:02 CMV pp65 特異的 CTL の誘導と Tetramer 染色 HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し MLPC 法にて HLA-A*24:02 CMV pp65 特異的 CTL を誘導して経時的にテトラマー試薬で染色しました その結果 採血直後はテトラマー陽性率が であった PBMC から 約 1 週間の培養により明らかな陽性像を得ることができました この方法を用いることで 検討した 10 名の HLA-A*24:02 陽性健常人末梢血から CMV 特異的 CTL の誘導が確認できました 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します Day 0 Day 8 Day 11 Day 14 CD8 (T8)-FITC 11 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

12 染色例 :HLA-A*11:01, HLA-B*15:01 CMV pp65 Tetramer HLA-A*11:01 または HLA-B*15:01 陽性健常人末梢血よりPBMCを分離し 直後に HLA-A*11:01 CMV pp65 Tetramer (MBL code no. TS-M012-1) および HLA-B*15:01 CMV pp65 Tetramer (MBL code no. TS- M013-1) にてそれぞれ染色を行いました 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します MLPC 法にて CMV pp65 特異的 CTL を誘導して 14 日目に各 Tetramer 試薬で染色を行いました その結果 採血直後はテトラマー陽性率が 0.01 および 0.06% であった PBMC から 約 2 週間の培養により明らかな陽性像を得ることができました day 0 day 14 HLA-A*11:01 CMV pp65 (TS-M012-1) HLA-B*15:01 CMV pp65 (TS-M013-1) CD8 (T8)-FITC Influenza M1 染色例 :HLA-A*02:01 Influenza M1 Tetramer HLA-A2 陽性健常人末梢血より PBMC を分離し 直後に T-Select HLA-A*02:01 Influenza M1 Tetramer (MBL code no. TS ) による染色を行いました TS は HLA-A*02:01 のほか HLA-A*02:06 HLA-A*02:07 に反応しました 右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します A (HLA-A*02:01) B (HLA-A*02:01 /HLA-A*02:06) C (HLA-A*02:06) D (HLA-A*02:07) HLA-A*02:01 Influenza M1 Negative CD8 (T8)-FITC 12 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

13 HTLV-1 染色例 :HTLV-1 Tetramer HTLV-1 (Human T-cell leukemia virus type 1) は T 細胞に感染して成人 T 細胞白血病 (ATLL) や HTLV-1 関連脊髄症 (HAM/TSP) を引き起こすことが知られており HTLV-1 感染者の多さと 関連疾患発症後における症状の重篤性から 非常に注目されているウィルスのひとつです HTLV-1 感染とそれに対する CTL を中心とした宿主免疫応答は 関連疾患の発症と深い関わりがあると考えられています 日本の研究者は HTLV-1 特異的な CTL エピトープの同定において先駆的な役割を果たしてきました 1)-3) 鹿児島大学のグループは 16 種類の Tetramer 試薬を用いて ATLL では HTLV-1 Tax 特異的 CTL の多様性と数が減少しており 4)-5) HAM/TSP では HTLV-1 Env 特異的 CTL の多様性と数が増加していることを明らかにしました 6) Fre uency o HTLV-1-speci ic CTLs positivity in asymptomatic HTLV-1 carriers (AC), ATLL, HAM/TSP and carriers it autoimmune diseases AC with allele Tetramers AC ATLL HAM/TSP autoimmune diseases A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*02:01 A*24:02 A*24:02 A*24:02 A*24:02 A*24:02 A*24:02 A*24:02 A*24:02 Tax11-19 Tax Tax Tax Tax Env Env Env Tax12-20 Tax Tax Tax Tax Env11-19 Env21-29 Env % 9% 9% 9% 11% 11% 94% 6% (8/11) (1/11) (0/11) (1/11) (1/11) (0/11) (0/11) (0/11) (2/18) (2/18) (0/18) (17/18) (0/18) (1/18) (0/18) (0/18) 33% 55% (3/9) (0/9) (0/9) (0/9) (0/9) (0/9) (0/9) (0/9) (0/22) (0/22) (0/22) (12/22) (0/22) (0/22) (0/22) (0/22) % 7% 13% 87% 7% 4 13% 13% (9/10) (2/10) (1/10) (2/10) (0/10) (0/10) (1/10) (0/10) (2/15) (1/15) (2/15) (13/15) (1/15) (6/15) (2/15) (2/15) 55% 45% 18% 9% 18% 18% 24% 18% 18% 76% 6% 47% 35% 24% (6/11) (5/11) (0/11) (2/11) (0/11) (1/11) (2/11) (2/11) (4/17) (3/17) (3/17) (13/17) (1/17) (8/17) (6/17) (4/17) Tax CTL positives Env CTL positives Total CTL positives 22% 1% 14% (32/145) (1/87) (33/232) 1 6% (15/155) (0/93) (15/248) 26% 15% 22% (33/125) (11/75) (44/200) 26% 27% 27% (37/140) (23/84) (60/224) (The number of subjects with detectable CTLs / tetramers tested) HLA-A*24:02 HTLV-1 HLA-A*02:01 HTLV-1 Tax (TS-M018-1) Tax12-20 (TS-M020-1) Tax (TS-M021-1) Env11-19 (TS-M022-1) Tax11-19 (TS-M017-1) Tax (TS-M019-1) CD8 (T8)-FITC HLA-A*11:01 HTLV-1 Tax88-96 (TS-M023-1) HLA-A*11:01 HTLV-1 Tax (TS-M024-1) データ提供 : 国立大学法人鹿児島大学大学院医 学総合研究科難 ウイルス病態制御研究センター血液 免疫疾患研究分野有 直道先生 大学薬学部生化学 病態生化学 室小 知弘先生 CD8(T8)-FITC データ提供 : 京医科 科大学大学院医 学総合研究科生体 応答学系感染応答学講座免疫 療学分野 木 理先生 参考文献 : 1) Kannagi M, et al., J. Virol. 66: (1992) 2) Yashiki S, et al., AIDS Res Hum Retroviruses 17: (2001) 3) Harashima N, et al., J. Virol. 79: (2005) 4) Kozako T, et al., J. Immunol. 177: (2006) 5) Akimoto M, et al., J. Med. Virol. 79: (2007) 6) Kozako T, et al., J. Med. Virol. 83: (2011) 13 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

14 抗原特異的 CTL の各種測定方法と MBL Kits MBL では テトラマー試薬だけでなく 抗原特異的な CTL の活性を検出するためのキットも取り揃えています テトラマー試薬と併用すれば 抗原特異的で かつ活性化状態にある CTL を検出することができます Intracellular IFN-γ stain Cytotoxity detection assay IFN-γ CFSE 7.79 % % CD8 T-Select MHC Tetramer Annexin V-KO ELISPOT assay (-) Tetramer CD107a CD107a mobilization assay CD8 CD8 IMMUNOCYTO CD107a Detection Kit 抗原刺激により活性化した CTL は 細胞内顆粒中に含まれるパーフォリン グランザイムなどの細胞傷害因子を放出します これに伴い 細胞内顆粒内膜に存在する CD107a (LAMP-1) などが細胞膜上に表出します 従って 細胞表面上に表出した CD107 分子を検出することで 細胞傷害因子の放出を間接的に調べることができます IMMUNOCYTO CD107a Detection Kit (MBL code no. 4844) では CD107a mobilization assay により CTL による細胞傷害性因子の放出を間接的に測定することができます Intracellular IFN-γ assay と比べて短時間で実施できますが 感度はやや低いと思われます しかしながら 新規 CTL エピトープ同定の研究の場合 CD107a mobilization assay の方が IFN-γ 測定系と比較して Tetramer 染色と非常に良く相関する事が社内検討で分かりました stimulation 1 1 control peptide Tetramer X Tetramer Y 11 8 cognate peptide CD107a CD107a 14 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

15 IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit 本キットには CFSE は含まれておりません ウィルス感染細胞や腫瘍細胞などの細胞 (Target 細胞 ) は 細胞傷害性活性を持つ T 細胞や NK 細胞 (Effector 細胞 ) により直接認識され 傷害が起こります 細胞傷害性活性を測定する方法として 一般的には 51Cr 遊離試験 ( クロムリリースアッセイ ) が広く利用されています しかし 放射性同位元素 (RI) を使用するため 使用には一定の制限があります そこで RI を用いないで 細胞傷害性活性を測定するための方法 (Non-RI 法 ) が考案されています IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit (MBL code no. AM-1005) は Target 細胞を CFSE と Kusabira-Orange 標識 Annexin V で二重染色し フローサトメトリーによって細胞傷害性活性を測定する試薬です CFSE 染色された Target 細胞のうち Annexin V 染色された細胞の割合 つまり死細胞の割合で Effector 細胞の細胞傷害性活性を測定します Effector 細胞は CFSE で染色されていないため フローサイトメトリーにより簡便に区別して解析することができます この方法は クロムリリースアッセイと高い相関性が報告されており RI を使用せずに細胞傷害性活性を測定できる方法として利用されています Annexin V によるアポトーシス検出の原理 脂質二重層の内側に存在している phosphatidylserine (PS) は アポトーシスをおこした細胞では 膜構造の変化により細胞表面に露出します ( 右図 ) Annexin V は Ca 2+ 存在下で PS に対して強い親和性をもつため アポトーシス細胞に結合します 蛍光標識した Annexin V を用いる事で Effector 細胞により傷害された Target 細胞をフローサイトメトリーにて検出することができます IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit には 蛍光蛋白質 Kusabira- Orange(KO; Excitation Max 548 nm/emission Max 559 nm) 標識した Annexin V が含まれています フローサイトメトリーによるデータ解析 細胞 Ca 2+ KO Annexin V PS PS Ca 2+ 生細胞のPSは細胞表面に露出していないので Annexin Vとは結合しません Annexin V KO アポトーシス 期細胞 Ca 2+ Annexin V KO KO Annexin V Ca 2+ アポトーシスを起こした細胞では 膜構造が れ PSが細胞表面に露出して Annexin Vと結合します 右図は IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit を用 Cytotoxity: 84.64% Cytotoxity: 0.32% いて細胞傷害性活性を解析したデータです Effector 細胞 E:T 0:1 E:T 1:4 E:T 0:1 E:T 1:4 (E) Target 細胞 (T) は図の下に示した通りです Killing が起こると CFSE 陽性である Target 細胞が Annexin V 陽性になることが分かります この数値 (%) を用いて 細胞傷害性活性を下記の式を用いて数値化することができます CFSE FSC-H CFSE FSC-H Cytotoxity(%)=[(ET-T 0 )/(100-T 0 )] 100 ET: Effector 細胞と Target 細胞を共培養したときの CFSE + Annexin V + 細胞の割合 (%) T 0 : Target 細胞のみを培養したときの CFSE + Annexin V + 細胞の割合 (%) CFSE 7.79 % % 8.43 % 8.72 % CFSE Annexin V-KO Annexin V-KO 細胞傷害性活性を示すグラフ HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line による細胞傷害性活性のグラフ 2 例を右に示します データは <フローサイトメトリーによるデータ解析 >に記載した解析方法で解析しました グラフ E: A*24:02 EBV BRLF1 CTL line T: BRLF1 peptide pulsed HLA-A24 LCL Effector cells: HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line Target cells: OKT3 刺激で非特異的に増 させた HLA-A*24:02 auto PBMC line (%)100 peptide (+) peptide ( - ) 1:4 1:2 1:1 E:T ratio (%) 70 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください E: A*24:02 EBV BRLF1 CTL line T: HLA-A2 LCL グラフ2 Effector cells: HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line Target cells: 図中に示す各 alleleのlcl ( ) 内はパルスしたpeptideの種類 HLA-A*24:02 (CMV) HLA-A*24:02 (HIV) HLA-A*02:01 (CMV) 1:2 1:1 2:1 E:T ratio 15

16 IMMUNOCYTO IFN-γ ELISPOT Kit IFN-γ は 炎症性免疫反応の調節に関与するサイトカインで 主に活性化 CD8 + T 細胞 CD4 + T 細胞 NK 細胞などによって分泌されます IFN-γ の測定は免疫応答の評価に広く使用されており ELISPOT 法は IFN-γ 放出細胞数をスポットとして検出して定量できます 右図は HLA-A*24:02 拘束性 CMV pp65 CTL line を エピトープペプチド (QYDPVAALF) で 刺激した場合としていない場合のデータです 刺激細胞 10 4 cells/well 刺激細胞 T-Select MHC IFN-γ Kit IFN-γ の産生は CTL の活性を反映する指標のひとつとして広く知られており ELISA ELISPOT FCM などのアプリケーションを用いて測定されます しかし IFN-γ は様々な免疫細胞から産生されることから CTL 由来の IFN-γ 産生であることを示すのは困難です T-Select MHC IFN-γ Kit (MBL code no. TS-8005) は Intracellular IFN-γ assay により 細胞内で産生された IFN-γ を染色し フローサイトメトリーにより検出できます テトラマー試薬と同時染色することにより 抗原特異的かつ IFN-γ 産生 CTL を検出することが可能です D1: tetramer 陽性 IFN-γ 陰性 [ 抗原特異的であるが 機能的には不活性の状態にあるCTL] D2: tetramer 陽性 IFN-γ 陽性 [ 抗原特異的かつ 活性化の状態にあるCTL] IFN-γ FITC T-Select Antibody Gating Kit 健常人全血を用いて T-Select HLA-A*02:01 CMV pp65 (MBL code no. TS ) と T-Select Antibody Gating Kit (MBL code no. TS-9004) による三重染色を行い CD8 陽性 CTL の測定をフローサイトメトリー (EPICS XL-MCL を使用 ) にて行いました 1)CD4, CD13, CD19 がいずれも陰性の細胞分画にゲートをかけます (Gate A) 2)Gate A 内の細胞集団を FSC と SSC の二次元に展開して生細胞分画にゲートをかけ (Gate B) 死細胞 細胞の残骸を測定対象から外します 3)Gate B 内の細胞集団を FSC と CD8-FITC の二次元に展開し CD8 陽性細胞分画にゲートをかけます (Gate C) 4)Gate C 内の細胞集団を MHC と CD8-FITC の二次元に展開します CD8 陽性細胞集団のうち 蛍光強度 (CD8-FITC) の高い細胞集団において CMV 特異的 CTL が検出されました (Gate D) T-Select Antibody Gating Kit 構成品 (100 tests, MBL code no. TS-9004) Anti-CD4-PC5 (clone 13B8.2) 100 tests 1 Anti-CD13-PC5 (clone IMMU103.44) 100 tests 1 Anti-CD19-PC5 (clone J4.119) 100 tests 1 SSC SSC FSC A (CD4, CD13, CD19)-PC5 C MHC FSC D B Anti-CD8-FITC (clone SFCI21Thy2D3) 50 tests 2 CD8-FITC CD8-FITC 16 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

17 MHC Tetramer 関連製品 抗 HLA 抗体による HLA 型簡易判定 テトラマー試薬の使用には 検体の HLA ジェノタイプを判定することが不可欠です 採血時に HLA タイプの分からない検体でも HLA ジェノタイピングの前に抗 HLA 抗体を用いて HLA の血清タイプを暫定的に判定可能です 続けて HLA-A24 陽性の場合は EBV mix Tetramer で HLA-A2 陽性の場合は CMV pp65 Tetramer で染色することで より可能性を高めることができます ただし 抗体による判定はあくまでも推定ですので 必ず任意の機関でHLAのジェノタイピングを行ってください 抗 A24 抗体 (clone 17A10) 抗 A2 抗体 (clone BB7.2) 推定される HLA 型 Donor A A24 + /A2 + Donor B A24 + /A2 - HLA-A24 抗体による HLA タイピングに関する注意事項 HLA-A24 抗体 ( クローン 17A10, 22E1) は HLA-B27 と交差反応性が確認されています 但し HLA-B27 の頻度は 日本人では非常に少ないことが知られています HLA-A24 抗体 ( クローン 17A10, 22E1) は いずれも HLA-B27 以外の何らかの HLA と交 Donor C A24 - /A2 + 差反応していますが いまだ特定にはいたっておりません MBL 社内検討では A24 抗体陽性検体の約 2 割が HLA-A*24:02 陰性でした HLA-A24 抗 体陰性検体で HLA-A*24:02 陽性の検体は現在のところ確認されていません HLA タイプ間の違いは数アミノ酸であることが多く 立体構造が類似していると そのわずかな違いを抗体で Donor D A24 - /A2 - 検出するには限界があります 必ず HLA ジェノタイピングを実施してください Clear Back (Human FcR blocking reagent)-tetramer 染色の Blocking 試薬 - Clear Back(MBL code no. MTG-001) は フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いた蛍光抗体法において 非特異反応を抑制する試薬として開発されました 下図左に示す通り 単球領域ではこの試薬を用いる事により顕著に非特異反応が抑制されます Tetramer 試薬を用いて非常に頻度の低い細胞集団を検出する場合 この様な非特異的な染色を抑制する事は重要なポイントになります Clear Back は マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞によるエンドサイトーシスを抑制する効果もあり ヒトだけでなくマウスサンプルにおいても効果的に使用できます また使用法も非常に簡便です (5 ページの染色方法をご覧ください ) 下図右は PBMC を Clear Back 存在下もしくは非存在下で HLA-A*24:02 EBV BRLF1 Tetramer にて染色した図です テトラマー陽性 CD8 陰性領域での非特異染色が抑制されていることが分かります 末梢血単核球における Clear Back の効果 末梢血単核球における Clear Back の効果 SSC-H R2 R1 FSC-H mouse IgG2a-FITC (5 μg/ml) にて反応 赤色 :Clear Back 処理有り 色 :Clear Back 処理無し Clear Back あり Clear Back なし リンパ球領域 (R1) 単球領域 (R2) CD8 (T8)-FITC counts counts *Clear Back の使用により CD8 陰性 Tetramer 陽性領域の非特異的な染色が抑制されました FL1-H FITC FL1-H FITC リンパ球領域 (R1) では 目立った非特異的な染色像は認められませんでした 単球領域 (R2) では Clear Back 処理により 非特異染色が抑制されました 抗原特異的 CTL 誘導用 peptide MBL では T-Select MHC Tetramer に使用されているエピトープペプチドを販売しています ご使用のテトラマーに合ったペプチド配 列をご購入できますので 発注の際の配列ミスの心配がありません また 溶液状態で納品しますので MLPC 法にて CTL を誘導する際 に便利です マウス CTL を誘導するためのペプチド ヘルパー作用のある抗原ペプチドも各種取り揃えております 製品ラインナップは 製品リスト (34 ページ ) をご覧ください Tetramer code Peptide code 濃度 容量 溶液 純度 備考 TS-XXXX-1 TS-XXXX-P 10 mg/ml 1 mg (100 μl) DMSO 95% 以上 * 無菌グレード 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください * 一部該当しない配列もございます 17

18 抗原特異的マウス CTL の誘導方法 マウスモデルは感染実験 ワクチンの開発 免疫療法の検討など 生体内のさまざまな免疫応答の観察に使用されています T-Select Mouse MHC Tetramer は マウスの抗原特異的 CTL を検出することができます MBL 社内検討の結果 次の方法で より早く 安価で簡単に抗原特異的 CTL を誘導可能であることが分かりました まず 目的の抗原ペプチドとヘルパー作用の報告がある抗原ペプチドを混合し 免疫賦活剤とエマルジョン化して腹腔免疫します 最後の免疫から 7-11 日後に脾臓を摘出します 脾細胞はフラスコ内でペプチド刺激して 1 週間培養します 下図にタイムスケジュールを示します 免疫回数は抗原によって違いますが 社内検討では 1-4 回で抗原特異的 CTL を誘導することができました 個体差がありますので 1 抗原に対して 2 匹以上のマウスを用いることをお勧めします 詳細は 各テトラマー製品のデータシートをご覧ください mouse allele strain H-2K H-2D H-2L C57BL/- b b - BXSB/Mp b b - 129/- b b - BALB/c d d d DBA/2 d d d B10D2 d d d C3H/He k k - CBA/N k k - 免疫解 刺激テトラマーによる染色 peptide を加えて 1 週間培養 antigenic peptide, helper peptide, CFA, PBS 脾臓摘出 day-10* *boost 後の日数は至適化されていません day 0 解析 day 7 解析 in vitro stimulation による抗原特異的マウス CTL の誘導 ( インフルエンザウィルス ) マウスモデルにおけるインフルエンザウィルスエピトープとそのバリアントの報告は多く MHC の構造解析や結合力の研究から ワクチン開発や CTL クローンを用いた免疫応答の研究など さまざまな目的に使用されています ペプチド免疫での CTL 誘導を行う際にも CTL の誘導が効率良く行えるため ペプチド免疫による CTL 誘導に最適な抗原のひとつといえます in vitro における CTL 誘導データと 取り扱っておりますマウスインフルエンザテトラマーの情報を一覧にまとめました MBL code no. allele epitope Influenza strain Protein aa TS-M527-P H-2D b A S N E N M D A M Influenza A/NT/60/68(H3N2) nucleoprotein (NP) TS-M502-P H-2D b A S N E N M D T M Influenza A/NT/60/68(H3N2) nucleoprotein (NP) TS-M508-P H-2D b A S N E N M E T M Influenza A/PR/8/34(H1N1) nucleoprotein (NP) TS-M528-P H-2D b S S L E N F R A Y V Influenza A/PR/8/34(H1N1) RNA polymerase α subunit (PA) TS-M520-P H-2K d I Y S T V A S S L Influenza A/PR/8/34(H1N1) hemagglutinin (HA) <FSC/SSC 展開図 > day 0 day 7 H-2D b Influenza NP (TS-M527-1) H-2D b Influenza NP (TS-M502-1) H-2D b Influenza NP (TS-M508-1) H-2D b Influenza PA (TS-M528-1) H-2K d Influenza HA (TS-M520-1) AAD SSC-H 特異的テトラマー試薬 FSC-H Negative Tetramer CD8 (KT15)-FITC 18 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

19 染色例 :H-2D b Influenza NP (MBL code no. TS-M502-1) H-2D b 拘束性 Influenza NP 由来の抗原ペプチド (ASNENMDTM, MBL code no. TS-M502-P) と ヘルパー作用の報告がある抗原ペプチド I-A b HBc helper peptide (MBL code no. TS-M701-P) を混合し 免疫賦活剤とエマルジョン化し C57BL/6 マウスに腹腔免疫しました 11 日後に脾臓を摘出し 脾細胞を調製後 一部をサンプリングして MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました (day 0) これらの脾細胞は in vitro において Influenza NP 由来の抗原ペプチド (1 μg/ml) で 1 週間刺激培養しました これを同様に MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました (day 7) <day 0> Mouse A. CD8 (KT15)-FITC Mouse B.2 Influenza NP (TS-M502-1) ドットブロット展開図右上の数字は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します FSC/SSC 展開図にてリンパ球領域を R1 とし 7-AAD 陰性細胞領域を R2 としました この R1 かつ R2 領域にて解析を行いました <day 7> stimulation (1 μg/ml peptide) Influenza NP 由来の抗原ペプチド (ASNENMDTM) を免疫したマウスにおいて in vitro stimulation により 1.3 ~ 12.7% の Influenza NP 特異的 CTL の誘導が確認されました Negative Tetramer (H-2D b human gp100 Tetramer- KVPRNQDWL-PE, MBL code no. TS-M505-1) を用いた比較染色により Influenza NP 特異的 CTL であることが明確に示されました.. Influenza NP (TS-M502-1) 各エピトープにおける誘導条件は 各試薬のデータシートをご覧ください Negative (TS-M505-1) CD8 (KT15)-FITC Mouse MHC class I Tetramer の染色例 MBL では マウスモデル抗原や腫瘍抗原 ウィルス抗原などに対するテトラマー試薬を販売しています 以下のデータは全て ペプチド免疫ののち in vitro stimulation により誘導した各抗原ペプチド特異的 CTL を テトラマー試薬で染色した図 ( 上段 ) と Negative Tetramer で染色した図 ( 下段 ) です Negative Tetramer には それぞれ同じ allele で違うエピトープ配列の試薬を使用しています サンプルは ペプチド刺激後 day 6 のマウス脾細胞です 図中右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します 詳しい情報は各試薬のデータシートをご覧ください ウィルス抗原 LCMV MuLV H-2D b LCMV gp33 (TS ) H-2D b LCMV gp33 (C9M) (TS-M512-1) H-2D b LCMV NP396 (TS-M513-1) H-2L d LCMV NP118 (TS-M514-1) H-2K b MuLV p15e (TS-M507-1) H-2L d MuLV gp70 (TS-M521-1) CD8 (KT15)-FITC CD8 (KT15)-FITC 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 19

20 各種ウィルス H-2K b HSV-1 gb (TS-M523-1) H-2K b SeV (TS-M509-1) H-2K b VSV NP (TS-M529-1) H-2D d HIV P8-I10 (TS-M516-1) H-2K d RSV (TS-M506-1) H-2L d MCMV IE1 (TS-M510-1) H-2L d HBsAg (TS-M522-1) H-2D k polyomavirus MT (TS-M530-1) H-2D k HTLV-1 (TS-M531-1) CD8 (KT15)-FITC モデル抗原 CD8 (KT15)-FITC バクテリア抗原 H-2K b β-galactosidase (TS-M501-1) H-2L d β-galactosidase (TS-M511-1) H-2K d EGFP (TS-M525-1) H-2K d Listeria LLO (TS-M503-1) H-2K d Malaria Pb9 (TS-M515-1) H-2D d BCG MPT51 (TS-M517-1) マイナー抗原 CD8 (KT15)-FITC マウスがん抗原 CD8 (KT15)-FITC H-2D b HY Uty (TS-M524-1) H-2D b human gp100 (TS-M505-1) H-2D b CEA (TS-M518-1) H-2L d P815 (TS-M519-1) H-2K d HER2 (TS-M526-1) 20 CD8 (KT15)-FITC CD8 (KT15)-FITC ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

21 マウス WT1 Tetramer 特異的 CTL の誘導 Wilms 腫瘍因子 WT1 は 成長因子などの転写を制御する転写因子です WT1 遺伝子は 白血病や種々の固形癌で高発現しており その発症 進行に関与することが知られています WT1 特異的 CTL は WT1 発現量の高いがん細胞を傷害し 正常細胞は傷害しないことが示されており 既に WT1 を用いた臨床試験が開始されています WT1 は免疫療法のターゲット分子として注目されているがん抗原のひとつです 以下に C57BL/6 マウス 2 個体におけるペプチド免疫とその後の培養 in vitro stimulation に伴う H-2D b WT1 Tetramer (MBL code no. TS-M504-1) 陽性率の推移を示します 図中右上の数値は CD8 陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率 (%) を示します <day 0> <day 7> <day 14> WT1 Tetramer Negative Tetramer WT1 Tetramer Negative Tetramer WT1 Tetramer Negative Tetramer Mouse 1 stimulation stimulation μg/ml peptide μg/ml peptide.. Mouse 2 CD8 (KT15)-FITC がん抗原由来の特異的 CTL を誘導したい場合や その他の抗原であっても 場合によっては 1 回のペプチド刺激 (in vitro stimulation) では充分量の Tetramer 陽性細胞を得ることが難しい場合があります ペプチドで 2 回目の刺激を加えることにより 特異的 CTL を増幅できる事もありますが ペプチドが MHC class I 分子に提示され 特異的 CTL が細胞傷害性活性を示すことで <day14> に示すように CD8 陰性細胞のほとんどが激減することが多くなります また 使用するペプチド濃度が濃い場合は特異的 CTL 同士の殺傷により陽性率が著しく低下する事もあります この様な現象を避けたい場合 2 回目のペプチド刺激には ペプチドをパルスした抗原提示細胞を利用することをお勧めします H-2K b OVA Tetramer 染色例 :T-Select H-2K b OVA Tetramer (TS C) C57BL/6 マウス脾細胞 (2 個体 ) の T-Select H-2K b OVA Tetramer (MBL code no. TS C) による染色像です 図中右上の数値はそれぞれ CD8 陽性細胞中の Tetramer 陽性細胞率 (%) を示します H-2K b 拘束性 OVA 由来の抗原ペプチドとヘルパー作用の報告がある抗原ペプチドを混合し 免疫賦活剤とエマルジョン化し C57BL/6 マウス 2 個体に腹腔免疫しました 10 日後に脾臓を摘出し 脾細胞を調製後 一部をサンプリングして MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました ( 下図左 ) これらの脾細胞は in vitro において OVA ペプチドパルスした別の同種個体の脾細胞と 1 週間混合培養しました これを同様に MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました ( 下図右 ) Mouse 1 Mouse 2 Mouse 1 Mouse Negative Tetramer 1 week OVA Tetramer CD8 (KT15)-FITC 21 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

22 マウス CD8 抗体のクローンによる H-2K b OVA Tetramer の染色性の違い (OT-I mouse の場合 ) OT-I マウス脾臓細胞を H-2K b OVA (10 μl/sample) と段階希釈した anti-mouse CD8( クローン KT15 もしくはクローン ) 抗体で染色して解析を行いました ( 反応系 : cells/sample, total 100 μl/sample) Negative Tetramer として H-2K b β-galactosidase (10 μl/sample) を使用して非特異的な反応を調べました その結果 を用いた場合は OT-I マウス脾臓細胞中の CD8 陽性細胞は OVA Tetramer でも β-galactosidase Tetramer でも染色されました を希釈して使用しても 同じく両方のテトラマーで染色されました KT15 を用いた場合 OT-I マウス脾臓細胞中の CD8 陽性細胞は OVA Tetramer でのみ特異的に染色されましたが KT15 を 10 μl/ sample で使用した場合は明らかに OVA の蛍光強度が低下していました 濃度検討の結果 KT15 を 0.63 μl/sample で使用した場合に OVA テトラマー陽性細胞集団の蛍光強度が比較的高くなりました これ以上希釈して使用した場合 更に KT15-FITC 陽性細胞集団の蛍光強度が低下してしまいました ただし ペプチド免疫して OVA 特異的 CTL を誘導したマウス脾臓細胞をサンプルとして用いた場合は KT15 を 10 μl/sample で使用しても特に問題は見られませんでした ( 次項目参照 ) 以上より トランスジェニックマウスである OT-I マウス由来の細胞をサンプルとして用いる場合は Mouse CD8 抗体にはクローン KT15 を適量で用いること また Negative Tetramer を必ず比較対照として置くことが重要であることが分かりました Anti-Mouse CD8 (KT15)-FITC/ による染色 Anti-Mouse CD8 (53.6.7)-FITC/ による染色 OVA Tetramer β-galactosidase Tetramer KT15 抗体量 OVA Tetramer β-galactosidase Tetramer 抗体量 10 μl ( 推奨使用量 ) 10 μl ( 推奨使用量の 1/2) 2.5 μl ( 推奨使用量の 1/4) 2.5 μl ( 推奨使用量の 1/8) 0.63 μl ( 推奨使用量の 1/16) 0.31 μl ( 推奨使用量の 1/64) CD8 (KT15)-FITC CD8 (53.6.7)-FITC 本検討に使用した濃度はあくまでご使用の目安です 実験系により 必要に応じて濃度検討を行うことをおすすめします マウス CD8 抗体のクローンによる H-2K b OVA Tetramer の染色性の違い ( ペプチド免疫 C57BL/6 マウスの場合 ) ペプチド免疫して特異的 CTL を誘導したマウス脾臓細胞を H-2K b OVA (10 μl/sample) と anti-mouse CD8 ( クローン clone KT15 clone KT15 もしくはクローン ) で染色して解析を行いました Negative Tetramer として H-2K b β-galactosidase H-2K b OVA (10 μl/sample) を使用して非特異的な反応を調べました その結果 KT15 を使用した場合は Negative Tetramer と比較してテトラマー陽性細胞が認められましたが を使用した場合は H-2K b OVA H-2K b β-galactosidase 共に激しい非特異染色が見られました は H-2K b OVA Tetramer- PE とは特に相性が悪いことが知られています OVA Tetramer に限 H-2K b β-galactosidase (negative control) らず ご使用の際は注意が必要です MBL では可能な限り KT15 の ご使用をお勧めしております CD8-FITC 22 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

23 T-Select Mouse MHC Tetramer を用いた Tetramer blocking assay Tetramer blocking assay は MHC-Tetramer 試薬を用いて TCR を block することで 抗原特異的な細胞傷害性活性が抑制されることを示す実験系です つまり クロムリリースアッセイや IMMUNOCYTO Cytotoxity Detection Kit などで見られる細胞傷害性活性が Tetramer 陽性 CTL に由来するものかどうかを明確に示すことができます Tetramer 染色した CTL は 約 24 時間で細胞傷害性活性が回復することが報告されています % % OT-I mouse splenocyte Tetramer で染色したもの していないものを用意します OVA-tetramer % CD8-FITC 98.5 % OVA-tetramer CD8-FITC OT-I マウスの splenocyte では 約 9 の CD8 + T 細胞が OVA Tetramer 陽性です Tetramer 染色あり Tetramer 染色なし E : T = 4 : 1 50 Tetramer 染色 Non-treated Cr labeled target cells (E.G7) Cytotoxicity(%) Pre-treated Cytotoxicity(%) 解析 Target 細胞と 4 時間共培養します 0 2 : 1 1 : 1 E : T 0.5 : 1 0 none OVA-tet OVA-tet vs E.G7 OVA-tet. 3.3 HBV-tet. 3.3 none vs EL-4 (μg/ml) Tetramer 染色により 特異的 TCR を する細胞傷害性活性が抑制されます Tetramer 試薬の濃度 存的に細胞傷害性活性が抑制されます <Tetramer blocking assay 使用文献 > 1) Wakita D, et al., Int. Immunol. 18: (2006) 2) Chamoto K, et al., Cancer Res. 66: (2006) 3) Yokouchi H, et al., Cancer Sci. 97: (2006) 4) Yokouchi H, et al., Clin Exp Metastasis 24: (2007) データ提供 : 北海道大学遺伝子病制御研究所免疫制御分野茶本健司先生 西村孝司先生 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 23

24 T-Select Mouse MHC class II Tetramer I-A b OVA OVA は 多様な免疫反応を惹起させるモデル抗原として非常に多くの研究分野で利用されています I-A b に OVA エピトープ (ISQAVHAAHAEINEAGR) が提示された状態を特異的に認識する TCR のトランスジェニックマウス (OT-II マウス ) は T 細胞の分化の過程 活性化などを解析するツールとして免疫学的研究に大きく貢献しています I-A b OVA Tetramer は様々な実験系において重要なツールになることが期待されます < 参考文献 > 1) Barnden MJ, et al., Immunol Cell Biol. 76: (1998) 2) Moon JJ, et al., Immunity. 27: (2007) 3) Landais E, et al., J Immunol. 183: (2009) 染色例 1-1:OT-II マウスでの反応性確認例 染色例 1-2:peptide 刺激培養後 (6 日間 ) の染色例 I-A b OVA Mouse % CD4-FITC 0.5 % Mouse % I-A b MOG35-55 Tetramer 1.2 % I-A b OVA Tetramer 1.9 % 1.5 % 79.2 % OVA peptide concentration 0 μg /ml I-A b MOG μg /ml CD4-FITC CD4-FITC OT-II マウスの脾細胞を用いて I-A b OVA Tetramer 試薬の反応性を検討したところ 陽性細胞集団が検出される個体 (Mouse 2) と染色されない個体 (Mouse 1) が存在することが明らかとなりました ( 染色例 1-1) Mouse 1 に関しては OVA 特異的 TCR の発現レベルが低いと考えられたことから peptide による特異的刺激により発現レベルを上げることができるかについて検証を行いました Mouse 1 の脾細胞に 最終濃度が 1 mg/ml になるように OVA peptide(isqavhaahaeineagr, MBL code no. TS-M703-P) を加えて 6 日間培養後 MHC Tetramer 試薬の反応性を検討しました ( 染色例 1-2) その結果 Mouse 1 において in vitro peptide stimulation により特異的 T 細胞の誘導が確認できました Negative control として I-A b MOG Tetramer を用いた場合は 陽性細胞は検出されませんでした 染色例 2:OVA peptide 免疫マウスでの染色例 I-A b OVA I-A b MOG35-55 OVA peptide immunized mouse splenocytes day 0 day % 1.4 % 0.2 % 0.2 % 100 nmol の OVA peptide と 10 mg の cholera toxin (MBL code no. RK ) を免疫賦活剤とエマルジョン化して C57BL/6 マウスに 2 回腹腔免疫しました 11 日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製し 一部をサンプリングして MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました (day 0) これらの脾細胞は in vitro において最終濃度が 1 mg/ml になるように OVA peptide を加え 8 日間培養しました (day 8) これを同様に MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました OVA peptide を免疫したマウスにおいて in vitro peptide stimulation により特異的 T 細胞の誘導が確認できました Negative control として I-A b MOG Tetramer を用いた場合は 陽性細胞は検出されませんでした 24 CD4-FITC ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

25 I-A b ESAT ヒト型結核菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) はグラム陽性細菌に分類され 肺結核などの結核症の原因菌としてよく知られています ESAT-6(Early Secreted Antigenic Target 6) は Mtb が分泌する主要な低分子タンパク質で 強い抗原性を有しています 結核ワクチンに使用されている M. bovis BCG 株では ESAT-6 遺伝子を欠損していることから この抗原に特異的な T 細胞応答は BCG 接種者における結核感染の診断に利用されています ESAT は I-A b 拘束性の immunodominant なエピトープとして知られており 生体内における免疫応答のモニタリングや新しいワクチン開発の研 究などで広く使用されています I-A b ESAT 特異的な TCR を持つトランスジェニックマウスも作製されており I-A b ESAT Tetramer は様々な実験系において重要なツールになることが期待されます FSC/SSC 展開図 脾臓細胞における ESAT 特異的 CD4 + T 細胞の染色例 FSC/SSC 展開にてリンパ球領域を R1 CD4 陽性細胞領域を R2 とし 7-AAD 陰性細胞領域を R3 としました この R1 かつ R2 かつ R3 領域にて解析を行ないました I-A b ESAT I-A b MOG (Negative control) SSC-H 7-AAD CD4-FITC 結核菌感染後 FSC-H ヒト型結核菌 H37Rv 株あるいは BCG Pasteur 株を尾静脈よりマウスに感染 (5x10 5 CFU/ 匹 ) させ 4 週間後に肺および脾臓を摘出して細胞を調製しました これらの細胞を MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました その結果 肺に存在するリンパ球において ヒト型結核菌感染マウスで CD4 陽性細胞中 7.73% の I-A b ESAT Tetramer 陽性細胞が検出されました ( 下図 ) また 脾臓細胞においてヒト型結核菌感染マウスでのみ I-A b ESAT Tetramer 陽性細胞が検出され BCG 感染マウスでは I-A b ESAT Tetramer 陽性細胞は検出されませんでした ( 右図 ) BCG 感染後 非感染 肺組織中に存在する ESAT 特異的 CD4 + T 細胞の染色例 CD4-FITC 結核菌感染後 非感染 I-A b ESAT データ提供国立大学法人京都大学大学院医学研究科基礎医学系感染 免疫学講座微生物感染症学酒井俊祐先生 光山正雄先生 CD4-FITC I-A b ESAT Tetramer の反応温度による染色性の違い 室温 1 時間 氷上 1 時間 2.2 % 1.0 % 左図は Tetramer 染色の反応温度を検討したデータです 結核菌感染マウス脾臓細胞を 室温もしくは氷上で 1 時間反応しました その結果 I-A b ESAT Tetramer においては室温での反応を行った方が 蛍光強 I-A b ESAT 度が強く出ることが分かりました データには示しておりませんが 同一条件で 2 時間の反応を行った場合でも 氷上での反応系において 大き 0.3 % 0.2 % CD4(GK1.5)-FITC I-A b MOG35-55 (Negative control) く蛍光強度が上がることはありませんでした 本データは FSC/SSC 展開にてリンパ球領域を R1 7-AAD 陰性細胞領域を R2 としました この R1 かつ R2 領域にて解析を行いました データ提供 : 国立大学法人京都大学大学院医学研究科基礎医学系感染 免疫学講座微生物感染症学酒井俊祐先生 光山正雄先生 25 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

26 ペプチド免疫による I-A b ESAT Tetramer 特異的 CTL の誘導 day 0 day % 4.85 % I-A b ESAT % 0.27 % I-A b MOG (Negative Tetramer) CD4(GK1.5)-FITC I-A b ESAT peptide(mteqqwnfagieaaasaiqg, MBL code no. TS-M707-P)100 nmol を 10 μg の cholera toxin (MBL code no. RK ) および免疫賦活剤とエマルジョン化してマウスに 2 回腹腔免疫しました 11 日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製後 一部をサンプリングして MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました (day 0) これらの脾細胞は in vitro において ESAT peptide(0.1 μg/ml) で 8 日間刺激培養しました これを同様に MHC Tetramer 試薬を用いて染色しました (day 8) その結果 I-A b ESAT Tetramer 特異的な CD4 + T 細胞を検出することができました Negative Tetramer (I-A b MOG Tetramer, MBL code no. TS-M704-1) では 陽性細胞は検出されませんでした 本データは FSC/SSC 展開にてリンパ球領域を R1 7-AAD 陰性細胞領域を R2 としました この R1 かつ R2 領域にて解析を行いました マウス MHC class II/OVA epitope 複合体を認識する抗体 Anti-Mouse TCR DO11.10 (MBL code no. KO221-5, clone KJ1.26) は I-A d 拘束性 OVA 特異的 TCR を認識する抗体としてよく知られています OVA (ISQAVHAAHAEINEAGR, MBL code no. TS-M703-P) の配列は 抗原特異的 CTL を誘導する際のヘルパーペプチドとしても使用されています Anti-mouse TCR DO11.10 染色例 DO11.10 T cell hybridoma OVA peptide を免疫した BALB/c マウス脾臓細胞 counts FL-1 isotypic control Anti-mouse TCR DO11.10 Anti-mouse TCR DO11.10-PE CD4-FITC Isotypic control-pe CD4-FITC Sample: DO11.10 T cell hybridoma Sample: OVA immunized mouse splenocyte 26 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

27 T-Select CD1d Tetramer T 細胞受容体 CD1d 分子は β2-microglobulin (β2m) と非共有結合した膜タンパク質で ヒト マウス間でホモロジーが非常に高いことが知られています CD1d 分子は CD1d 分子 NKT 細胞 海綿から抽出 分離された糖脂質である α-galactosylceramide (α-galcer) を提示することで ヒトおよびマウスの CD1d 拘束性の NKT 細胞を活性化できます T-Select CD1d は CD1d と β2m の複合体をPEまたは APC 標識されたストレプトアビジンにより 4 量体化した試薬です 本試薬に α-galcer を結合させることで CD1d 拘束性の NKT 細胞をフローサイトメトリーにより高感度に検出できます NKT 細胞関連抗体と組み合わせることで より簡便に NKT 細胞の機能解析を行うこともできます < 参考文献 > 1) Stephane S, et al., J. Immunol. Methods 268: (2002) 2) Matsuda JL, et al., J. Exp. Med. 192: (2000) 3) Benlagha K, et al., J. Exp. Med. 191: (2000) CD1d Tetramer に使用する α-galcer の溶解と load 本製品には α-galcer は含まれておりません Pyridine 0.9% NaCl/0.5% Tween-20 CD1d 分子 糖脂質抗原受容体 CD161 糖脂質 蛍光標識物 T-Select CD1d Tetramer KT 細胞 抑制受容体 状細胞 状細胞 パーフォリン 糖脂質 得免疫系活性化 標的細胞細胞死 IFN-γ サイトカイン産生 IL-4 NKT 細胞活性 室温 (20~30 ) もしくは 37 で 光して 12~18 時間静置します α-galcer stock 溶液 (1 mg/ml) 200 μg/ml α-galcer 希釈溶液 CD1d (100 μl) に α-galcer 希釈液 (10 μl) を添加 そのまま 4 保存 ( 光 ) 染色例 :T-Select CD1d Tetramer を用いた NKT 細胞の検出 < Human > < Mouse > α-galcer ( ) α-galcer load α-galcer ( ) α-galcer load Human CD1d 0.00 % 0.05 % CD3-FITC Mouse CD1d 0.42 % 2.33 % CD4 (GK1.5)-FITC 健常人末梢血より PBMC を分離し 40 μl の ClearBack (Human Fc receptor blocking reagent, MBL code no. MTG-001) を加えて室温で 5 分間インキュベーションしました これに CD3-FITC と T-Select human CD1d Tetramer- PE (α-galcer 結合なし α-galcer 結合あり ) を加え 4 暗所にて 30 分静置しました フローサイトメトリーで測定したところ 全体の 0.05% の NKT 細胞を検出できました C57BL/6 マウス脾臓細胞を調製し CD4-FITC と T-Select mouse CD1d (a-galcer 結合なし a-galcer 結合あり ) を加え 4 暗所にて 30 分静置しました フローサイトメトリーで測定したところ 全体の 2.33% の NKT 細胞を検出できました NKT 細胞検出用試薬 製品名 50 tests 10 tests MBL code no. 価格 MBL code no. 価格 Human CD1d TS-HCD-1 145,000 TS-HCD-1S 50,000 Human CD1d Tetramer-APC TS-HCD-2 145,000 Mouse CD1d TS-MCD-1 145,000 TS-MCD-1S 50,000 Mouse CD1d Tetramer-APC TS-MCD-2 145,000 本製品には α-galcer は含まれておりません 27 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

28 CD1d Tetramer FAQ Q1. α-galcer を Pyridine ではなく DMSO に溶解してはいけませんか? A1. Pyridine の使用をお勧めします 社内検討では α-galcer を DMSO に溶解して 80 で 10 秒インキュベーション後 Mouse CD1d に load して検討しましたが CD1d 陽性細胞の検出はできませんでした Q2. α-galcer について 200 μg/ml に希釈した状態での保存は可能ですか? A2. 反応性が低下することが分かっておりますので α-galcer は 200 μg/ml に希釈した状態での保存は避けてください Pyridine で 1 mg/ml に溶解した状態で 20 保存し CD1d Tetramer に load する直前に 200 μg/ml に希釈してください Mouse CD1d CD4(GK1.5)-FITC 1:α-GalCer を load していない Mouse CD1d Tetramer 2: 染色の前日に 200 μg/ml に希釈した α-galcer を load した Mouse CD1d Tetramer 3:200 μg/ml に希釈した α-galcer を -30 にて 3 ヶ月間凍結保存し 染色の前日に load した Mouse CD1d Tetramer 図中右上の数値は CD4 陽性細胞中の CD1d Tetramer 陽性細胞率 (%) を示します Q3. α-galcer を CD1d Tetramer に load した状態で 4 保存は可能ですか? A3. はい 少なくとも Human で 12 ヶ月間 Mouse で 12 ヶ月間反応性が保たれることが分かっています mouse CD1d human CD1d without α-galcer α-galcer load 直後 CD4(GK1.5)-FITC α-galcer load 後 3 ヶ月 α-galcer load 後 12 ヶ月 without α-galcer α-galcer load 後 3ヶ月 α-galcer load 後 6ヶ月 α-galcer load 後 12ヶ月 CD3-FITC 図中右上の数値は CD4 陽性細胞中の Mouse CD1d Tetramer 陽性細胞率 (%) を示します 図中右上の数値は 全体の Human CD1d Tetramer 陽性細胞率 (%) を示します いずれの場合においても α-galcer を load しない状態で 4 保存し 反応性確認の前日に α-galcer を load した CD1d Tetramer と同等の反応性を示しました Q4. CD1d Tetramer の有効期限はどのくらいですか? A4. 購入後 1 年を目安にお使いください バックグランドの上昇など 劣化と思われる現象が観察された場合は使用を中止してください Q5. どの位の陽性率が期待できますか? A5. 健常人 4 名中 1 名で採血直後の PBMC から上図程度の陽性率が得られます マウス脾臓細胞を染色した場合 CD4 陽性細胞中に BALB/c では 5% C57BL/6 では 2 の Mouse CD1d Tetramer 陽性細胞が検出されます ( 社内検討データ ) Q6. CD1d Tetramer を使用する際におすすめの Blocking 剤はありますか? A6. Clear Back Human FcR blocking reagent (MBL code no. MTG-001) の使用をおすすめしています ヒト マウス共に単球由来の細胞によるテトラマー試薬の非特異的な取込みを抑制する効果が期待できます 28 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

29 T-Select MHC Tetramer と MBL MBL は米国 Beckman Coulter 社から独占的サブライセンスを受けて 2002 年より国内でテトラマー試薬の開発 製造 販売を行っています 以来 多くの先生方からご指導賜りながら MBL ではテトラマー試薬というコア技術を中心にさまざまな免疫学的研究を経験することができています MHC Tetramer 試薬メーカーとして テトラマー試薬をご利用いただいている皆様方からのお問合せやご相談に対応できる知識を備えておくためにも このような実験的 学術的経験を今後も蓄積していきたいと考えています non-specific peptide specific peptide 1. day 0 day Tetramer CD107a β2m α1 α3 α2 Functional assay Epitope identification Detection CTL Tetramer Induction peptide stimulation Isolation activation αcd137 or αcd107a Anti-Mouse IgG1 Microbeads sorting CTL line without stimulation MHC Tetramer anti-pe Microbeads Molecular biological analysis TCR cloning Expansion Enriched antigenspecific T cells 88.3 % cells (x 10E5) CD137 tetramer Days 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください 29

30 カスタム作製 MHC class I custom Tetramer 弊社にて対応可能な allele とご希望の配列のペプチドを用いて T-Select MHC Tetramer を作製することができます 応可能な allele HLA Peptide HLA-A A*01:01 A*02:01 A*02:06 A*02:07 A*03:01 A*11:01 A*24:02 A*26:01 A*31:01 HLA-B B*07:02 B*08:01 B*15:01 B*27:05 B*35:01 B*40:01 B*40:02 B*40:06 B*44:03 B*51:01 B*52:01 B*54:01 B*57:01 HLA-C Cw*01:02 Cw*03:03 Cw*03:04 Cw*04:01 Cw*08:01 Cw*12:02 Cw*15:02 Mouse H-2K b H-2K d H-2D b H-2D d H-2D k H-2L d H-2K K A2K b ( キメラ ) A24K b ( キメラ ) Rhesus Macaque Mamu-A*01 赤字の allele に関しましては別 お問い合わせください β2m MHC-peptide complex 作製 用 フォールディング ペプチド合成 (20 mg)* 50,000- フォールディング検討 ** 50,000- モノマー ビ チン d-biotin テトラマー 用 テトラマー 50 tests (1 vial) 200, tests (2 vials) 350, tests 以上はお問い合わせください Streptavidin-PE MHC Tetramer Class I Tetramerカスタム作製 用 * ペプチドをご提供いただく場合 ペプチド合成 5 は発生しません 1 回のフォールディング検討には 純度 9 以上のペプチドが 20 mg 必要です ** フォールディング検討 とは MHC-peptide complex の作製にかかる 用です MHC とペプチド配列の親和性により MHC-peptide complex の形成が可能であるかの検討が 必要になります 2 回目以 の同配列カスタム作製ご注文時には フォールディング検討 は発生しません + < カスタム作製例 (50 tests)> ペプチド合成 + フォールディング検討 + テトラマー化 + カスタム作製 用 ( 合計 ) 納期目安 ペプチド合成 込 ( 約 20 mg) ペプチドご提供 ( 約 20 mg) 50, , , , , , ,000 3ヶ月 2ヶ月 2 回目以 の同配列カスタム作製 200, ,000 1 ヶ月 別価格です < MHC Tetramer 試薬の参考文献 > 1) Altman JD, et al., Science 274: (1996) 2) Mcmichael AJ, et al., J. Exp. Med. 187: (1998) 3) Bodinier M, et al., Nat. Med. 6: (2000) 4) 村上昭弘, 鈴木進臨床免疫 42: (2004) ご希望の allele およびペプチド配列が決定いたしましたら 下記宛にご連絡ください 折り返し 担当者よりご連絡させていただきます 30 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

31 Human MHC class II custom Tetramer 応可能な allele Human Class II DRB1*01:01 DRB1*03:01 DRB1*04:01 DRB1*04:05 DRB1*08:03 DRB1*09:01 DRB1*15:01 DRB1*15:02 DRB4*01:01 DPB1*04:01 DRB1*11:01 フォールディングビ チン テトラマー Peptide d-biotin MHC-peptide complex 作製 用 ペプチド合成 (20 mg)* 100,000 フォールディング検討 ** 100,000 + テトラマー 用 50 tests (1 vial) 600,000 Mouse Class II お問合せください Streptavidin-PE 赤字の allele に関しましては別 お問い合わせください MHC Tetramer Class II Tetramer カスタム作製 用 * ペプチドをご提供いただく場合 ペプチド合成 10 は発生しません 1 回のフォールディング検討には 純度 9 以上のペプチドが 20 mg 必要です ** フォールディング検討 とは MHC-peptide complex の作製にかかる 用です MHC とペプチド配列の親和性により MHC-peptide complex の形成が可能であるかの検討が必要になります 2 回目以 の同配列カスタム作製ご注文時には フォールディング検討 は発生しません < フォールディング確認方法 > + ペプチドなし 指定ペプチド negativeペプチド 37 で静置 Retention time が negative ペプチドと比べて 大きく移 する *Retention time は一例です モ マー ペプチド ペプチドなし 指定ペプチド negativeペプチド min min min min min 弊社ではフォールディング検討の際 コントロールペプチドと指定ペプチドの Retention time (HPLC で目的タンパク質のピークが出現する時間 ) の差が 0.1 min 以上という基 を け これを MHC-peptide complex 形成の目安としております フォールディング検討の結果によっては 以 の作業が困難となる場合がございますが その場合は ペプチド合成 およびフォールディング検討 以外は発生いたしません < カスタム作製例 (50 tests)> ペプチド合成 + フォールディング検討 + テトラマー化 + カスタム作製 用 ( 合計 ) ペプチド合成 込 ( 約 20 mg) 100, , , ,000 ペプチドご提供 ( 約 20 mg) 100, , ,000 <2 の 配列カスタム作製 > ペプチド合成 込 ( 約 20 mg) 100, , ,000 ペプチドご提供 ( 約 20 mg) 500, ,000 別価格です Human class II フォールディング検討サービス エピトープ同定の際などに 実際に候補エピトープが MHC/peptide 複合体を形成するかを確認できます 納期目安 ペプチド合成 込ペプチドご提供 (2 mg 以上 ) 200, ,000 7 週間 3 週間 候補エピトープ数が多い場合は 別 ご相談ください 31 研究用試薬 Web Site にて 製品検索 データシート取得が可能です ぜひご利用ください

32 T-Select MHC Tetramer 使用文献 コード No. 製品名使用文献 TS HLA-A*02:01 Mart-1 Takahara M, et al., J. Leukoc. Biol. 83: (2008) Akiyama Y, et al., J. Transl. Med. 3: 4 13 (2005) Tomiyama M, et al., Anticancer Res. 24: (2004) TS HLA-A*02:01 gp100 (mutant) Akiyama Y, et al., J. Transl. Med. 3: 4 13 (2005) TS HLA-A*02:01 proteinase 3 (PR1) Morita Y, et al., Int. J. Cancer 119: (2006) TS HLA-A*02:01 tyrosinase Akiyama Y, et al., J. Transl. Med. 3: 4 13 (2005) TS-M014-1 or M015-1 HLA-A*24:02 WT1 (mutant ) or WT1 (wild) Saitoh A, et al., Med. Oncol. 28: (2011) Narita M, et al., Int J Med Sci. 7: (2010) Chiba Y, et al., Jpn. J. Clin. Oncol. 40: (2010) Tsuboi A, et al., Int. J. Hematol. 86: (2007) TS-M025-1 HLA-A*24:02 survivin-2b Kameshima H, et al., Cancer Sci. 102: (2011) Miyazaki A, et al., Cancer Sci. 102: (2011) TS-M017-1 HLA-A*02:01 HTLV-1 Tax11-19 Kozako T, et al., Hum Immunol. 72: (2011) TS-M018-1 HLA-A*24:02 HTLV-1 Tax Kozako T, et al., J. Med. Virol. 83: (2011) TS-M019-1 HLA-A*02:01 HTLV-1 Tax Tanaka Y, et al., Cancer Res. 70: (2010) TS-M020-1 HLA-A*24:02 HTLV-1 Tax12-20 Sabouri AH, et al., Blood 112: (2008) TS-M021-1 HLA-A*24:02 HTLV-1 Tax Akimoto M, et al., J. Med Virol. 79: (2007) TS-M022-1 HLA-A*24:02 HTLV-1 Env11-19 Kozako T, et al., J. Immunol. 177: (2006) TS HLA-A*02:01 Influenza M1 Akiyama Y, et al., J. Transl. Med. 3: 4 13 (2005) TS HLA-A*02:01 CMV pp65 Sabouri AH, et al., Blood 112: (2008) Watanabe K, et al., Int J Hematol. 88: (2008) TS HLA-A*24:02 CMV pp65 Watanabe K, et al., Int J Hematol. 88: (2008) TS-M001-1 HLA-A*24:02 EBV LMP2 TS-M002-1 HLA-A*24:02 EBV BRLF1 TS-M003-1 HLA-A*24:02 EBV BMLF1 Sato K, et al., Blood 117: (2011) Watanabe K, et al., Int J Hematol. 88: (2008) TS-M004-1 HLA-A*24:02 EBV EBNA3A TS-M005-1 HLA-A*24:02 EBV EBNA3B TS-M006-1 HLA-A*02:01 EBV LMP1 Shultz LD, et al., PNAS 107: (2010) TS HLA-A*02:01 EBV BMLF1 Shultz LD, et al., PNAS 107: (2010) Tomiyama M, et al., Anticancer Res. 24: (2004) TS-M007-1 HLA-A*24:02 Negative Akiyama Y, et al., Anticancer Res. 29: (2009) Tsukahara T, et al., Cancer Sci. 99: (2008) Akimoto M, et al., J. Med Virol. 79: (2007) Kozako T, et al., J. Immunol. 177: (2006) Akiyama Y, et al., J. Transl. Med. 3: 4 13 (2005) TS C H-2K b OVA Kurachi S, et al., J. Exp. Med. 208: (2011) Yanai H, et al., PNAS 108: (2011) Takeshima T, et al., Cancer Res. 70: (2010) Asano J, et al., J. Immunol. 184: (2010) Tang C, et al., J. Leukoc. Biol. 86: (2009) Kijima M, et al., J. Immunol. 182: (2009) Senju S, et al., Stem Cells 27: (2009) Miyakoda M, et al., J. Immunol. 181: (2008) Wakabayashi A, et al., J. Immunol. 180: (2008) Sugiyama T, et al., Int. Immunol. 20: 1 9 (2008) Kumar H, et al., J. Immunol. 180: (2008) Li W, et al., J. Immunol. 178: (2007) Zhang Y, et al., Int. Immunol. 19: (2007) Taneichi M, et al., J. Immunol. 177: (2006) Wakita D, et al., Int. Immunol. 18: (2006) Chamoto K, et al., Cancer Res. 66: (2006) Saito K, et al., J. Immunol. 176: (2006) Yokouchi H, et al., Cancer Sci. 97: (2006) Yajima T, et al., J. Immunol. 176: (2006) Yajima T, et al., J. Immunol. 174: (2005) Li W, et al., Infect. Immunol. 72: (2004) Teramoto K, et al., Cancer Res. 63: (2003) 32 ( 株 ) 医学生物学研究所営業推進部基礎試薬グループ TEL: FAX:

の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる 図4 研究である 研究内容 私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行った この結果 これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形

の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる 図4 研究である 研究内容 私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行った この結果 これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形 AKT活性を抑制するペプチ ド阻害剤の開発 野口 昌幸 北海道大学遺伝子病制御研究所 教授 広村 信 北海道大学遺伝子病制御研究所 ポスドク 岡田 太 北海道大学遺伝子病制御研究所 助手 柳舘 拓也 株式会社ラボ 研究員 ナーゼAKTに結合するタンパク分子を検索し これまで機能の 分からなかったプロトオンコジンTCL1がAKTと結合し AKT の活性化を促す AKT活性補助因子 であることを見い出し

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