[PDF] GST融合タンパク質バッチ精製プロトコール

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1 Glutathione Sepharose 4B, 4FF を用いた GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール 1 予め準備する試薬と装置 Glutathione Sepharose 担体製品名 包装単位 コード番号 Glutathione Sepharose 4B 10 ml Glutathione Sepharose 4B 3 10 ml Glutathione Sepharose 4B 5 10 ml Glutathione Sepharose 4B 100 ml Glutathione Sepharose 4B 300 ml Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 25 ml Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 100 ml Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 500 ml 必要な担体量は 下記の表を参考にして計算してください 表 1. GST 融合タンパク質の発現に必要となる培養液 試薬の量 精製したい GST 融合タンパク質量 (mg) 培養量 (L) 細胞破砕後の液量 (ml) Glutathione Sepharose 担体量 (ml) 回の洗浄に必要な結合バッファー (PBS)(ml) 回の溶出に必要な溶出バッファー (ml) : Glutathione Sepharoseは 50% 懸濁液 ( スラリー ) で用います 50% スラリーの液量は 担体量の2 倍になりま すので ご注意ください (50% スラリー 1 mlには 担体が0.5 ml 含まれます ) 2 : 1 回の洗浄に必要な量です 本プロトコールでは 1サンプルあたり3 回の洗浄を行います 3 : 1 回の溶出に必要な量です 本プロトコールでは 1サンプルあたり4~5 回の溶出を行います 結合バッファー : PBS (140 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2HPO 4, 1.8 mm KH 2PO 4), ph 7.3 溶出バッファー : 50 mm Tris-HCl, 10 mm reduced glutathione, ph 8.0 結合バッファーおよび溶出バッファーに 1~10 mmのdttを入れると GST 融合タンパク質とGlutathione Sepharoseとの結合性が改善されることがあります 溶出バッファーは 1~10 mlに分注し -20 で保存できます 5 回以上の凍結融解は避けてください 1

2 2 担体の準備 Glutathione Sepharose は約 75% の懸濁液 ( スラリー ) 状態で出荷されます 精製を行う前に 下記 のプロトコールに従って 50% スラリーに調製します 1 スラリーの均一化 Glutathione Sepharose の入った容器を振り 担体を再懸濁します 2 担体量の計算 表 1 を参照して 精製に必要な Glutathione Sepharose の量を計算し 広口のピペットやメスシリンダーを使って必要量のスラリーを適切な容器に移します 例 ) Glutathione Sepharose は 75 % 懸濁液 ( スラリー ) 状態で出荷されるため 担体が 2 ml 必要な場合は ボトルの中から 2.66 ml のスラリーを取ります 3 エタノールの除去 で 5 分間 遠心して担体を沈降させます 上清を注意深く除去します 4 洗浄 Glutathione Sepharose 担体 1 ml( ステップ 2 で用いた 75 % スラリー 1.33 ml に相当 ) に対して 10 ml の PBS を加え 転倒混和してスラリーを均一にします 例 ) 担体を 2 ml( スラリー 2.66 ml 相当 ) 用いた場合 20 ml の PBS を加えます で 5 分間 遠心して担体を沈降させ 上清を注意深く除去します NOTE: エタノールが残っていると タンパク質の精製に影響を与える恐れがあるため エタノールが完全に除去できるまで この操作を繰り返します 5 平衡化 Glutathione Sepharose 担体 1 ml( ステップ 2 で用いた 75 % スラリー 1.33 ml に相当 ) に対し 1 ml の PBS を加え 転倒混和してスラリーを均一にします 例 ) 担体を 2 ml 用いた場合 2 ml の PBS を加えます NOTE: この操作により Glutathione Sepharose のスラリー濃度は 50% になります 2

3 3 GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール 1 担体とサンプルの混和 2. 担体の準備 で準備した Glutathione Sepharose の 50 % スラリー 2 ml( 担 体量 1 ml) を 培養液から回収した菌体の抽出液 100 ml に加えます 2 GST 融合タンパク質 と担体の反応 室温で 30 分間 ローテーターなどで穏やかに転倒混和します NOTE: この時点で 洗浄や溶出のステップを簡略化するために 融合タンパク質が吸着した担体を適切 なサイズのカラム (PD-10 Empty Column など ) に充填することもできます 3 担体の添加 で5 分間遠心し 上清を除去します NOTE: 上清は捨てずに取っておきます 4 洗浄担体の 10 倍量 (50% スラリーの 5 倍量 ) の PBS を加え 転倒混和します で 5 分間遠心し 上清 ( 洗浄画分 ) を除去します この操作を 2 回繰り返します ( 計 3 回行います ) NOTE: 素通り画分や洗浄画分は 精製ステップが完了するまで保存しておきます 担体に対するタンパク 質の結合効率を測定するため SDS-PAGE などで分析を行ってください * この時点で プロテアーゼにより GST 部分を切断し 目的タンパク質を溶出させることも出来ます ( 切り出 し精製 ) 切り出し精製を行う場合は 下記のステップを行わず 4. プロテアーゼによる GST 融合タンパク質 の切り出し精製 に進んでください 5 溶出バッファーの添加 担体 1 ml(50% スラリー 2 ml) につき 1 ml の溶出バッファーを加えます 沈降し た担体に結合している融合タンパク質を溶出します 室温で 10 分間 ローテーターなどで穏やかに転倒混和します 6 GST 融合タンパク質の溶出 で 5 分間遠心し 担体を沈降させて 上清 ( 溶出分画 ) を新しい遠心チューブに移します ステップ4~5を2 回繰り返します ( 計 3 回 ) 3 回の溶出で得られた溶出液をそれぞれチェックし 精製タンパク質が含まれている溶出液を保存します 3

4 4 プロテアーゼによる GST 融合タンパク質切り出し精製 PreScission Protease の場合 3. GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール のステップ 4 までは同一です ステップ 5 以降を 下 記の方法で行ってください 必要な試薬 PreScission Protease 500 units PreScission 切断バッファー :50 mm Tris-HCl 150 mm NaCl 1 mm EDTA 1 mm DTT ph 7.5 PreScission Protease によるタグの切断および精製 GST 融合タンパク質 8 mg が担体 1 ml に結合すると仮定しています 5 切断バッファーへの平 衡化 担体の 10 倍量の PreScission 切断バッファーで Glutathione Sepharose 担体を 再懸濁します 6 プロテアーゼ溶液の調 製 Glutathione Sepharose の担体量 1 ml に対し 80 μl(160 ユニット ) の PreScission Protease と 920 μl の PreScission 切断バッファーの混合液を 5 で調製します 7 担体の添加 で5 分間遠心し 上清を除いてから ステップ6. プロテアーゼ溶液の調 整 で用意したPreScission Protease 溶液を Glutathione Sepharoseに加えま す 懸濁液を穏やかに振盪または転倒混和します 8 プロテアーゼ反応 5 で 4 時間反応させます 9 溶出バッファーの添加 で 5 分間遠心し 上清を注意深く別のチューブに移します NOTE: 目的タンパク質は上清に含まれますが 融合タンパク質の GST 部分と PreScission Protease は Glutathione Sepharose 担体に結合した状態で沈降します 4

5 Thrombin の場合 3. GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール のステップ 4 までは同一です ステップ 5 以降を 下 記の方法で行ってください 必要な試薬 Thrombin 500 unit *Thrombin 溶液は あらかじめ4 に冷やしておいた0.5 mlのpbsに500ユニットのthrombinを溶かし 穏やかに撹拌します 活性を保つために 溶液を分注し-80 で保存します Thrombin 切断バッファー :PBS(140 mm NaCl 2.7 mm KCl 10 mm Na 2HPO mm KH 2PO 4 ph 7.3) Thrombin によるタグの切断および精製 GST 融合タンパク質 8 mg が担体 1 ml に結合すると仮定しています 5 切断バッファーへの平 衡化 担体の 10 倍量の PBS で Glutathione Sepharose を再懸濁します 6 プロテアーゼ溶液の調 製 Glutathione Sepharose 担体 1 ml に対し 80 μl(80 ユニット ) の Thrombin と 920 μl の PBS を混合します 7 担体の添加 で5 分間懸濁液を遠心し 上清を除いてから ステップ6. プロテアーゼ 溶液の調整 で用意したThrombinを含む溶液を Glutathione Sepharoseに加 えます 懸濁液を穏やかに振盪または転倒混和します 8 プロテアーゼ反応室温 (22~25 ) で 2~16 時間反応します 9 溶出バッファーの添加 で 5 分間遠心し 上清を注意深く他のチューブに移します NOTE: 溶出液には目的タンパク質と Thrombin が含まれていますが 融合タンパク質の GST 部分は Glutathione Sepharose 担体に結合した状態で沈殿します NOTE:Thrombin による消化反応後に HiTrap Benzamidine FF(high sub) を用い ステップ 9 の上清から Thrombin を除去することができます ( オプション :HiTrap Benzamidine FF(high sub) を用いた Thrombin および Factor Xa の除去 参照 ) 5

6 Factor Xa の場合 3. GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール のステップ 4 までは同一です ステップ 5 以降を 下 記の方法で行ってください 必要な試薬 Factor Xa 400 unit *Factor Xa 溶液 : 超純水をあらかじめ4 に氷冷しておき 400ユニットのFactor Xaを溶かして ( 終濃度 1ユニット /μl) 穏やかに撹拌します 活性を保つために 溶液を分注して-80 で保存します Factor Xa 切断バッファー :50 mm Tris-HCl 150 mm NaCl 1 mm CaCl 2 ph 7.5 Factor Xa によるタグの切断および精製 GST 融合タンパク質 8 mg が担体 1 ml に結合すると仮定しています 5 切断バッファーへの平 衡化 担体の 10 倍量の Factor Xa 切断バッファーで Glutathione Sepharose 担体を再 懸濁します 6 プロテアーゼ溶液の調 製 Glutathione Sepharose のベッド体積 1 ml に対し 80 μl(80 ユニット ) の Factor Xa と 920 μl の Factor Xa 切断バッファーを混合します 7 担体の添加 で5 分間懸濁液を遠心し 上清を移してから 沈降したGlutathione SepharoseにFactor Xa 溶液を加えます 懸濁液を穏やかに振盪または転倒混和します 8 プロテアーゼ反応室温 (22~25 ) で 2~16 時間反応します 9 溶出バッファーの添加 で 5 分間懸濁液を遠心して 上清を注意深く別のチューブに移します NOTE: 溶出液には目的タンパク質と Factor Xa が含まれていますが 融合タンパク質の GST 部分は Glutathione Sepharose 担体に結合したまま沈降します NOTE:Factor Xa による切断後に HiTrap Benzamidine FF(high sub) を用い 溶出したタンパク質から Factor Xa を除去することができます ( オプション :HiTrap Benzamidine FF(high sub) を用いた Thrombin および Factor Xa の除去 参照 ) 6

7 5 切り出し精製後の担体の再生 4. プロテアーゼによる GST 融合タンパク質の切り出し精製 を行った後 担体に結合した GST および PreScission Protease を溶出することで 担体を再利用できます 1 溶出バッファーの添加 担体 1 ml(50 % スラリー 2 ml) につき 1 ml の溶出バッファーを加えます 沈降し た担体に結合している融合タンパク質を溶出します 室温で 10 分間 ローテーターなどで穏やかに転倒混和します 2 GST の溶出 で 5 分間遠心し 担体を沈降させて 上清 ( 溶出分画 ) を新しい遠心チ ューブに移します ステップ1~2を2 回繰り返します ( 計 3 回 ) 3 再平衡化 ( または保存 ) ( ただちに次の精製に利用する場合 ) 結合バッファーで平衡化します 手順 : 2 担体の準備 の手順 4~5を行います ( 担体を保存する場合 ) 超純水に置換後 さらに20% エタノールに置換して冷所保存します 手順 : 2 担体の準備 の手順 4~5 を 超純水を使用して行います その後 同じく手順 4~5 を 20% エタノールを使用して行い 4~30 にて保管してください 注意! 凍らせないようご注意ください 担体は凍結により構造が壊れ 使用できなくなってしまいます 7

8 オプション :HiTrap Benzamidine FF(high sub) を用いた Thrombin および Factor Xa の除去 4. プロテアーゼによる GST 融合タンパク質の切り出し精製 で Thrombin または Factor Xa を用いた 場合 HiTrap Benzamidine FF (high sub) を用いてプロテアーゼを除去することができます 必要な試薬 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 製品名 包装単位 コード番号 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 5 1 ml HiTrap Benzamidine FF (high sub) 2 1 ml HiTrap Benzamidine FF (high sub) 1 5 ml 結合バッファー:0.05 M Tris-HCl 0.5 M NaCl ph 7.4 溶出バッファー: 下記のいずれかを選択します (1) 0.05 M glycine-hcl ph 3.0 (2) 10 mm HCl 0.5 M NaCl ph 2.0 (3) 0.05 M Tris-HCl 0.5 M NaCl ph mm p-aminobenzamidine (4) 8 M Ureaまたは6 M 塩酸グアニジン 下記は HiTrap をシリンジに接続して精製する場合のプロトコールです 超純水で満たしたシリンジに下記のルアーコネクターを取り付けます < ルアーコネクター 1/16 male/luer female > 1 コネクターとシリンジの 準備 HiTrap Benzamidine FF (high sub) に 1 個付属しています シリンジを少し押し ルアーコネクター先端から水滴が出た状態にして気泡 を押し出します 2 HiTrap カラムとシリンジ の接続 HiTrapカラムのトップストッパーを外し HiTrapカラムの入口部分に シリンジのルアーコネクター先端部から超純水を何滴か滴下します 入口が溶液で満たされた状態になったら ルアーコネクターとHiTrapを接続します 8

9 カラム下部のツイストオフエンドを折ります NOTE: ねじり切らないように注意してください 3 HiTrap カラムの準備 これで HiTrap カラムの準備は完了です この後のステップは全て ルアーコネクターに取り付けたシリンジを用いて平 衡化バッファーやサンプルを添加します 4 保存バッファーの除去 5 カラム体積の超純水をカラムに流し込みます 保存バッファー (0.05 M 酢 酸ナトリウム ph 4 を含む 20% エタノール ) を除去します 5 平衡化 5 カラム体積の結合バッファーで カラムを平衡化します 6 サンプルの添加 サンプルをカラムに添加します サンプル添加時の推奨流速は 1 ml カラム の場合 1 ml/min 5 ml カラムの場合 5 ml/min です 素通り画分を回収して保存します NOTE: 素通り画分には目的タンパク質が含まれます 7 洗浄 5~10 カラム体積の結合バッファーでカラムを洗浄します 280 nm の吸収を測定しながら 溶出液にタンパク質がなくなるまで 1 ml カ ラムの場合は 0.5~1 ml ずつ 5 ml カラムの場合は 1~3 ml ずつ分取します NOTE: 洗浄画分にも GST 融合タンパク質が含まれている可能性があるため 保存しておきます 8 カラムの再生 5~10 カラム体積の溶出バッファーをカラムに流します 9 平衡化または保存 結合バッファーでカラムを洗浄して カラムを再使用できる状態にします NOTE: すぐに使用しない場合は 2~3 カラム体積の超純水を流した後 2~3 カラム体積の保存バッファ ー (0.05 M 酢酸ナトリウム ph 4 を含む 20% エタノール ) を流してから保存してください 9

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