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えつまたみや
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6 76 近畿中国四国農業研究センター研究報告第６号 2007 用いた TSB培地にて28 で24時間液体振とう培養最終的に三種の抗生物質に対する耐性変異株であるした供試菌株幼植物試験で根の伸長を促進または H3R株 D23R株及びSW3R株を得たここで H3 抑制した菌株の培養液100mL １ 108cfu ml 1 D23 SW3株を用いた理由としては抗生物質耐性を水耕液に添加した１容器あたり８株ずつ第１変異株が得られたためである図に示したように 1/2濃度の Hoagland 水耕液を H3R株 D23R株及びSW3R株を用い２の水耕１mLと５cm ５cmのろ紙を縦に四つ折りしたもの栽培試験と同様にホウレンソウを３週間栽培したを入れた試験管内で無菌的に育苗したホウレンソウ栽培後の根に定着している接種菌の菌密度を上記３幼苗を定植したホウレンソウの収穫期までガラス種の抗生物質を含むP1培地を用い希釈平板法により温室内で約３週間栽培した対照として菌無接種の計数した根面根内の菌密度は根を摩砕して得 TSB 培地100mL添加区を設けた本試験は２反復られた根摩砕液を希釈平板法により計数した根内で行った対照区の草丈が25cm前後になったときの菌密度の測定は根を0.5gFW当たり30mLのにホウレンソウの地上部重量及び根重を調査した 1g L 1過酸化水素水中に15秒浸漬する表面殺菌を行ホウレンソウの地上部重と根重の対照との比からった後 0.01Mリン酸緩衝液 ph7.0 で洗浄し以それぞれ相対生育率を算出した後根面根内の菌密度計測の場合と同様の操作を行った測定は３反復で行った５蛍光性 Pseudomonas 菌株の培養ろ液によるホウレンソウ根の生育反応試験方法の概要を第２図に示した TSB 培地を用い供試菌株としてH3 D23およびSW3株を用いた供試菌株をそれぞれ25 で24時間液体振とう培養したその培養液を10,000rpmで１分間遠心後上澄を採取し 0.2μmのメンブランフィルターを用いて除菌ろ過したそのろ液原液またはTSB 培地により10 100,000倍に希釈したろ液１mLを1/10 第１図水耕栽培による生物検定法濃度の園試処方水耕液150mLに添加し１で示した染色バットを用いた幼植物試験を行った対照と４接種菌株のホウレンソウ根面根内における生して菌株を培養していないTSB培地のろ液１mLを同息部位選抜した菌株のホウレンソウ根面根内における 1ml 定着性を調べるためにまず選抜菌株の抗生物質耐 1ml 1ml 䊶䊶䊶䊶䊶性変異株を作出し変異株の接種回収により定着性を評価した抗生物質耐性菌株作出には相野らの方法４に準じ抗生物質ストレプトマイシン䈱㙃䉐ᶧ 200mg L 1 アンピシリン 100mg L 1 ナリジキシン酸 50mg L 1 を添加したP1培地37 を用いて 1ml TSB 9ml 1/10 1ml TSB 9ml 1/100 1ml 作出した TSB培地で液体振とう培養 28 24時間したH3株 D23株及びSW3株のそれぞれの培養菌液を各抗生物質添加培地上に塗抹し 28 で培養して生じたコロニーを分離したそれぞれの抗生物質に対して得られた自然薬剤耐性変異株についてさらに相互の抗生物質間で菌液接種を繰り返し 150ml 150ml ᨴ 䊋䉾䊃 4ᣣ 㐳 ቯ 㙃 ࠈ ᶧ ߩ ᬌ ቯ ᴺ 第２図培養ろ液の生物検定法

12 ) 2) 3) 4) 5) 6)

18 88 近畿中国四国農業研究センター研究報告最大容水量の50 になるようにかん水を行った第６号 2007 第３表土壌水分が一定の場合のH3R菌株のホウレンソウ根への移動同様にプラスチックチューブを使用せずポット上面全体からのかん水区も設けた上方からのかん水区をTop 中ほどからのかん水区をCenter 下方からのかん水区をBottom及びポット上面全体からのかん水区をCont.とした２週間気温28 湿度70 明暗12時間の人工 ND 検出限界 ND 1.82 FW 新鮮重ＡＢＣは根箱における根の位置を示すＡ 0-10cm Ｂ 10-20cm Ｃ 20-37cm 気象器内で栽培した栽培後にポットから根を取り出し根を滅菌水で洗浄した後にP1培地カナマ第４表かん水量が一定の場合のH3R菌株のホウレンソウ根への移動イシン 50mg kg 1含有に静置して 28 で20時間培養した培養後に1-デカナールを添加し３で検討した撮影条件を用い CCDカメラで撮影した測定は３反復で行った䊖䉡䊧䊮䉸䉡 ሶ ND 検出限界 ND 2.39 FW 新鮮重ＡＢＣは根箱における根の位置を示すＡ 0-10cm Ｂ 10-20cm Ｃ 20-37cm శᕈ䉲䊠䊷䊄䊝䊅䉴第５表かん水量が一定の場合のH3R菌株の根箱中の䊖䉡䊧䊮䉸䉡土壌への移動㪌㫄㪣䊒䊤䉴䉼䉾䉪䉼䊠䊷䊑䊘䉾䊃㩿 ᓘ㪈㪇㪺㫄㪀䊒䊤䉴䉼䉾䉪䉼䊠䊷䊑䉕䊘䉾䊃䈮Ꮕ䈚ㄟ䉃㪅㪈㪄䊂䉦䊅䊷䊦㪉ㅳ㑆 ἠ 䈲䊒䊤䉴䉼䉾䉪䉼䊠䊷䊑䉕䈚䈩ⴕ䈉㪧㪈䋨䉦䊅䊙䉟䉲䊮㪌㪇㫇㫇㫄䋩㪚㪚㪛䉦䊜䊤䈪 ᓇ 㪈㪎 ND 検出限界 ND 1.39 DW 乾物重ＡＣは根箱における土壌の位置を示すＡ 0-10cm Ｃ 20-37cm 䈎䉖䈮䉋䉎 శ ᕈ 第17図かん水位置による蛍光性 Pseudomonasの䈱 ቯ 㛎根定着試験量の根箱と同程度の5.95 log cfu g 1 FW-root 検出２結果されたしかしＢＣ部分の根からは検出限界以下１根箱試験であったこれに対してかん水量が10 100mL 根箱試験における接種菌株の根及び土壌への移動 day 1の場合はＡＢＣ部分のいずれの根からの結果を第３表に示した土壌水分が一定となるよも log cfu g 1 FW-rootの接種菌株が検出うに霧吹きを用いてかん水した場合根箱内で上方され根先端の菌密度は株元と同程度であったから下方への水の流れが少ないは根箱の水分含同様に第５表に示したようにかん水量が１量が最大容水量の30 80 と土壌水分の多少に関わ ml day 1の場合以外はＣ部分の土壌から接種菌株らずホウレンソウの株元であるＡ部分の根からはが検出されたさらにかん水量が10mL及び50mL 1 FW-root day 1の場合はＡＣ部分の土壌の接種菌密度は概と同程度であったこれに対してＢ部分の根からね同程度でありかん水量の多い100mL day 1の場は 80 の多水分条件以外では接種菌株は検出され合はＡ部分の菌密度は低めでＣ部分の菌密度が高なかった根の先端であるＣ部分の根からはどのかった多量のかん水により接種菌が根箱下部に移水分条件の根箱からも接種菌株が検出されなかった送されたものと思われる接種菌株の菌密度は log cfu g 第４表に示したように根箱上方からかん水量を一定にした場合根箱内で上方から下方への水の流れがある 1mL day 1 とかん水量が少ない場合は根の株元であるＡ部分の根からは他のかん水２生物発光遺伝子の蛍光性 Pseudomonas への導入生物発光遺伝子のH3株及びHS1株への導入に接合

19 Center Bottom Cont.

23 浦嶋 PGPR 利用法の開発第21図 93 有機物施用が菌密度におよぼす影響細菌放線菌糸状菌かったため比増殖速度が算出できなかった蛍光性Pseudomonas H3R株の結果から微少熱量計は微生物の増殖に対してストレスとなる塩類集積のような要因を解析可能と判３考察断された第20図においてベタインの場合は塩蛍光性 Pseudomonas の根定着にとって根面及類集積土壌におけるH3株の増殖抑制が緩和されてび根圏における増殖速度は根圏定着の菌株間の競いる植物を高塩類条件で栽培した場合に浸透圧合を決める重要な特性である根圏環境で増殖速度が高い菌株が優先して根に定着できる塩類集積土壌において炭素源があるにもかかわらず塩類非耐性菌株であるH3株の増殖が抑制されることが微少熱量計を用いて解析可能であったこ調節のために細胞質にベタインが蓄積されることは知られており蛍光性 Pseudomonas の場合にもベタインが浸透圧調節に関与しているために塩類集積土壌での増殖抑制が緩和されたと推察した土壌中の養分含量塩類濃度と蛍光性 Pseudomonas

28 HS23 HS23

29 BLAST 522 H3 1.15% 522 Pseudomonas fluva 2.68% 522 Pseudomonas staminae 3.45% 522 Pseudomonas fluorescens G bt 3.83% 522 Pseudomonas agarici 4.02% 522 Pseudomonas fuscovaginae 4.41% 522 Pseudomonas putida 4.41% 522 Pseudomonas asplenii 4.60% 522 Pseudomonas fluorescens A bt 4.60% 522 Pseudomonas mucidolens 4.60% 522 Pseudomonas synxantha Pseudomonas fluorescens A (bt) Pseudomonas mucidolens Pseudomonas synxantha H Pseudomonas fulva Pseudomonas straminae Pseudomonas agarici Pseudomonas fluorescens G (bt) Pseudomonas fuscovaginae Pseudomonas putida Pseudomonas asplenii Bacillus subtilis subtillis TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC GAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGAATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAG GAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCC TACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATT AGCTAGTTGGTGrGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGAT GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTT CGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTT GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTA

30 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC GAGCGGATGAmrrGAGCTTGCTCyykrATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGA ATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTA CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTA GCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATG ATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTC GGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGywkTArmyTAATACkyTrswrTTTTGACG TTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTA Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes Pseudomonas oleovorans Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fulva Pseudomonas straminae Pseudomonas agarici Pseudomonas fluorescens G (bt) Pseudomonas fuscovaginae Pseudomonas putida Pseudomonas asplenii Bacillus subtilis subtillis BLAST 522 D % 522 Pseudomonas putida 4.21% 522 Pseudomonas fluorescens G bt 4.21% 522 Pseudomonas asplenii 4.21% 522 Pseudomonas fuscovaginae 4.41% 522 Pseudomonas fluva 4.41% 522 Pseudomonas agarici 5.17% 522 Pseudomonas alcaligenes 5.75% 522 Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes 5.94% 522 Pseudomonas oleovorans 5.94% 522 Pseudomonas straminae TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC GAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCCTGrTTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGG AATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTCTCGAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCCT ACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATT AGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGAT GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTT CGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTT GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTA Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fulva Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas oleovorans Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes Pseudomonas agarici Pseudomonas fluorescens G (bt) Pseudomonas fuscovaginae Pseudomonas putida Pseudomonas asplenii Bacillus subtilis subtillis

31 BLAST 522 HS1 1.34% 522 Pseudomonas fluorescens G bt 1.34% 522 Pseudomonas agarici 1.72% 522 Pseudomonas fuscovaginae 1.92% 522 Pseudomonas putida 1.92% 522 Pseudomonas asplenii 4.02% 522 Pseudomonas oleovorans 4.02% 522 Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes 4.41% 522 Pseudomonas fluva 4.41% 522 Pseudomonas fluorescens 4.60% 522 Pseudomonas alcaligenes TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC GAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAG GAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTCTCGAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCC TACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATT AGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGAT GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTT CGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTT GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTA Pseudomonas oleovorans Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas nitroreducens Pseudomonas flavescens HS23 Pseudomonas agarici Pseudomonas fluorescens G (bt) Pseudomonas fuscovaginae Pseudomonas putida Pseudomonas asplenii Bacillus subtilis subtillis BLAST 522 HS % 522 Pseudomonas oleovorans 2.30% 522 Pseudomonas pseudoalcaligenes pseudoalcaligenes 2.68% 522 Pseudomonas alcaligenes 3.26% 522 Pseudomonas putida 3.26% 522 Pseudomonas asplenii 3.45% 522 Pseudomonas agarici 3.45% 522 Pseudomonas fuscovaginae 3.83% 522 Pseudomonas nitroreducens 3.83% 522 Pseudomonas fluorescens G bt 3.83% 522 Pseudomonas flavescens

豚丹毒 ( アジュバント加 ) 不活化ワクチン ( シード ) 平成 23 年 2 月 8 日 ( 告示第 358 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した豚丹毒菌の培養菌液を不活化しアルミニウムゲルアジュバントを添加したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株名称豚丹

豚丹毒 ( アジュバント加 ) 不活化ワクチン ( シード ) 平成 23 年 2 月 8 日 ( 告示第 358 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した豚丹毒菌の培養菌液を不活化しアルミニウムゲルアジュバントを添加したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株 2.1.1 名称豚丹毒菌多摩 96 株 ( 血清型 2 型 ) 又はこれと同等と認められた株 2.1.2 性状感受性豚に接種すると