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1 免疫を極める Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー CD1d テトラマー

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3 目次 Pro5 MHC クラスⅠペンタマー... 2 はじめに... 2 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーの長所...3 製品リスト... 4 カスタム Pro5 MHC クラスⅠペンタマー... 5 迅速合成サービス... 5 迅速合成サービスの仕様...5 製品リスト... 5 カスタマーケーススタディ... 6 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーの特異性...7 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーの特性...20 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーの染色プロトコール Pro5 MHC クラスⅠペンタマーと細胞内サイトカインの染色...23 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーと磁気ビーズを使用した抗原特異的 T 細胞の濃縮...25 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを用いた組織染色...27 ワクチンと免疫療法の開発...27 ヒトとマウスの CD1d テトラマー さらなる利便性のためのリガンド (α-galcer) 結合済 CD1d テトラマー ヒトとマウスの CD1d テトラマーネガティブコントロール ヒト CD1d テトラマー マウス CD1d テトラマー 有用なリンク集...32 日本人顧客による論文選集...32

4 PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー 抗原特異的 T 細胞を検出するための再現性の最も高い技術です はじめに Pro5 ペンタマーが最高の MHC マルチマー製品であることが 650 報以上の論文で示されています Pro5 MHC クラスⅠペンタマーは 独自の商標登録済みの実績のある技術であり 免疫モニタリング 抗原特異的 T 細胞の解析 エピトープバリデーションの分野におけるリーダーにより使用されています 世界中の業者の中で MHC マルチマーに関する論文が最も急増しているのは ProImmune 社です 現在 Pro5 ペンタマーの使用を引用する論文は 650 報を超えており インパクトファクターが上位であるジャーナル ( 例えば Lancet Journal of Immunology Journal of Experimental Medicine Blood など ) に論文が掲載されています ProImmune の詳細なプロトコールと技術経験は顧客の信頼を得ており 研究をサポートし 推進しています 希少な抗原特異的 T 細胞集団を検出する際 再現性のある結果を与える高感度で正確な研究ツールの重要性に気付くでしょう Pro5 ペンタマーが解決します Pro5 ペンタマーは 主要組織適合複合体 (MHC) アリルとペプチドの組み合わせによって決定される特定の特異性を有する T 細胞受容体に直接結合します ペンタマーを使用して リンパ球中の 0.02% ほどの希少な抗原特異的 CD8 + T 細胞集団を検出し 分離することができます ペンタマーは 詳細なエピトープ解析やさらなる免疫モニタリングにも適しています 品質や安定性にばらつきがある大学や非営利の提供者からのテトラマーとは異なり ペンタマーは優れた構造が利点であり 多くの厳密な品質管理工程を含む専門的基準で作製されています ペンタマー技術を使用して 正確で再現性のある結果を得ることができます Pro5 ペンタマーは コイルドコイルドメインを通じて会合した 5 つの MHC ペプチド複合体を含みます その構造のため ペンタマー中の 5 つすべての MHC ペプチド複合体が 相補的 T 細胞受容体 (TCR) に結合可能です 各ペンタマーは 明るく効率的な標識のために 5 つの蛍光タグまたはビオチンタグも含みます 対照的に MHC テトラマー技術は 四面体錯体中に保持される MHC ペプチド複合体であり その空間的構成のために わずか 3 つの MHC ペプチド複合体しか TCR に結合できません 図 1:Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーのイメージ ( 各構成要素の 1 つを強調 );MHC ペプチド複合体 ( 赤色 暗青色 ) コイルドコイルドメイン ( 明青色 ) 蛍光タグ ( ピンク ) 2

5 ProImmune 社は 最も幅広い MHC クラスⅠマルチマー複合体を市販しています ProImmune では 広範な感染性疾患 ( インフルエンザ CMV B C 型肝炎 HIV EBV など ) のための 200 を超えるペンタマー ならびに癌関連エピトープとモデル抗原を提供しています カスタムペンタマーも入手可能です 弊社は 様々な適用での Pro5 ペンタマー製品の社内試験 Pro5 MHC ペンタマーの特徴において広範な経験を有しています そのため 関連する適再現性の高さ蛍光標識の選択における柔軟性用においてお客様を十分にサポートすることができます お豊富な製品ラインナップ客様が弊社の技術を最大限に使用するためにお役に立ちま T 細胞受容体への高い結合親和性す また 弊社のホームページで豊富な情報 ( プロトコール より明るい蛍光適用データ 及びケーススタディ ) にアクセスすることがで長期保存性きます これらによって ワクチン研究 細胞内サイトカイン染色 細胞分離などの分野に適用される ProImmune 社製品を用いたお客様の成功を知ることができます Pro5 MHC クラスⅠペンタマーに関するさらなる情報については以下にアクセスして下さい PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーの長所 親和性 & 構成明るさ標識の柔軟性安定性 Pro5 ペンタマー Pro5 ペンタマー 1 つ当たり 5 つの MHC ペプチド複合体が TCR と結合するので 親和性相互作用が増強する 独自の標識技術によって 5 つまでの蛍光標識を各 Pro5 ペンタマーに付着させることができ より明るいシグナルを発する ビオチン標識ペンタマーと未標識ペンタマー ( 好みの蛍光色素で標識できる ) によって 可能な適用範囲が最大になる 未標識 Pro5 ペンタマーを 80 で長期保存し 必要に応じて使用することができる テトラマー 四面体構成で保持された MHC ペプチド複合体によって 典型的には 3 つの MHC ペプチド複合体だけが TCR に結合できる 本来 テトラマーは 複合体の中央に位置づけられる 1 つの蛍光標識を持つ テトラマー ( 蛍光標識ストレプトアビジンを用いてビオチン化 MHC モノマーをマルチマー化することにより作製される ) は あらかじめ標識して供給されなければならない 蛍光色素を取り込んだテトラマーは 4 で保存しなければならない テトラマーの保存期間が短くなる 図 2 A*02:01/GILGFVFTL (Flu MP) 10 4 Pro5 Pentamer 1.4% 10 4 Tetramer 1.33% 図 2: 末梢血単核細胞 (PBMC) サンプルでの MHC マルチマー染色 vs. 示した各抗原に対して特異性を有する 個の PBMC を Pro5 ペンタマーまたはテトラマーで染色した 図は生細胞を示し ペンタマー vs. テトラマーで染色された細胞での感度と平均蛍光強度の増加を実証する MHC Multimer R-PE B*08:01/RAKFKQLL (EBV BZLF-1) % 0.60%

6 PRO5 MHC クラス I ペンタマー 製品リスト Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー Pro5 ペンタマーは tests 分の容量で入手可能です 未標識で または R-PE APC 又はビオチンから選んで標識して供給することができます R-PE または APC 蛍光 Pro5 フルオロタグと Pro5 ビオタグを tests に対応する量で 未標識ペンタマーとの使用のために別々に入手可能です Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーと抗 CD8 キット Pro5 ペンタマー分析は CD8 + T 細胞集団の同時染色を用いて行わなければなりません すべてのペンタマーは FITC 標識された抗 CD8 モノクローナル抗体 ( ヒトまたはマウス ) を含むキットでも入手可能です キット中で供給される抗体クローンは ペンタマー製品との併用での優れた性能について試験されており 別個の一定分量で提供されます そのため 最適な作業希釈率を見つけるために 使用者は抗体を滴定することができます マッチドペプチドを 1 mg または 2 mg 量で利用可能です ネガティブ Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー 多くの抗原特異的 T 細胞応答は 特に癌や自己免疫疾患において頻度が非常に低く 小集団の検出を非常に困難にします これに対処するために ProImmune 社では HLA-A*02:01 ネガティブコントロール Pro5 ペンタマーを供給します このペンタマーをフローサイトメトリー分析に使用し 非特異的結合のレベルを評価し 抗原特異的ペンタマーからの陽性染色をより正確に決定することができます 5 つの HLA-A2 分子を含み 各々が無関係のペプチド抗原と組み立てられ それには T 細胞応答性がないことが知られています 図 A*02:01/Negative 10 4 A*02:01/NLVPMVATV CD8-FITC 10 4 A B C A1-A3 Irrelevant peptide B1-B3 Negative peptide C1-C3 Positive peptide 図 3: 抗 CD8(LT8)(x 軸 ) および Pro5 MHC ペンタマー (y 軸 ) を用いて染色された PBMC 各プロットが約 10,000 の生リンパ球事象を示す 左プロット :HL A-A*02:01 ネガティブコントロールペンタマー ; 中央プロット : ポジティブペンタマー ; 右画像 : 無関係のペプチドに対する応答を示す ELISpot プレート (A) ネガティブコントロールペンタマーペプチド (B) およびポジティブコントロールペプチド (C) 4

7 カスタム Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー 弊社で最も試用され テストされたサービスでは 数千の新たな特異性がもたらされ お客様の研究を推進させています ProImmune 社には お客様の要求に応じたカスタム MHC マルチマーの作製において 10 年を超える経験があります 数千の異なる MHC ペプチド複合体の作製における弊社の専門知識と技術経験によって 弊社は注文試薬を効率的に提供でき 高い成功率を誇ります お客様は 通常注文されるストックアイテムと同じ再現性と信頼を注文試薬に期待することができます また すべての標識されたカスタム Pro5 ペンタマーには 6 ヶ月間の品質保証が付き すべての未標識カスタムペンタマーには 12 ヶ月間の保証が付きます 迅速合成サービス プロジェクトにおいて時間が重要である場合 わずかな期間で発送されるカスタムペンタマーを選ぶことができます このサービスはペプチド合成を含み MHC マルチマー ( 例 テトラマー ) の他の供給業者 ( 商業的に作製されるか または コア施設により作製されるかを問わず ) の時間スケールを打ち負かすように計画されています 迅速合成カスタムペンタマーは 弊社の標準的なデリバリーカスタムペンタマーと同じ妥協のない品質基準で作製されており 同じ保証が付いております PRO5 MHC クラス I ペンタマー 迅速合成サービスの仕様 (1) 迅速合成サービスは 1 注文当たり最高 4 つのカスタム MHC クラスⅠペンタマーと 50 のテストパックサイズに限られます (2) 迅速合成サービスは 注文時での入手可能性に左右されます (3) 提出されたカスタムペプチド配列が カスタムペンタマー合成についての ProImmune 社の設定基準に合格した場合に注文が受け付けられます すべての関連情報が提供され 注文処理が可能になります 注文の受け付け 処理に続き 確認メールがお客様に送付され 発送予定日をお知らせします (4) 各迅速合成カスタムペンタマーには 標準的なカスタムペンタマーセットアップ料金に加えて 迅速合成料金が課されます 詳細はお問合せ下さい 配達予定日は輸送条件や目的地によって異なります 製品リスト カスタム Pro5 MHC クラスⅠペンタマー R-PE APC またはビオチンを用いて標識 別個の R-PE または APC 標識 Pro5 フルオロタグあるいは Pro5 ビオタグとの使用のために未標識 マッチドペプチド 1 mg または 2 mg 量 純度 >70% で入手可能な 同じ特異性の対応するマッチドペプチドは カスタムペンタマーと同時に または注文後に注文しなければなりません 5

8 PRO5 MHC クラス I ペンタマー カスタム Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーおよび抗体キット カスタム Pro5 ペンタマーは FITC 標識された抗 CD8 モノクローナル抗体 ( ヒトまたはマウス ) を含むキットとしても入手可能です カスタム合成セットアップ料金 カスタム Pro5 ペンタマーには 通常 返金不可である少額のセットアップ料金が課され それは各アイテムについて 1 回適用され 注文の受け付け時に ProImmune 社から送り状が送られます セットアップ料金は同じペンタマーの再注文には適用されません カスタムペンタマーの価格には 特異的なカスタムペプチドの合成が含まれます 迅速合成料金 各迅速合成カスタムペンタマーには 標準的なカスタムペンタマーセットアップ料金に加えて 迅速合成料金が課されます 上で設定した迅速合成サービスの仕様に従って料金が課されます ProImmune 社では 関連 MHC アリルへのペプチドの十分な結合に自信がある場合にだけカスタム Pro5 ペンタマーの合成に進みます 通常 SYFPEITHI 予測アルゴリズム ( を使用して 親和性スコアが 21 以上の場合に合成が進みます 結合についての十分な裏付け証拠が得られる場合に より低いスコアリングペプチドが考えられます 標準的なデリバリーカスタム Pro5 ペンタマーは 4 6 週間内に発送します カスタム Pro5 ペンタマー合成に利用可能な MHC アリル Human HLA Mouse H-2 Simian A*01:01 B*07:02 Db Mamu-A*01 A*02:01 B*08:01 Dd Mamu-A*02 A*03:01 B*14:02 Kb A*11:01 B*15:01 Kd A*11:03 B*27:05 Ld A*24:02 B*35:01 A*29:02 B*35:08 A*68:01 B*40:01 B*54:01 Other: Chimeric A*02:01/Kb カスタマーケーススタディ 前立腺癌におけるエピトープの発見マウスにおける PSA の免疫優性 CTL エピトープの特性付けにおける H-2Db/HCIRNKSVI(PSA 65-73) カスタム Pro5 MHC クラスⅠペンタマーの使用 6

9 Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーの特異性 以下の Pro5 ペンタマー複合体はカタログアイテムとしてすべて入手可能です 新しい特異性が増え続けるため お客様の目的とするエピトープがリストにない場合にはお問い合わせ下さい 代わりに 迅速合成または 4 6 週間内 ( 標準合成 ) にお客様の仕様に合わせたカスタムペンタマーを作製することができます キー : S = ストックペンタマー : 早目に発送します A = 利用可能なペンタマー : 追加の調製を必要とする場合としない場合があります 自己免疫 コードアリル 配列 由来 851 A*02:01 HLVEALYLV Insulin B chain A 151 A*02:01 KLQVFLIVL T1D Diabetes human preproinsulin IAPP 5-13 A 954 A*02:01 LNIDLLWSV T1D Diabetes IGRP A 470 A*02:01 SLSRFSWGA Myelin basic protein A 393 A*02:01 VMNILLQYV GAD A PRO5 MHC クラス I ペンタマー 7

10 A2/LML Pentamer R-PE PRO5 MHC クラス I ペンタマー 癌 コードアリル 配列 由来 データ 599 A*02:01 ALDVYNGLL Prostatic Acid Phosphatase Precursor (PAP) A 600 A*02:01 ALFDIESKV PSM P2 (prostate) A 086 A*02:01 ALQPGTALL Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) S 527 A*02:01 ALYVDSLFFL PRAME PRA A 082 A*02:01 ELAGIGILTV MelanA / MART 図 4 S 1013 A*02:01 FLGYLILGV Prostatic Acid Phosphatase (PAP-3) A 404 A*02:01 FLTPKKLQCV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) A 034 A*02:01 FLWGPRALV MAGEA A 813 A*02:01 FVGEFFTDV GPC (overexpressed in hepatocellular carcinoma) A 560 A*02:01 GLMEEMSAL Human Mena protein (overexpressed in breast cancer) A 389 A*02:01 GLYDGMEHL MAGEA A 125 A*02:01 GVLVGVALI Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A 249 A*02:01 HLSTAFARV G250 (renal cell carcinoma) A 085 A*02:01 ILAKFLHWL Telomerase 図 5 S 210 A*02:01 ILHNGAYSL HER-2/neu A 329 A*02:01 ILLWQPIPV Prostatic Acid Phosphatase (PAP-3) A 046 A*02:01 IMDQVPFSV gp100 (pmel17) S 214 A*02:01 KIFGSLAFL HER-2/neu S 646 A*02:01 KLFGTSGQKT EGF-R A 405 A*02:01 KLQCVDLHV Prostate Specific Antigen A 859 A*02:01 KLQDASAEV HM1.24-aa A 057 A*02:01 KTWGQYWQV gp100 (pmel17) A 302 A*02:01 KVAELVHFL MAGEA A 171 A*02:01 KVLEYVIKV MAGEA A 810 A*02:01 LIAHNQVRQV HER-2/neu A 205 A*02:01 LLGRNSFEV p A 690 A*02:01 LLHETDSAV PSMA/PSM-P A 208 A*02:01 LLLLTVLTV MUC A 391 A*02:01 LMLGEFLKL Survivin 図 6 S 338 A*02:01 QLCPICRAPV Livin/ML-IAP A 212 A*02:01 RLLQETELV HER-2/neu S 117 A*02:01 RLVDDFLLV Telomerase Reverse Transcriptase A 1056 A*02:01 SLFLGILSV CD (B cell malignancies) A 390 A*02:01 SLLMWITQV NY-ESO A 1181 A*02:01 SLSEKTVLL CD59 glycoprotein precursor A 958 A*02:01 SLVDVMPWL Cytochrome p450 1B A 915 A*02:01 TLPGYPPHV PAX A 561 A*02:01 TMNGSKSPV Human Mena protein A 097 A*02:01 VISNDVCAQV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) A 689 A*02:01 VLAGGFFLL PSMA A 781 A*02:01 VLDGLDVLL PRAME A 250 A*02:01 VLQELNVTV Leukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) 図 7 S 157 A*02:01 VLYRYGSFSV gp100 (pmel17) A 058 A*02:01 YLEPGPVTA gp100 (pmel17) S 394 A*02:01 YLFFYRKSV mtert A 645 A*02:01 YLNTVQPTCV EGF-R A 447 A*02:01 YLQVNSLQTV Telomerase Reverse Transcriptase (htrt) A A2/ELA Pentamer R-PE % 0.83% 図 4: ヒト PBMC の A*02:01/ ELAGIGILTV( MelanA/MART- 1)Pro5 ペンタマー染色 A2/ILA Pentamer R-PE % 0.32% CD8 PECy5 図 5: 抗原特異的ヒト PBMC の A*02:01/ILAKFLHWL Pro5 ペンタマー染色 % 1.02% CD8 PECy5 図 6: 抗原特異的ヒト PBMC の A*02:01/LMLGEFLKL Pro5 ペンタマー染色 A2/VLQ Pentamer R-PE % 0.11% 図 7:T 細胞株の A*02:01/ VLQELNVTV Pro5 ペンタマー染色 8

11 癌 ( 続き ) コードアリル 配列 由来 データ 075 A*02:01 YLSGANLNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 図 8 S 118 A*03:01 ALLAVGATK gp100 (pmel17) A 264 A*03:01 ATGFKQSSK bcr-abl 210 kda fusion protein A 087 A*03:01 KQSSKALQR bcr-abl 210 kda fusion protein 図 9 S 230 A*24:02 AFLPWHRLF Tyrosinase A 416 A*24:02 EYLQLVFGI MAGEA A 421 A*24:02 TFPDLESEF MAGEA A 209 A*24:02 TYACFVSNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A 417 A*24:02 TYLPTNASL HER-2/neu A 418 A*24:02 VYGFVRACL Telomerase Reverse Transcriptase (htrt) A 094 B*08:01 GFKQSSKAL bcr-abl 210 kda fusion protein 図 10 A 185 H-2Kb SVYDFFVWL Tyrosinase related protein A 814 H-2Kd EYILSLEEL GPC A 150 H-2Ld LPYLGWLVF Tumor Antigen P 図 11 A PRO5 MHC クラス I ペンタマー A2/YLS Pentamer R-PE % 1.24% A3/KQS Pentamer R-PE % 3.89% B8/GFK Pentamer R-PE % 7.62% Ld/LPY Pentamer R-PE % 26.32% 図 8: 抗原特異的ヒト細胞の A*02:01/YLSGANLNL(CEA) Pro5 ペンタマー染色 図 9:T 細胞株の A*03:01/KQS SKALQR Pro5 ペンタマー染色 図 10:T 細胞株の B*08:01/ GFKQSSKAL Pro5 ペンタマー染色 図 11: 抗原特異的脾細胞の H- 2Ld/LPYLGWLVF Pro5 ペンタマー染色 アデノウイルス コードアリル 配列 由来 データ 686 A*01:01 TDLGQNLLY Adenovirus 5 Hexon 図 12 A 684 A*24:02 TYFSLNNKF Adenovirus 5 Hexon 図 13 A 989 B*07:02 KPYSGTAYNAL Adenovirus Hexon A A1/TDL Pentamer R-PE % 3.03% A24/TYF Pentamer R-PE % 0.21% CD8 APC CD8 APC 図 12:T 細胞株の A*01:01/TD LGQNLLY Pro5 ペンタマー染色 図 13:T 細胞株の A*24:02/TY FSLNNKF Pro5 ペンタマー染色 9

12 PRO5 MHC クラス I ペンタマー クラミジア コードアリル配列由来 334 A*02:01 RLNMFTPYI Chlamydia trachomatis MOMP A サイトメガロウイルス (CMV) コードアリル 配列 由来 データ 739 A*01:01 VTEHDTLLY HCMV pp A 266 A*01:01 YSEHPTFTSQY HCMV pp A 008 A*02:01 NLVPMVATV HCMV pp 図 14 S 1598 A*02:01 VLAELVKQI HCMV IE A 1599 A*03:01 KLGGALQAK HCMV IE A 414 A*24:02 QYDPVAALF HCMV pp A 380 A*24:02 VYALPLKML HCMV pp A 308 B*07:02 RPHERNGFTVL HCMV pp 図 15 A 045 B*07:02 TPRVTGGGAM HCMV pp 図 16 S 691 B*08:01 QIKVRVDMV HCMV IE A 114 B*35:01 IPSINVHHY HCMV pp A 278 H-2Dd AGPPRYSRI MCMV m A 021 H-2Ld YPHFMPTNL MCMV IE S A2/NLV Pentamer R-PE % 0.99% 図 14: ヒト PBMC の A*02: 01/NLVPMVATV(CMV pp65) Pro5 ペンタマー染色 B7/RPH Pentamer R-PE % 0.33% 図 15: ヒト PBMC の B*07:02/ RPHERNGFTVL(CMV pp65) Pro5 ペンタマー染色 B7/TPR Pentamer R-PE % 0.13% 図 16: ヒト PBMC の B*07:02/ TPRVTGGGAM(CMV pp65) Pro5 ペンタマー染色 10

13 エプスタイン バーウイルス (EBV) コードアリル 配列 由来 データ 042 A*02:01 CLGGLLTMV EBV LMP 図 17 S 666 A*02:01 FLYALALLL EBV LMP 図 18 A 001 A*02:01 GLCTLVAML EBV BMLF 図 19 S 727 A*03:01 RLRAEAQVK EBV EBNA-3A A 639 A*11:01 ATIGTAMYK EBV BRLF A 199 A*11:01 IVTDFSVIK EBV EBNA A 508 A*11:01 SSCSSCPLSK EBV LMP 図 20 A 648 A*24:02 PYLFWLAAI EBV LMP A 420 A*24:02 TYGPVFMCL EBV LMP A 683 A*24:02 TYGPVFMSL EBV LMP A 044 B*07:02 RPPIFIRRL EBV EBNA-3A 図 21 S 073 B*08:01 FLRGRAYGL EBV EBNA-3A 図 22 S 489 B*08:01 QAKWRLQTL EBV EBNA-3A A 190 B*08:01 RAKFKQLL EBV BZLF 図 23 S 387 B*35:01 HPVGEADYFEY EBV EBNA A 692 B*40:01 IEDPPFNSL EBV LMP A PRO5 MHC クラス I ペンタマー A2/CLG Pentamer R-PE % 23.02% A2/FLY Pentamer R-PE % 2.95% A2/GLC Pentamer R-PE % 0.53% CD8 PECy5 図 17:T 細胞株の A*02:01/CL GGLLTMV Pro5 ペンタマー染色 CD8 PECy5 図 18:T 細胞株の A*02:01/FL YALALLL Pro5 ペンタマー染色 図 19: ヒト PBMC の A*02:01/ GLCTLVAML( EBV BMLF-1) Pro5 ペンタマー染色 A11/SSC Pentamer R-PE % 3.05% CD8 PerCP 図 20:T 細胞株の A*11:01/SS CSSCPLSK Pro5 ペンタマー染色 B7/RPP Pentamer R-PE % 0.09% 図 21: ヒト PBMC の B*07: 02/RPPIFIRRL( EBV EBNA- 3A)Pro5 ペンタマー染色 B8/FLR Pentamer R-PE % 0.44% 図 22: ヒト PBMC の B*08:01/ FLRGRAYGL(EBV EBNA-3A) Pro5 ペンタマー染色 B8/RAK Pentamer R-PE % 0.78% 図 23: ヒト PBMC の B*08: 01/RAKFKQLL(EBV BZLF-1) Pro5 ペンタマー染色 11

14 PRO5 MHC クラス I ペンタマー B 型肝炎ウイルス (HBV) コードアリル 配列 由来 データ 032 A*02:01 FLLSLGIHL HBV Polymerase S 027 A*02:01 FLLTRILTI HBV Envelope S 283 A*02:01 FLPSDFFPSI HBV Core (subtype ADR4) A 023 A*02:01 FLPSDFFPSV HBV Core antigen S 028 A*02:01 GLSPTVWLSV HBV Surface antigen A 031 A*02:01 WLSLLVPFV HBV Surface antigen 図 24 S 377 A*11:01 YVNVNMGLK HBV Core antigen A 378 A*24:02 EYLVSFGVW HBV Core A 413 A*24:02 KYTSFPWLL HBV Polymerase A 422 H-2Kb ILSPFLPLL HBV Surface antigen A 1431 H-2Kb MGLKFRQL HBV Core A 129 H-2Ld IPQSLDSWWTSL HBV Surface antigen S A2/WLS Pentamer APC % 0.08% CD8 PerCP 図 24: ヒト PBMC の A*02:01/ WLSLLVPFV(HBV 表面抗原 ) Pro5 ペンタマー染色 C 型肝炎ウイルス (HCV) コードアリル 配列 由来 1066 A*01:01 ATDALMTGF HCV NS A 740 A*01:01 ATDALMTGY HCV NS A 003 A*02:01 CINGVCWTV HCV NS S 002 A*02:01 DLMGYIPAV HCV Core S 491 A*02:01 DLMGYIPLV HCV Core A 1094 A*02:01 GLQDCTMLV HCV NS5B A 242 A*02:01 KLSGLGINAV HCV NS A 040 A*02:01 KLVALGINAV HCV NS S 172 A*02:01 LLFNILGGWV HCV NS4b A 036 A*02:01 VLSDFKTWL HCV NS5a A 004 A*02:01 YLLPRRGPRL HCV Core A 035 A*03:01 RVCEKMALY HCV NS5B S 415 A*24:02 AYSQQTRGL HCV NS A 845 B*07:02 DPRRRSRNL HCV Core A 742 B*07:02 GPRLGVRAT HCV Core A 721 B*08:01 HSKKKCDEL HCV NS A 942 B*35:01 CPNSSIVY HCV E A 565 B*35:01 HPNIEEVAL HCV NS A 939 B*40:01 REISVPAEIL HCV NS5a A 791 H-2Db GAVQNEVTL HCV NS A 12

15 ヒト免疫不全ウイルス (HIV) コードアリル 配列 由来 データ 430 A*02:01 GLADQLIHL HIV-1 Vif A 084 A*02:01 ILKEPVHGV HIV-1 RT S 246 A*02:01 KLTPLCVTL HIV-1 Env gp A 799 A*02:01 LTFGWCFKL HIV-1 Nef A 010 A*02:01 SLYNTVATL HIV-1 Gag p 図 25 S 174 A*02:01 TLNAWVKVV HIV-1 Gag p 図 26 A 109 A*03:01 QVPLRPMTYK HIV-1 Nef 図 27 S 194 A*03:01 RLRPGGKKK HIV-1 Gag p S 419 A*24:02 RYLKDQQLL HIV-1 Gag gp A 411 A*24:02 RYPLTFGWCY HIV-1 Nef A 196 B*07:02 IPRRIRQGL HIV-1 Env gp A 257 B*07:02 TPGPGVRYPL HIV-1 Nef S 193 B*08:01 FLKEKGGL HIV-1 Nef S 195 B*08:01 GEIYKRWII HIV-1 Gag p A 1072 B*15:01 RLRPGGKKKY HIV-1 p A 294 B*27:05 KRWIILGLNK HIV-1 Gag p A 874 B*27:05 KRWIIMGLNK HIV-1 Gag p A 255 B*35:01 NPDIVIYQY HIV-1 RT A 1211 B*35:01 VPLDEDFRKY HIV-1 RT A 840 B*40:01 KEKGGLEGL HIV-1 Nef A 176 H-2Kd AMQMLKETI HIV-1 Gag p A PRO5 MHC クラス I ペンタマー A2/SLY Pentamer R-PE % 2.0% A2/TLN Pentamer R-PE % 3.58% A3/QVP Pentamer R-PE % 1.11% 図 25: ペプチド結合した抗原提示細胞を用いた 3 回の刺激後での CD8 + T 細胞クローンの A*02:01/ SLYNTVATL Pro5 ペンタマー染色 図 26: ペプチド結合した抗原提示細胞を用いた 3 回の刺激後での CD8 + T 細胞クローンの A*02:01/ TLNAWVKVV Pro5 ペンタマー染色 図 27: ヒト PBMC の A*03:01/ QVPLRPMTYK(HIV-1 nef)pro5 ペンタマー染色 ヒトパピローマウイルス (HPV) コードアリル配列由来 095 A*02:01 YMLDLQPETT HPV 16 E S ヒト T リンパ球向性ウイルス (HTLV) コードアリル配列由来 200 A*02:01 LLFGYPVYV HTLV-1 Tax A 1043 A*24:02 SFHSLHLLF HTLV Tax A 13

16 PRO5 MHC クラス I ペンタマー インフルエンザ コード アリル 配列 由来 データ 076 A*01:01 CTELKLSDY Influenza A (PR8) NP 図 28 A 540 A*01:01 VSDGGPNLY Influenza A PB A 007 A*02:01 GILGFVFTL Influenza A MP 図 29 S 077 A*03:01 ILRGSVAHK Influenza A (PR8) NP 図 30 A 1722 A*11:01 KSMREEYRK Influenza A MP A 1720 A*11:01 RMVLASTTAK Influenza A MP A 1513 A*11:01 SIIPSGPLK Influenza A MP A 1743 B*07:02 QPEWFRNVL Influenza A PB A 1744 B*07:02 SPIVPSFDM Influenza A NP A 463 B*27:05 SRYWAIRTR Influenza A NP A 009 H-2Db ASNENMDAM Influenza A (NT60) NP 図 31 S 119 H-2Db ASNENMETM Influenza A (PR8) NP 図 32 S 120 H-2Db SSLENFRAYV Influenza A (PR8) polymerase acidic protein 図 33 A 240 H-2Kd IYSTVASSL Influenza A HA A 098 H-2Kd TYQRTRALV Influenza A (PR8) NP S A1/CTE Pentamer R-PE % 0.02% 図 28: ヒト PBMC の A*01:01/ CTELKLSDY( インフルエンザ A NP)Pro5 ペンタマー染色 A2/GIL Pentamer R-PE % 1.22% 図 29: ヒト PBMC の A*02:01/ GILGFVFTL(FluMP)Pro5 ペンタマー染色 A3/ILR Pentamer R-PE % 0.07% 図 30: ヒト PBMC の A*03:01/ ILRGSVAHK( インフルエンザ A NP)Pro5 ペンタマー染色 Db/ASN Pentamer R-PE % 12.17% 図 31: 抗原特異的脾細胞の H- 2Db/ASNENMDAM Pro5 ペンタマー染色 Db/ASN Unlabeled Pentamer + R-PE Fluorotag % 0.92% 図 32: 抗原特異的マウス PBMC の H-2Db/ASNENMETM Pro5 ペンタマー染色 Db/SSL Biotin Pentamer + SA-APC % 1.41% 図 33: 抗原特異的マウス PBMC の H-2Db/SSLENFRAYV Pro5 ペンタマー染色 14

17 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) コードアリル配列由来データ 070 H-2Db FQPQNGQFI LCMV NP S 069 H-2Db KAVYNFATC LCMV GP 図 34 S 186 H-2Db SGVENPGGYCL LCMV GP A Db/KAV Pentamer R-PE % 36.23% 図 34: 抗原特異的脾細胞の H- 2Db/KAVYNFATC Pro5 ペンタマー染色 PRO5 MHC クラス I ペンタマー リステリア コードアリル配列由来 178 H-2Kd GYKDGNEYI Listeria monocytogenes Listeriolysin A マラリア コードアリル 配列 由来 データ 314 A*02:01 YLNKIQNSL Plasmodium falciparum CSP A 376 H-2Kd SYIPSAEKI Plasmodium berghei CSP 図 35 A 771 H-2Kd YYIPHQSSL Plasmodium falciparum liver stage antigen A Kd/SYI Pentamer APC % 0.24% 図 35: 抗原特異的マウス脾細胞の H-2Kd/SYIPSAEKI( プラスモディウム ベルゲイ CSP)Pro5 ペンタマー染色 マイナー組織適合抗原 (mihag) コードアリル 配列 由来 175 A*02:01 FIDSYICQV mihag H-Y SMCY A 581 A*02:01 RTLDKVLEV mihag HA-8 A 1113 B*07:02 SPSVDKARAEL mihag SMCY A 328 H-2Db KCSRNRQYL mihag SMCY A 327 H-2Db WMHHNMDLI mihag UTY S 15

18 PRO5 MHC クラス I ペンタマー マイコバクテリウム ツベルクローシス コードアリル 配列 由来 324 A*02:01 GLPVEYLQV Mycobacterium bovis antigen 85-A 6-14 A 276 A*02:01 KLIANNTRV Mycobacterium bovis antigen 85-A A 547 H-2Db AIQGNVTSI Mycobacterium tuberculosis ESAT A 769 H-2Kb IMYNYPAML Mycobacterium tuberculosis TB A 158 H-2Ld MPVGGQSSF Mycobacterium tuberculosis Ag85A A 呼吸器合胞体ウイルス (RSV) コードアリル 配列 由来 801 A*02:01 KMLKEMGEV RSV NP A 149 H-2Kd KYKNAVTEL RSV A strain F protein A 154 H-2Kd SYIGSINNI RSV M A センダイウイルス コードアリル配列由来 056 H-2Kb FAPGNYPAL Sendai virus NP S サル免疫不全ウイルス (SIV) コードアリル 配列 由来 データ 1110 Mamu A*01 CTPYDINQM SIV Gag 図 36 A 1112 Mamu A*02 GSENLKSLY SIV Gag 図 37 A 1111 Mamu A*02 YTSGPGIRY SIV Nef 図 38 A MA1/CTP Pentamer R-PE % CD8 PerCP 図 36:SIVmac251 感染した Mamu-A*01 + /Mamu-A*02 + アカゲザルからの全血の Mamu- A*01/CTPYDINQM Pro5 ペンタマー染色 MA2/GSE Pentamer R-PE % CD8 APC 図 37:SIVmac251 感染した Mamu-A*01 + /Mamu-A*02 + アカゲザルからの全血の Mamu- A*02/GSENLKSLY Pro5 ペンタマー染色 MA2/YTS Pentamer APC % CD8 PerCP 図 38:SIVmac251 感染した Mamu-A*01 + /Mamu-A*02 + アカゲザルからの全血の Mamu- A*02/YTSGPGIRY Pro5 ペンタマー染色 16

19 クルーズ トリパノソーマ コードアリル 配列 由来 708 H-2Kb ANYNFTLV Trypanosoma cruzi SP A 964 H-2Kb VNHRFTLV Trypanosoma cruzi ASP A ワクシニアウイルス コードアリル 配列 由来 978 A*02:01 ILDDNLYKV Vaccinia virus Copenhagen protein G A 703 A*02:01 KVDDTFYYV Vaccinia virus host range protein A PRO5 MHC クラス I ペンタマー 水疱性口内炎ウイルス (VSV) コードアリル配列由来 373 H-2Kb RGYVYQGL VSV NP A 622 H-2Ld MPYLIDFGL VSV N A 黄熱 コードアリル配列 由来 1182 H-2Kb ATLTYRML Yellow Fever virus 17D polyprotein A ウエストナイルウイルス コードアリル配列 由来 1322 A*02:01 ATWAENIQV West Nile virus NY-99 polyprotein precursor A 1320 A*02:01 RLDDDGNFQL West Nile virus NY-99 polyprotein precursor A 1327 A*02:01 YTMDGEYRL West Nile virus NY-99 polyprotein precursor A 663 H-2Db LGMSNRDFL West Nile virus polyprotein A 17

20 PRO5 MHC クラス I ペンタマー その他 コードアリル 配列 由来 133 A*02:01 LLDVPTAAV Interferon gamma inducible protein (GILT) A 366 A*02:01 LMWYELSKI KSHV-8 gb A 1153 A*02:01 QLFNHTMFI Non-muscle Myosin A 353 A*02:01 RILGAVAKV Vinculin A 1152 A*02:01 VLMIKALEL Non-muscle Myosin A 773 A*02:01 VLPLTVAEV Mesothelin A 828 H-2Kb KSPWFTTL MuLV Env A 188 H-2Kb SSIEFARL HSV-1 gp B A 488 H-2Kb VVYDFLKL SV40 T antigen A 458 H-2Kd KYNKANVFL NRP-V7 superagonist peptide for 8.3 Tg NOD mouse A 062 H-2Kd RYLKNGKETL HLA-Cw A モデル抗原 コードアリル配列 由来 データ 908 H-2Kb KVVRFDKL Ovalbumin (subdominant) A 093 H-2Kb SIINFEKL Ovalbumin 図 S 198 H-2Kd HYLSTQSAL Enhanced Green Fluorescent Protein (egfp) A 074 H-2Ld TPHPARIGL E. coli beta-galactosidase S Kb/SII Pentamer R-PE % 0.39% 図 39: 抗原特異的マウス脾細胞の H-2Kb/SIIN- FEKL( オバルブミン )Pro5 ペンタマー染色 Kb/SII Pentamer R-PE % 12.91% 図 40: OT-1 トランスジェニックマウスからの脾細胞の H-2Kb/SI- INFEKL( オバルブミン )Pro5 ペンタマー染色 ネガティブコントロール コードアリル配列由来データ N01 A*02:01 Negative Negative Control 図 3 S HLA-E コードアリル配列由来データ 712 E*01:01 VMAPRTLIL HLA-C leader sequence peptide S 18

21 Pro5 カタログおよびカスタムペンタマー製品コード コード Pro5 ペンタマー コード Pro5 ペンタマー & 抗 CD8キット F1A 50 tests Biotin F81A 50 tests Biotin + anti- F1B 150 tests Biotin F81B 150 tests Biotin + anti- F1C 500 tests Biotin F81C 500 tests Biotin + anti- F2A 50 tests R-PE F82A 50 tests R-PE + anti- F2B 150 tests R-PE F82B 150 tests R-PE + anti- F2C 500 tests R-PE F82C 500 tests R-PE + anti- F4A 50 tests APC F84A 50 tests APC + anti- F4B 150 tests APC F84B 150 tests APC + anti- F4C 500 tests APC F84C 500 tests APC + anti- F0A 50 tests unlabeled F80A 50 tests unlabeled + anti- F0B 150 tests unlabeled F80B 150 tests unlabeled + anti- F0C 500 tests unlabeled F80C 500 tests unlabeled + anti- Pro5 ペンタマーの 1test の容量は 約 個の PBMC を染色するために十分です PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 フルオロタグおよび Pro5 ビオタグ製品コードフローサイトメトリーにおける未標識カタログおよびカスタム Pro5 ペンタマーの使用のためのプロトコールでは 追加の Pro5 フルオロタグ (R-PE APC) 分子または Pro5 ビオタグ ( ビオチン ) 分子が必要です これらは tests 分の容量で入手可能です コード 標識 コード 標識 K1A 50 tests Biotag K4A 50 tests Fluorotag APC label K1B 150 tests Biotag K4B 150 tests Fluorotag APC label K1C 500 tests Biotag K4C 500 tests Fluorotag APC label K2A 50 tests Fluorotag R-PE label K2B 150 tests Fluorotag R-PE label K2C 500 tests Fluorotag R-PE label マッチドペプチド製品コード ProImmune 社は すべてのカタログペプチドの特異性およびカスタム Pro5 ペンタマーについてのマッチドペプチドを提供します マッチドペプチドは 1 mg または 2 mg 量の凍結乾燥品で提供し 純度 >70%( 免疫グレード ) を保証します インビトロでの T 細胞刺激実験に適しており 別々の標準カスタムペプチド合成と比較してはるかに低コストで購入できます コード量 P0A 1mg lyophilized peptide P0B 2mg lyophilized peptide 純度 >70% (Immunograde) >70% (Immunograde) 19

22 PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーの特性 再現性 ProImmune 社では Pro5 ペンタマーの設計と製造において タンパク質工学での長年の経験を引き継いでいます 弊社で確立された徹底した品質管理と品質保証手段によって 抗原特異的 CD8 + T 細胞の検出のための最も一貫した技術を使用者が手にしていることを確信できます 柔軟な標識オプションお客様の研究での最適な柔軟性のために Pro5 ペンタマーは R-PE APC またはビオチンで標識して あるいは追加の Pro5 フルオロタグまたは Pro5 ビオタグを用いる未標識で注文することができます 直接標識された Pro5 ペンタマーを 4 で保存して 迅速かつ便利に使用できます 複数ペプチドの特異性について 1 つのドナーサンプルを分析する場合に特に有用です 1 つのドナーサンプルを 標識ペンタマーを用いた二重または三重染色により 同時に染色し複数の特異性について分析することができます これによって免疫応答のより完全なプロファイルが作成され 染色に必要な細胞数を減らすことができます この目的のために R-PE 標識 APC 標識 ビオチン標識ペンタマーの任意の組み合わせを使用することができます 未標識 Pro5 ペンタマーを 80 で保存でき この条件下で 12 ヶ月間保証され 長期試験のために申し分ありません 試験開始時にバリデーションを行うことによって 数ヶ月毎に新しいロットを買って再試験する必要がなく 時間が節約されます 150 回または 500 テスト分の未標識ペンタマーを購入することで 大幅割引されるという特典もあります 未標識 Pro5 ペンタマーによって 同じ複合体を多くの異なる蛍光色素と使用できる点で 使用者はさらに柔軟に染色することができます 特に 特定の色でのみ利用可能である細胞表面マーカーや細胞内タンパク質に対する抗体を選択する場合に この特性によって実験計画がより適応可能になります 親和性 :T 細胞の検出感度の改善その高い親和性のため Pro5 ペンタマーは 低親和性 T 細胞を検出するための的確なツールであり MHC マルチマー技術の適用範囲を広げます 検出シグナルの明るさを増加させることによって ペンタマーは 希少な抗原特異的 T 細胞を検出する際により高い感度を示します そのユニークな立体構造の結果として ProImmune 社の Pro5 ペンタマーは その T 細胞受容体との高度に安定した相互作用を示し 結合時から数時間続きます 以下には ペンタマーとテトラマーの間での binding competition experiment を示します 分離した MHC マルチマーが T 細胞に再結合するのを妨げるブロッキング抗 HLA2.1 抗体を使用して結合の安定性を推定しました ペンタマーは テトラマーよりも競合に対して有意に抵抗性が高いことを示しています 図 41 Percentage bound (%) Tetramer Pentamer Time (minutes) 360 図 41: 抗原特異的 T 細胞に対する MHC マルチマー結合の安定性 A*02:01/GLCTLVAML 抗原特異的細胞を Pro5 ペンタマーまたはテトラマーとインキュベートした 細胞を洗浄し 抗 とインキュベートし 再度洗浄し 25 µg/ml の抗 HLA-A2 抗体 ( クローン BB7.2) を含む PBS 洗浄液中に再懸濁し 室温の暗室中で放置した 適切な時間間隔で フローサイトメトリーにより細胞を分析した 抗 HLA-A2 抗体は 分離した MHC マルチマーが細胞に再結合するのを遮断する 結果は 結合したもとの MHC マルチマーの任意の時間での残存パーセンテージを示す 平均 12.8% のペンタマーが 6 時間後に細胞に結合したままである ( テトラマーでは 3.5%) ペンタマーはテトラマーよりも高い結合親和性を示す 20

23 安定性 Pro5 ペンタマーは 推奨条件下で保存した場合 発送日より 6 ヶ月間保証されます ProImmune 社では ペンタマー複合体の安定性をチェックするためのテストを継続的に行っています 図は 2 つの R-PE 標識ヒトペンタマーについての安定性データの例を示しています 図 42 A*02:01/GILGFVFTL (Flu) Pentamer R-PE 0 months 3 months 6 months % 0.06% 0.01% 0.10% 0.01% 0.09% PRO5 MHC クラス I ペンタマー B*08:01/RAKFKQLL (EBV) Pentamer R-PE months 3 months 6 months % 0.88% 0.03% 0.97% 0.05% 0.85% 図 42:2 つの R-PE 標識ヒト Pro5 ペンタマーを 抱合から ヶ月後に 同じドナー末梢血細胞 (PBMC) でテストした その間 4 の暗室で保存した 各時間点で 個の PBMC を R-PE 標識ペンタマー 続いて抗 で染色した 同じ機器と機器設定を使用して 各時間点でフローサイトメトリーにより分析した 各時間で同程度に抗原特異的に染色された ( 赤で囲っている ) 4 で保存された場合 これらの特定のペンタマーの特異性が 6 ヶ月間安定であることを示している 21

24 PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーの染色プロトコール 図 43 標識ペンタマー染色プロトコール チューブに 個細胞 /50µl を用意 + 1test 分の標識 Pro5 MHC ペンタマー ( 例 R-PE) 10 分間室温でインキュベート後に洗浄 未標識ペンタマー染色プロトコール チューブに 個細胞 /50µl を用意 + 1test 分の未標識 Pro5 MHC ペンタマー 10 分間室温でインキュベート後に洗浄 + 抗 CD8 mab ( 例 FITC 標識 ) 20 分間氷上でインキュベート Pro5 フルオロタグ ( 例 R-PE) 抗 CD8 mab ( 例 FITC 標識 ) 20 分間氷上でインキュベート 2 回洗浄 2 回洗浄 ペンタマー ペンタマー CD8 フローサイトメトリーによる分析 CD8 フローサイトメトリーによる分析 22

25 Pro5 ペンタマーとその適用についての追加情報ビオチン標識 Pro5 MHC クラスⅠペンタマー サルのアリルの Pro5 MHC クラスⅠペンタマー 非特異的染色の除外 いくつかの標識 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを用いた複数の特異性についての染色 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを用いた抗原特異的 T 細胞の詳細な表現型分析 PRO5 MHC クラス I ペンタマー Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーと細胞内サイトカインの染色 リンパ球の 0.02% ほどの希少な抗原特異的 T 細胞集団を検出し 分離するために Pro5 ペンタマーを容易に使用することができます しかし すべての抗原特異的 T 細胞が機能的であるわけではなく 機能細胞の割合には個人差があり 疾患によりばらつきます 細胞内サイトカインについての追加の同時染色を使用して 抗原特異的 T 細胞の免疫エフェクター機能を研究することができます サイトカイン産生は 免疫応答において重要な役割を果たします サイトカインの役割の例として インターフェロンガンマ (IFNγ) による多くの抗ウイルスタンパク質の誘導 インターロイキン 2 による T 細胞増殖の誘導 および腫瘍壊死因子 αによるウイルスの遺伝子発現と複製の阻害があげられます サイトカインはあらかじめ形成された因子ではなく 代わりに 関連する刺激時に迅速に産生され 分泌されます このように T 細胞の細胞内サイトカイン染色は 細胞内にサイトカインを保持するためのタンパク質輸送の阻害剤の存在において これらの細胞刺激に依存します サイトカイン産生を引き起こす細胞活性化は 一般的に T 細胞受容体を下方調節します そのため T 細胞の特異性の同時検出が必要な場合 Pro5 ペンタマーを活性化前に染色して 良好な染色レベルを確保します ペンタマーが この間に T 細胞受容体と内在化することがありますが 透過性細胞において依然として検出することができます 抗原特異的 T 細胞のエフェクター機能を分析するために 最初に細胞をペンタマーで染色し 次に抗原で刺激します この後に 細胞外エピトープ (CD8 など ) に特異的な抗体での染色 次に膜透過処理 細胞内サイトカイン染色が続きます Pro5 ペンタマーでの細胞内サイトカイン染色によって 抗原刺激に対して機能的に応答する抗原特異的 CD8 + T 細胞の割合を決定することができます この結果として 特異的な免疫応答をモニタリングし 異なる疾患に対する応答における基本的な違いが分かることがあります 23

26 PRO5 MHC クラス I ペンタマー 図 44 Pentamer R-PE Pentamer R-PE % 2.59% 26.72% 10 4 IFNγ FITC (a) Positive Control for IFNγ staining (c) Negative Control for Pentamer staining % 0.06% 10 4 IFNγ FITC 0.58% (b) Negative Control for IFNγ staining 3.39% 0.04% 0.01% % (d) Experimental conditions 0.52% 0.05% 10 4 図 44: 図は 生きたリンパ球での IFNγ 対 Pro5 ペンタマー染色を示す PBMC を ネガティブコントロール ( 非特異的 ) ペンタマー A*02:01/GLCTLVAML(EBV) または目的の細胞に特異的なペンタマー B*08:01/RAKFKQLL (EBV) とインキュベートし 次にブレフェルジン A の存在下で 16 時間にわたり PMA とイオノマイシン ( 非特異的な活性化 ) または RAKFKQLL ペプチド ( 特異的なペプチド活性化 ) で刺激した ヒト細胞内タンパク質についてのペンタマー染色プロトコールに詳述される通りに正確に固定 透過処理 IFNγ 染色を行った 結果は IFNγ 分泌が活性化細胞に特異的であること (a c d) ペンタマー陽性細胞の 26% が 16 時間のインキュベーションの間に IFNγ を分泌したこと (d) を示す (a) 目的の細胞に特異的なペンタマー B*08: 01/RAK で染色し 次にブレフェルジン A の存在下で 16 時間にわたり PMA とイオノマイシン ( 非特異的な活性化 ) で刺激した PBMC (b) 目的の細胞に特異的なペンタマー B*08: 01/RAK で染色し ブレフェルジン A のみの存在下で 16 時間にわたりインキュベートした PBMC (c) ネガティブコントロール ( 非特異的 ) ペンタマー A*02:01/GLC で染色し ブレフェルジン A の存在下で 16 時間にわたり RAKFKQLL ペプチド ( 特異的なペプチド活性化 ) とインキュベートした PBMC (d) 目的の細胞に特異的なペンタマー B*08: 01/RAK で染色し 次にブレフェルジン A の存在下で 16 時間にわたり RAKFKQLL ペプチド ( 特異的なペプチド活性化 ) で刺激した PBMC カスタマーケーススタディは以下のホームページで入手可能です Pro5 MHC クラスⅠペンタマーと細胞内サイトカイン染色との併用は タンパク質翻訳がどのように抗原提示の分子力学に影響を及ぼすかを示します HIV 特異的 Pro5 MHC クラスⅠペンタマーと細胞内サイトカイン染色を併用した試験は T 細胞ワクチンの開発のための有用なデータを提供する 24

27 Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーと磁気ビーズを使用した抗原特異的 T 細胞の濃縮 抗原特異的 T 細胞の検出の他 Pro5 ペンタマーを磁気ビーズと併用して 目的の T 細胞集団を濃縮または除去することができます 磁気ビーズによるセレクションは抗原特異的 T 細胞の濃縮または除去を必要とする適用のための簡単な答えです ( 例 治療適用の開発 T 細胞株の作製 PCR クローニング 遺伝子プロファイリング 細胞培養実験 ) あるいは 蛍光活性化細胞選別 (FACS) 前の前濃縮段階として磁気ビーズ選別を使用する場合 選別しなければならない細胞数が減り 選別の所要時間が短縮するでしょう 現在 磁気ビーズ分離の 2 つの主な技術として カラムを使用した方法とチューブを使用した方法があります 図 45 に示します カラムを使用した方法では 強力な永久磁石内で 細胞 -ビーズ複合体が分離カラムを通過します カラムマトリクスはビーズに結合した細胞を保持し 未標識細胞は流れます 磁場からのカラムの除去後 保持された細胞は溶出されます 図 46 は カラムを使用した磁気分離方法を用いた実験を示します PRO5 MHC クラス I ペンタマー チューブを使用した方法では チューブの内縁に複合体を引きつける外部磁石を使用して細胞浮遊液から細胞 - ビーズ複合体を除去し 上清を除去します 磁場からチューブを取り外して 細胞 -ビーズ複合体を再浮遊させることができます 図 47 は チューブを使用した磁気分離方法を用いた実験を示します 図 45 T 細胞 洗浄 抗原特異的 T 細胞を Pro5 MHC ペンタマーを用いて標識する T 細胞 Pro5 ペンタマーは磁気ビーズに結合する カラム分離 洗浄 チューブ分離 陰性分画として回収されたフロースルー 標的細胞をチューブ壁に引き付け 上清を陰性分画として回収することができる チューブを磁場から外し 残りの陽性選択された細胞を洗浄し 浮遊させて使用する カラムを磁場から外し 保持された標的細胞を陽性選択された細胞として洗い出す 濃縮細胞を フローサイトメトリー分析用抗体で標識してもよい 25

28 PRO5 MHC クラス I ペンタマー 図 46 Pentamer R-PE Pre-sort Positive fraction 1 Positive fraction % 38.69% 81.59% 図 46: 図は カラムを使用した磁気分離方法を用いて 末梢血細胞 (PBMC) から抗原特異的 T 細胞を濃縮した実験を示す 個の PBMC を 5 回テスト分 (50 µl) の R-PE 標識ペンタマーと 10 分間 室温 (22 ) で 続いて 20 µl の抗 R-PE マイクロビーズ (Miltenyi Biotec) と 15 分間 4 でインキュベートした MidiMACS システムを使用した MS カラムに細胞を通し 通過分画を捨てた 磁場からカラムを取り外し 保持された標的細胞を 陽性選択された細胞 ( 陽性分画 1) として流し出した 第 2 の MS カラムにこれらの細胞を通し 目的の抗原特異的 T 細胞をさらに濃縮した ( 陽性分画 2) 結果として得られた細胞を 固定およびフローサイトメトリー分析の前に 抗 CD8 抗体と 20 分間 氷上 (4 ) でインキュベートした (Miltenyi マイクロビーズのサイズが小さいため ビーズが付着したままでフローサイトメトリーにより細胞を分析できる ) 図 47 Pre-depletion Post-depletion % 0.04% Pentamer R-PE 図 47: ビオチン標識 Pro5 ペンタマーと LodeStarsTM 2.7 ストレプトアビジン (Polymer Laboratories) を使用して末梢血浮遊液から抗原特異的細胞を除去させた 最初の細胞集団のサンプル ( 除去前 ) と分離後の上清 ( 除去後の陰性分画 ) を 抗 抗体 + ストレプトアビジン R-PE とインキュベートし 抗原特異的細胞を可視化した 抗原特異的集団が 1.53% から 0.04% に減少し ビーズ単離の成功が確認された (97.4% の抗原特異的細胞が除去された ) カスタマーケーススタディ 続く表現型分析のための HBV 特異的 T 細胞を分離するために使用した Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマー 26

29 Pro5 MHC クラス Ⅰ ペンタマーを用いた組織染色 インサイツでの抗原特異的 T 細胞の追跡免疫応答の動的性質に関する知識の多くが MHC マルチマー技術の使用から得られています 現在 抗原特異的 T 細胞の直接的なインサイツでの可視化により免疫応答の空間的および時間的関係の理解を深める機会があります Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを使用して リンパ器官 末梢組織 腫瘍浸潤巣からの生きた組織切片を染色することができます 蛍光抗 CD8 抗体と蛍光 Pro5 ペンタマーを用いた二重染色を行うことで 抗原特異的 T 細胞を蛍光顕微鏡により可視化することができます カスタマーケーススタディペンタマーを使用したアロ特異的 B 細胞のインサイツでの同定 PRO5 MHC クラス I ペンタマー ワクチンと免疫療法の開発 フローサイトメトリーにより抗原特異的 T 細胞応答レベルを正確に定量化することにより免疫療法とワクチンの作用機序を分析するために Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを使用することができます ProImmune 社は 広範なストックと注文試薬を提供し お客様の試験を成功させる手助けをすることができます 浜松医科大学 ( 日本 ) の科学者は 新規の免疫化戦略の開発に成功しております Yagi et al. (2006). Induction of Therapeutically Relevant Cytotoxic T Lymphocytes in Humans by Percutaneous Peptide Immunization. Cancer Research 66 p [PubMed ID: ] Yagi らによるこの試験では 新規の経皮免疫化戦略を使用して メラノーマ患者にペプチドワクチンを送達しています この経皮ペプチド免疫化 (PPI) 方法では 免疫系に効果的にワクチンを送達するための抗原提示細胞として表皮ランゲルハンス細胞が使用されています ペプチドワクチンに対する皮膚の透過性を増加させるために表皮の外層を除去し 抗原提示を高めるためにランゲルハンス細胞を成熟させることができます MAGE-2 用の Pro5 MHC ペンタマー (A*24:02 / EYLQLVFGI) チロシナーゼ用の Pro5 MHC ペンタマー (A*24:02 / AFLPWHRLF) MAGE-3 用のカスタム Pro5 MHC ペンタマー (A*24:02 / IMPKAGLLI) を使用して 免疫化後の患者において抗原特異的 T 細胞の頻度をモニターしました 数回の免疫化後 Pro5 MHC ペンタマーでの染色は メラノーマ患者と健常対照者において抗原特異的応答が 6 ヶ月間にわたり増加することを示しました 27

30 PRO5 MHC クラス I ペンタマー 図 48 図 48: ペンタマー陽性 CD8 + T 細胞の誘導 各 PPI から 7 日後に得られた PBMC を チロシナーゼ MAGE-2 MAGE-3 用のペンタマーを用いて免疫表現型分析し フローサイトメトリーにより分析した 図 49 メラノーマ患者の 1 人における腫瘍浸潤白血球のさらなる分析では MAGE-2 MAGE-3 チロシナーゼ特異的 CD8 + 細胞がこれらのサンプル中に存在することが示された 図 49: PPI により誘導されたメラノーマ病変中への CTL のインビボでの浸潤 PPI 中の患者 2 における退行する皮下結節から得られた細胞浮遊液のフローサイトメトリープロファイルは CD45 + 細胞ゲート白血球中での CD4 + CD8 + 細胞の割合と CD8 + CD45 + 細胞ゲート集団中でのペンタマー + 細胞の割合を示す 腫瘍サイズと進行が低下したこれらのペンタマー陽性の細胞傷害性 T 細胞の存在は バリヤ破壊された皮膚に送達された経皮ペプチドワクチンが効果的であり 安全で非侵襲的であったことを示す 28

31 カスタマーケーススタディ H5N1 ワクチンに関する CDC 試験では Pro5 ペンタマーを使用して 免疫応答と防御との相関関係を示します ワクチンの安全性を評価するために使用される Pro5 MHC クラスⅠペンタマー 新しいアジュバントはこれまでに例のない細胞傷害性 T 細胞応答を促進し 強力なワクチン開発プラットフォームを提供します ペンタマーは 研究を癌免疫療法に進めるための試験においてアロ制限 T 細胞を同定します PTLD 処置のための救命手順において中心となる Pro5 ペンタマー PRO5 MHC クラス I ペンタマー ヒトとマウスの CD1d テトラマー 唯一の CD1d テトラマー供給業者 α-galcer 結合 CD1d テトラマーの唯一の供給元 ナチュラルキラー T(NKT) 細胞は 広範な疾患に関連する免疫応答の調節に関与し 免疫のいくつかの局面に必須であると思われます NK 細胞マーカーと半変異体 T 細胞受容体を同時発現するユニークなリンパ球集合を示します CD1d- 糖脂質リガンド複合体抗原で刺激した場合 NKT 細胞は多量の Th1 型および / または Th2 型サイトカインを産生し それらは下流で樹状細胞 NK 細胞 B 細胞 T 細胞を活性化します NKT 細胞の機能 障害または欠損は 癌や自己免疫疾患 ( 例 糖尿病やアテローム性動脈硬化症 ) を発症させることが示されており ヒトの喘息での疾患進行にも関与しています テトラマー CD1d- 脂質リガンド複合体は 特定の特異性 ( 使用した脂質リガンドにより決定 ) を持つ NKT 細胞の T 細胞受容体に結合し フローサイトメトリーによる抗原特異的な CD1d 制限 NKT 細胞の同定と計数を可能にします 細胞内サイトカイン ( 例 IFN ガンマや IL-2) と表面マーカー ( 例 CD69) の追加の同時染色によって 抗原特異的サブセットについての機能データを得ることができます さらなる利便性のためのリガンド (α-galcer) 結合済 CD1d テトラマー ProImmune 社は 蛍光標識されたヒトおよびマウスの CD1d テトラマーの世界で唯一の供給業者です テトラマーは アルファ-ガラクトシルセラミド * (α-galcer) をあらかじめ結合させて または好みのリガンドを結合させるために空の状態で入手可能です 弊社のテトラマーは リガンドのアナログ ( 例 PBS57) を結合している非商業的な供給源からの CD1d テトラマーとは異なり 認可された α-galcer を結合しています さらに 弊社のテトラマーは お客様の注文を受けて早目に発送され お客様が研究プロジェクトを効果的に計画し 進めることができます リガンド未結合 CD1d テトラマーは 代替 CD1d リガンドをテストする実験のために推奨され ネガティブコントロールとしての使用のためには推奨されません 29

32 PRO5 MHC クラス I ペンタマー ヒトとマウスの CD1d テトラマーネガティブコントロール ProImmune 社は ヒトとマウスの蛍光 CD1d ネガティブコントロールテトラマーを供給し それは担体のみで ( リガンドは結合されていない ) NKT 細胞に結合しません ネガティブコントロール試薬とリガンドを結合させた CD1d テトラマーとの併用によって 低頻度の陽性集団を正確に定量化することができます ( 注意 : ネガティブコントロール CD1d テトラマーでは リガンドを結合させることはできません ) ヒト CD1d テトラマー R-PE 標識して α-galcer 結合ヒト CD1d テトラマーを PBMC を用いてテストしました ( 図 50) 図 50 αgalcer loaded human CD1d R-PE CD3 1.35% 0.02% Human CD1d Negative Control R-PE CD3 図 50: 個の細胞を 1test 量 (0.5 µl) の R-PE 標識した α-galcer 結合 CD1d テトラマーまたは 1 回テスト量 (0.5 µl) の R-PE 標識した CD1d テトラマーネガティブコントロールと 4 で 30 分間インキュベートした フローサイトメトリーによる分析のためにサンプルを固定した CD1d テトラマー対 CD3 をプロットする前に CD19 陰性細胞でのゲーティングによるプロットから非特異的染色を除外した * アルファ - ガラクトシルセラミド分子とその誘導体は キリンファーマが保有する米国特許第 5,936,076 号で保護されています α-galcer 分子は 世界中での研究における使用のためにフナコシ株式会社にライセンスされています マウス CD1d テトラマー ハーバード メディカル スクール ( 米国 ) の Markus Skold 博士と Sam Behar 博士は B 細胞を除去させた未感作 B6 マウスからの脾細胞を用いて ProImmune 社のマウス CD1d R-PE 標識テトラマーをテストしました ( 図 51) テトラマーを リガンドなしの状態で または α-galcer で結合させて使用しました また 細胞を 抗 CD4 Alexa488 および抗 CD3 PerCP モノクローナル抗体と染色して 生きた CD3 陽性細胞でゲーティングしました バックグラウンド染色を減らすために 抗 CD19 マイクロビーズ (Miltenyi Biotec) を使用して B 細胞から脾細胞を除去させました 図 51 empty αgal Cer loaded % 0.25% Mu CD1d R-PE 図 51: この手順では 1 株当たり 個の細胞を使用した Fc 受容体を遮断するために 細胞を 1 サンプル当たり 50 µl 中の 2.4G2 モノクローナル抗体 (25 µg/ml) と 4 で 15 分間インキュベートした 1 回の洗浄工程後 細胞を 1test 量 (2 µl) の CD1d テトラマーと 30 分間インキュベートした 細胞を 抗 CD4 Alexa488 および抗 CD3 PerCP モノクローナル抗体と 総容積 50 µl 中で 4 で 20 分間インキュベートした さらに 2 回の洗浄後 細胞を回収し フローサイトメトリーにより分析した CD4 Alexa488 CD4 Alexa488 30

33 CD1d テトラマーを用いたカスタマーケーススタディホームページをご覧下さい : ProImmune 社のマウス CD1d テトラマーを使用して NKT 細胞活性と 1 型糖尿病からの防御との相関関係を示しています CD1d テトラマーを使用して マウスにおけるイソグロボトリヘキソシルセラミド (igb3) リガンドの有意性について得られた洞察 蠕虫病における後天的免疫応答において NKT 細胞が重要であるとの証拠に CD1d テトラマーの使用が貢献します CD1d テトラマーは inkt 細胞の分化経路の理解に役立ちます ProImmune 社のヒト CD1d テトラマーによって 非ヒト霊長類から NKT 細胞が検出されます PRO5 MHC クラス I ペンタマー 31

34 PRO5 MHC クラス I ペンタマー 有用なリンク集 MHC アリルの頻度 ペンタマー染色プロトコール Pro5 MHC クラスⅠペンタマーを引用した論文オンラインの全論文リスト 日本人顧客による論文選集 Hamasaki T, Clin Vaccine Immunol. 207(5): Modulation of gene expression related to Toll-like receptor signaling in dendritic cells by poly(gamma-glutamic acid) nanoparticles. PMID: Hayashi D, J Neuroimmunol (1-2): Reduced Foxp3 expression with increased cytomegalovirus-specific CTL in HTLV-I-associated myelopathy. PMID: Koido S, Int J Cancer (4): Induction of antigen-specific CD4- and CD8-mediated T-cell responses by fusions of autologous dendritic cells and metastatic colorectal cancer cells. PMID: Koido S, Clin Immunol. 2035(3): Dendritic/pancreatic carcinoma fusions for clinical use: Comparative functional analysis of healthy- versus patient-derived fusions. PMID: Koido S, J Immunol (7): Synergistic induction of antigen-specific CTL by fusions of TLR-stimulated dendritic cells and heat-stressed tumor cells. PMID: Koido S, J Transl Med :51. In vitro generation of cytotoxic and regulatory T cells by fusions of human dendritic cells and hepatocellular carcinoma cells. PMID: Koido S, J Immunol (1): Streptococcal preparation OK-432 promotes fusion efficiency and enhances induction of antigen-specific CTL by fusions of dendritic cells and colorectal cancer cells. PMID: Koido S, Clin Cancer Res (21): Dendritic cells fused with allogeneic colorectal cancer cell line present multiple colorectal cancer-specific antigens and induce antitumor immunity against autologous tumor cells. PMID: Komatsu H,BMC Infect Dis. 200:103. Cellular immunity in children with successful immunoprophylactic treatment for mother-to-child transmission of hepatitis B virus. PMID: Matsumoto S, Cancer Immunol Immunother (2): Allogeneic gastric cancer cell-dendritic cell hybrids induce tumor antigen (carcinoembryonic antigen) specific CD8+ T cells. PMID: Matsuura E, J Neuropathol Exp Neurol (1):41-9. Inclusion Body Myositis Associated With Human T-Lymphotropic Virus-Type I Infection: Eleven Patients From an Endemic Area in Japan. PMID: Morita Y, Int J Cancer (6): Monitoring of WT1-specific cytotoxic T lymphocytes after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. PMID: Omoto Y, J Dermatol Sci (2): Granzyme B is a novel interleukin-18 converting enzyme. PMID: Sakakibara M, Cancer Immunol Immunother Jun 17. [Epub ahead of print. Comprehensive immunological analyses of colorectal cancer patients in the phase I/II study of quickly matured dendritic cell vaccine pulsed with carcinoembryonic antigen peptide. PMID: Shimizu T, Gene (1-2):31-8. HLA-B62 as a possible ligand for the human homologue of mouse macrophage MHC receptor 2 (MMR2) on monocytes. PMID:

35 Soeda A, Jpn J Clin Oncol (12): Long-Term Administration of Wilms Tumor-1 Peptide Vaccine in Combination with Gemcitabine Causes Severe Local Skin Inflammation at Injection Sites. PMID: Takamura S, J Immunol. 2084(9): Premature terminal exhaustion of Friend virus-specific effector CD8+ T cells by rapid induction of multiple inhibitory receptors. PMID: Takata Y, Cancer Lett (2): Frequency of CD45RO+ subset in CD4+CD25high regulatory T cells associated with progression of hepatocellular carcinoma. PMID: Takayama E, Int J Parasitol (13): Quantitative and qualitative features of heterologous virus-vectorinduced antigen-specific CD8+ T cells against Trypanosoma cruzi infection. PMID: Tanaka K, J Immunol (8): Role of the indigenous microbiota in maintaining the virus-specific CD8 memory T cells in the lung of mice infected with murine cytomegalovirus. PMID: Tashiro-Yamaji J, Gene :1-8. Macrophage MHC receptor 2: A novel receptor on allograft (H-2DdKd)-induced macrophage (H-2DbKb) recognizing an MHC class I molecule, H-2Kd, in mice. PMID: Uto T, Biochem Biophys Res Commun (2): Improvement of adaptive immunity by antigen-carrying biodegradable nanoparticles. PMID: Wang XJ, Virol (18): Induction of potent CD8+ T-cell responses by novel biodegradable nanoparticles carrying human immunodeficiency virus type 1 gp120. PMID: PRO5 MHC クラス I ペンタマー Yagi H, Cancer Res (20): Induction of therapeutically relevant cytotoxic T lymphocytes in humans by percutaneous peptide immunization. PMID: Yasuda T, Cancer Immunol Immunother (7): Superior anti-tumor protection and therapeutic efficacy of vaccination with allogeneic and semiallogeneic dendritic cell/tumor cell fusion hybrids for murine colon adenocarcinoma. PMID: Yasuda T, Cancer Immunol Immunother (7): Superior anti-tumor protection and therapeutic efficacy of vaccination with allogeneic and semiallogeneic dendritic cell/tumor cell fusion hybrids for murine colon adenocarcinoma. PMID: Yoshikawa T, Cancer Sci (5): HLA-A2-restricted glypican-3 peptide-specific CTL clones induced by peptide vaccine show high avidity and antigen-specific killing activity against tumor cells. PMID:

36 販売業者フナコシ株式会社 東京都文京区本郷 Tel: Fax: reagent@funakoshi.co.jp 英国 ( 本社 ) ProImmune 社英国 OX4 4GA オックスフォードオックスフォードサイエンスパークマグダレンセンター Tel Fax enquiries@proimmune.com

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