ヤクルト研究所研究報告集第 30 号, 6(0) sodium(hionogi),latamoxef sodium(hionogi)] 0 ~ 0 個を釣菌して これをそれぞれの液体培地に マクロライド系 [Clarithromycin(igma),Clindamycin 懸濁 ( マクファーランド

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1 Lactobacillus casei シロタ株および Bifidobacterium breve ヤクルト株の薬剤感受性 朝原崇 結城功勝 高橋明 高橋琢也 野本康二 usceptibility of Lactobacillus casei strain hirota and Bifidobacterium breve strain Yakult to various antibiotics. Takashi Asahara, Norikatsu Yuki, Akira Takahashi, Takuya Takahashi, Koji Nomoto Yakult Central nstitute for Microbiological esearch, 796 Yaho, Kunitachi, Tokyo 6650 Japan Abstract The minimum inhibitory concentrations (MC) of probiotic strains, Lactobacillus casei strain hirota (Lc) and Bifidobacterium breve strain Yakult (BBG0) to clinically used antibiotics were determined by the broth microdilution method proposed by the Clinical and Laboratory tandards nstitute (CL). ince the CL susceptibility evaluation table does not include Lactobacillus or Bifidobacterium, their susceptibility was evaluated using the evaluation tables for other bacteria. Lc and BBG0 were slightly susceptible to many aminoglycoside, cephem, quinolone, peptide antibiotics, fosfomycin, sulfamethoxazole, trimethoprime, but were susceptible to tetracycline and macrolide antibiotics. 緒 言 近年 小児科 小児外科 消化器外科および救命救急 材料および方法. 抗菌薬の調製 医学の領域において プロバイオティクスの代表的な菌株である L. casei シロタ株 (Lc 株 ) および B. breve ヤクルト株 (BBG0 株 ) を用いたプロ ( シン ) バイオティクス療法による感染症予防に関する報告が増加している 5) 臨床機関における シンバイオティクス療法による感染症予防のアプローチは増々 発展していくものと考えられる 一方で 臨床で用いられている抗菌薬に対する Lc 株および BBG0 株の感受性について 医療機関からの問い合わせが増加している そこで Lc 株および BBG0 株の種々の抗菌薬に対する最小発育阻止濃度 (MC) を Clinical and Laboratory tandards nstitute (CL: 米国臨床検査標準化委員会 ) の定める broth microdilution method 6) にて測定し それぞれの感受性を判定した 各種抗菌薬 7 種 { アミノグリコシド系 [Amikacin sulfate salt(igma),gentamycin salfate(igma), Kanamycin monosalfate(igma),treptomycin sulfate salt(igma)] ϐ ラクタム系 [Ampicillin(igma), Carbenicillin disodium salt(igma),oxacillin sodium salt monohydrate(igma),penicillin(igma)] セフェム系 [Cefaclor(igma),Cefazolin sodium salt(igma), Cefbuperazone sodium(toyama Chemical),Cefdinir (igma),cefmetazole sodium(daiichi ankyo), Cefotaxime(igma),Cefotiam dihydrochloride (Takeda Pharmaceutical),Cefoxitin sodium salt (igma),cefpirome sulfate(aventis Pharma), Cefsulodin sodium salt(igma),ceftazidime hydrate (igma),ceftizoxime sodium(fujisawa Healthcare), Ceftriaxone disadium salt hemi(hepatohydrate) (igma),cephalothin sodium salt(igma),flomoxef

2 ヤクルト研究所研究報告集第 30 号, 6(0) sodium(hionogi),latamoxef sodium(hionogi)] 0 ~ 0 個を釣菌して これをそれぞれの液体培地に マクロライド系 [Clarithromycin(igma),Clindamycin 懸濁 ( マクファーランド.0) させて 0 6 CFU/ml (igma),erythromycin(igma),oleandomycin phosphate salt(igma)] カルバペネム系 [mipenem/ になるよう調整した 調整済み菌液を 96 穴プレートに 50 µl ずつ分注した ( 抗菌薬最終濃度 : ~ 56 µg/ ml) Cilastatin(Banyu Pharmaceutical),Panipenem/ betamipron(daiichi ankyo)] キノロン系 [Ciprofloxacin (igma),enoxacin(igma),levofloxacin HCl(LKT Laboratories),Lomefloxacin hydrochroride(anta Cruz Biotechnology),Ofloxacin(igma)] テトラサイクリン系 [Minocyclin hydrochloride(igma),tetracyclin hydrochloride(igma)] ペプチド系 [Colistin methanesulfate (igma),polymyxin B sulfate salt(igma),vancomycin hydrochloride(igma)] および その他 [Chloramphenicol (igma),fosfomycin disodium salt(igma), Lincomycin(igma),Neomycin sulfate(igma), ulfamethoxazole(igma),trimethoprim lactate salt (igma)]} をそれぞれ 5.6 mg/ ml になるよう滅菌蒸留水に溶解し これを 0.5 µm のメンブランフィルター (DMC5cs,Toyo oshi) を用いてろ過滅菌した ろ過滅菌済みの各種抗菌薬水溶液を基礎培地 (LM シス 3. 培養および MC 判定菌液入りの 96 穴プレートの蓋をして良く撹拌した後 37 時間嫌気 (Anaero PackAnaero 薬剤感受性用, Mitsubishi Gas Chemical) 培養した 培養後 Well 中の培養液の発育を観察して 陰性対照に比べて目視にて明確に増殖抑制の認められた各種抗菌薬の最低濃度を最小発育阻止濃度 (MC) とした なお本測定を 3 連にて実施した 感染リスクのある細菌についての薬剤感受性評価基準である CL M00 9) を参考にして感受性 () 中間 () 低感受性 () を判定した なお CL M00 には Bifidobacterium および Lactobacillus の感受性判定表がないことから 単純比較はできないが 本論文では便宜上 taphylococcus Enterococcus Enterobacteriaceae あるいは NonEnterobacteriaceae の判定基準を用いて それぞれの感受性を判定した テイン添加液体培地 7) ) に添加して 5 µg/ml の各抗 菌薬添加液体培地を作製した さらに 5 µg/ml の各 抗菌薬添加液体培地を基礎培地にて 倍段階希釈して 結 果 7 種の抗菌薬に対する Lc 株および BBG0 株の 56 ~ µg/ml の希釈系列を作製した 5 ~ µg/ml の濃度の各抗菌薬添加液体培地を 96 穴プレート ( 丸底 滅菌済 ) のウェルに 50 µl ずつ分注した 陰性対照として抗菌薬非添加液体培地を用いた MC を Table に示した )Lc 株は アミノグリコシド系 キノロン系およびペプチド系の多くの抗菌薬 ならびにβ ラクタム系の Ampicillin および Penicillin セフェム系の Cefaclor Cefmetazole Cefoxitin および Ceftazidime カルバペ. 菌液の調製 Lc 株を 0 CFU/ml になるよう 0 ml の M 液体培地 (Becton Dickinson and Company[3]) に添加して 37 時間嫌気 (00%CO ) 培養した BBG 0 株については 0 CFU/ml になるよう 0 ml の GAM 液体培地 (Nissui Pharmaceutical ) ) に菌を添加して同様に培養した 培養終了後の各培養液の 0. ml を それぞれ M 寒天培地 (Becton Dickinson and Company Lc 株用 ) あるいは GAM 寒天培地 (Nissui Pharmaceutical BBG0 株用 ) に塗抹して 37 時間嫌気 (Anaero PackAnaero, Mitsubishi Gas Chemical) 培養した 培地上に発育したコロニー ネム系の mipenem Fosfomycin および Trimethoprim に低感受性であった CL M00 の感受性判定表に掲載されていない Metronidazole Neomycin および ulfamethoxazole に対する MC が高値であり (3 ~ µg/ml) これらの抗菌薬に対しても低感受性であると考えられた 一方 セフェム系の Cefotaxime Ceftizoxime Ceftriaxone および Cefalothin マクロライド系の多くの抗菌薬およびテトラサイクリン系の Minocyclin および Tetracyclin には感受性であり Chloramphenicol には中間であった )BBG0 株は アミノグリコシド系 ϐ ラクタム系 セフェム系 およびキノロン系の多くの抗菌薬 ならび

3 にマクロライド系の Clarithromycin ペプチド系の Polymyxin B や Fosfomycin および Trimethoprim に低感受性であった また CL M00 の感受性判定表に記載されていない Metronidazole Neomycin および ulfamethoxazole に対する MC が高値であり (3 ~ µg/ml) これらの抗菌薬に対しても低感受性であると考えられた 一方 カルバペネム系の mipenem には中間値を示し マクロライド系の Clindamycin および Erythromycin ならびにテトラサイクリン系の Minocyclin および Tetracyclin ペプチド系の Vancomycin および Chloramphenicol には感受性であった なっている,) 院内感染菌である Vancomycin 耐性腸球菌 (VE) の Vancomycin 耐性遺伝子 (vana と vanb 遺伝子 ) は薬剤耐性プラスミドなどにより接合伝達で菌体間を伝播する Lc 株も Vancomycin に対して低感受性であったが 木脇ら ) は Lc 株が既知の Vancomycin 耐性遺伝子を持たないことを PC 法により明らかにしている 近年 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MA) 多剤耐性アシネトバクタバウマニ (MDAb) VE 等の耐性菌の出現が社会問題となっていることから 臨床で用いられるプロバイオティクスは 耐性遺伝子伝播についての安全性が調べられた菌株でなければならないと考えられた 考 察 周術期の患者では 感染症の予防 治療を目的として 木脇らは 7 種の抗菌薬に対する Lc 株を含む L. casei 3 菌株および B. breve 6 菌株の薬剤感受性を 測定したところ 供した菌株は概ね菌種固有の MC 値 抗菌薬が使用されることが多い したがって抗菌薬投与下の患者に用いられるプロバイオティクスの生菌としての有効性を考慮すると その抗菌薬に対して低感受性であることが必要である 一方 臨床で用いられる抗菌薬に対する Lactobacillus や Bifidobacterium の感受性について 種々の乳酸 を示したと報告している,5) 本研究で用いた臨床で 利用される抗菌薬に対しても 供試菌株を増やして 菌 種固有の自然耐性か獲得耐性かの判断 ) 既知の抗生 物質耐性遺伝子の有無の確認等により 伝達性抗生物質 耐性遺伝子を持つか否かを明らかにしていくことが今後 の課題であると考えられた 菌やビフィズス菌で報告,0) が認められるが 残念な がらこれまで Lc 株については臨床で使用される頻 度の低い抗菌薬についての報告のみであり ) また 要 約 臨床で用いられている抗菌薬に対するプロバイオティ BBG0 株については薬剤感受性の報告は認められない 周術期の感染症予防のため 術前に Kanamycin や Metronidazole が 術後に Cefazorin や Cefotiam 等のセフェム系の抗菌薬 Vancomycin 等が使用されることが多い,3) 今回の MC 測定結果より Lc 株および BBG0 株は 臨床で用いられるアミノグリコシド系 セフェム系 キノロン系 ペプチド系の多くの抗菌薬 ならびに Fosfomycin や Metronidazole に低感受性であることが明らかになった また Lc 株についてはカルバペネム系抗菌薬や Vancomycin にも低感受性であった 以上のことから患者における当該抗菌薬と Lc 株および BBG0 株の併用による予防 治療効果の可能性が強く示唆された クスの代表的な菌株である Lactobacillus casei シロタ株 (Lc 株 ) および Bifidobacterium breve ヤクルト株 (BBG 0 株 ) の最小発育阻止濃度 (MC) について Clinical and Laboratory tandards nstitute(cl) の定める broth microdilution method にて測定した CL の感受性判定表には Bifidobacterium および Lactobacillus の判定表がないことから 他の細菌の判定表を参照して それぞれの感受性を判定した Lc 株および BBG0 株は 臨床で用いられるアミノグリコシド系 セフェム系 キノロン系およびペプチド系の多くの抗菌薬 ならびに Fosfomycin ulfamethoxazole および Trimethoprime に低感受性であり テトラサイクリン系やマクロライド系の抗菌薬には感受性であった 病原菌による抗菌薬耐性獲得についての問題が提起 され 伝達性の抗菌薬耐性遺伝子の有無はプロバイオ ティクにおいても安全性評価の主要な基準の一つと 3

4 ヤクルト研究所研究報告集第 30 号, 6(0) 参考文献 ) Kanamori Y, ugiyama M, Hashizume K, Yuki N, Morotomi M, Tanaka : Experience of longterm synbiotic therapy in seven short bowel patients with refractory enterocolitis. J. Pediatr. urg., 39, 6 9(00). ) Wada M, Nagata, aito M, himizu T, Yamashiro Y, Matsuki T, Asahara T, Nomoto K: Effects of the enteral administration of Bifidobacterium breve on patients undergoing chemotherapy for pediatric malignancies. upport. Care Cancer,, (00). 3) ugawara G, Nagino M, Nishio H, Ebata T, Takagi K, Asahara T, Nomoto K, Nimura Y: Perioperative synbiotic treatment to prevent postoperative infectious complications in biliary cancer surgery: A randomized controlled trial. Ann. urg.,, 7067 (006). ) himizu K, Ogura H, Goto M, Asahara T, Nomoto K, Morotomi M, Matsushima A, Tasaki O, Fujita K, Hosotsubo H, Kuwagata Y, Tanaka H, himazu T, ugimoto H: ynbiotics decrease the incidence of septic complications in patients with severe : a preliminary report. Dig. Dis. ci., 5, 0707 (009). 5) Usami M, Miyoshi M, Kanbara Y, Aoyama M, akaki H, huno K, Hirata K, Takahashi M, Ueno K, Tabata, Asahara T, Nomoto K: Effects of perioperative synbiotic treatment on infectious complications, intestinal integrity, and fecal flora and organic acids in hepatic surgery with or without cirrhosis. JPEN J. Parenter. Enteral. Nutr., 35, 373(0). 6) Methods for Antimicrobial usceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved tandardeven Edition: CL MA7 vol. 7, No.. 7) Klare, Konstabel C, MüllerBertling, eissbrodt, Huys G, Vancanneyt M, wings J, Goossens H, Witte W: Evaluation of new broth media for microdilution antibiotic susceptibility testing of Lactobacilli, Pediococci, Lactococci, and Bifidobacteria. Appl. Environ. Microbiol., 7, 996(005). ) Moubareck C, Gavini F, Vaugien L, Butel MJ, DoucetPopulaire F: Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. J. Antimicrob. Chemother., 55, 3 (005). 9) Peformance tandards for Antimicrobial usceptibility Testing; Eighteenth nfomational upplement: CL M00 vol., No.. 0) Mayrhofer, van Hoek AH, Mair C, Huys G, Aarts HJ, Kneifel W, Domig KJ: Antibiotic susceptibility of members of the Lactobacillus acidophilus group using broth microdilution and molecular identification of their resistance determinants. nt. J. Food Microbiol.,, 7(00). ) Kiwaki M, Kushiro A:Antibiotic usceptibility Testing of Lactobacillus casei by the Broth Microdilution Method and a urvey of Vancomycinesistance Genes in the probiotic L. casei strain hirota. Annual eport of Yakult Central nstitute for Microbiological esearch., 9, 736(00). ) Kusachi, umiyama Y, Nagao J, Arima Y, Yoshida Y, Tanaka H, Nakamura Y, aida Y, Watanabe M, Watanabe, ato J: Prophylactic antibiotics given within hours of surgery, compared with antibiotics given for 7 hours perioperatively, increased the rate of methicillinresistant taphylococcus aureus isolated from surgical site infections. J. nfect. Chemother.,, 50(00). 3) 炭山嘉伸編著, 消化器外科周術期感染症, 南山堂 (99). ) Hummel A, Hertel C, Holzapfel WH, Franz CM: Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 73, (007). 5) Kiwaki M, ato T: Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium breve strains and genetic analysis of streptomycin resistance of probiotic B. breve strain Yakult. nt. J. Food Microbiol., 3, 5(009). ) EFA: Technical guidance. Update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. Prepared by the Panel on Additives and Products or ubstances used in Animal Feed: EFA J., 73, 5 (00). 謝辞本研究の遂行に当たり ご助言を頂きました株式会社ヤクルト本社中央研究所木脇真祐美副主席研究員に謹んで感謝の意を表します

5 Table. Lactobacillus casei シロタ株および Bifidobacterium breve ヤクルト株 (BBG0 株 ) の薬剤感受性 a Amikacin Enterobacteriaceae : 3 6 Gentamycin 56 Enterobacteriaceae : Kanamycin Enterobacteriaceae : 3 6 treptomycin b b β Ampicillin Carbenicillin Oxacillin Penicillin a taphylococcus : Enterobacteriaceae : 3 6 taphylococcus : taphylococcus : 0. Cefaclor taphylococcus : 3 Cefazolin 6 taphylococcus : 3 Cefbuperazone 3 Cefdinir taphylococcus : Cefmetazole taphylococcus : 3 6 Cefotaxime < 6 taphylococcus : 3 6 Cefotiam 6 Cefoxitin 3 taphylococcus : 3 Cefpirome Cefsulodin 6 56 Ceftazidime 3 taphylococcus : 3 Ceftizoxime 6 taphylococcus : 3 6 Ceftriaxone taphylococcus : 3 6 Cephalothin taphylococcus : 3 Flomoxef 56 6 Latamoxef 6 Clarithromycin < 3 taphylococcus : Clindamycin < taphylococcus : Erythromycin < taphylococcus : Oleandomycin mipenem taphylococcus : Panipenem Ciprofloxacin Enoxacin Levofloxacin Lomefloxacin Ofloxacin Minocyclin Tetracyclin Colistin Polymyxin B Vancomycin taphylococcus : taphylococcus : taphylococcus : taphylococcus : taphylococcus : taphylococcus : taphylococcus : NonEnterobacteriaceae : taphylococcus : 3 Chloramphenicol taphylococcus : 3 Fosfomycin 56 Enterococcus : 6 56 Lincomycin < Metronidazole 3 Neomycin 3 6 ulfamethoxazole Trimethoprim 3 taphylococcus : : broth microdilution method (CL MA7 6) ) MC: µg/ml L. casei MC < a CL M00 9) Bifidobacterium Lactobacillus taphylococcus Enterococcus Enterobacteriaceae NonEnterobacteriaceae : : : b CL M00 9) B. breve (BBG0 ) MC 56 CL M00 5

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