器具 ( 注 1) メスシリンダーメスフラスコ KD 目盛付受器コンセントレーター窒素ガス乾燥機 (3) 分析法試料の採取及び保存環境省化学物質環境調査における試料採取にあたっての留意事項に従う但し試料に皮膚が触れないように注意する ( 注 2) 試料の前処理及び試料液の調製 ( 注

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あけなおしどり
6 years ago
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1 和歌山県環境衛生研究センター 4- ヒドロキシ安息香酸メチル Methyl 4-Hydroxybenzoate ( 別名 : メチルパラベン ) 対象物質の構造 HO O O Me CAS 番号 : 分子式 :C 8 H 8 O 3 物理化学的性状分子量沸点蒸気圧水溶解度 log P ow ( 分解 ) 9.33 Pa/25 C 2.5 mg/ml (25 ) 1.96 独立行政法人製品評価技術基盤機構化学物質総合検索システムを参考にした毒性用途毒性 :orl-mus LD 5 :>8 g/kg orl-rbt LD 5 :6 g/kg scu-mus LD 5 :12 mg/kg ipr-mus LD 5 :96 mg/kg 用途 : 保存料防腐剤 Physical&Theoretical Chemistry Lab. の MSDS Datebase を参考にした (1) 分析法の概要 1 分析法水質試料 2 ml に酢酸を加えて酸性として固相カートリッジに通水し 4- ヒドロキシ安息香酸メチル () を濃縮しこれをメタノールで溶出し LC/MS/MS (ESI-, SRM) 法で定量をする (2) 試薬器具試薬 4-ヒドロキシ安息香酸メチル (): ビスフェノール-A-d 16 (BPA-d 16 ):CIL 社製メタノール (LC/MS 用 ): 和光純薬固相カートリッジ :Waters 社製 Oasis HLB Plus LP Extraction Cartridge 酢酸 : 和光純薬 LC/MS グレード手袋 : 表面にが付着していないもの精製水 : 超純水製造システム (MQ Advantage ミリポア製) により製造された水

2 器具 ( 注 1) メスシリンダーメスフラスコ KD 目盛付受器コンセントレーター窒素ガス乾燥機 (3) 分析法試料の採取及び保存環境省化学物質環境調査における試料採取にあたっての留意事項に従う但し試料に皮膚が触れないように注意する ( 注 2) 試料の前処理及び試料液の調製 ( 注 3) 試料水 2 ml に酢酸 12 mg を加えて 1 mm に調製しコンディショニングした固相カートリッジ ( 注 4) をコンセントレーターにセットし試料を 1 ml/min で通水し抽出する通水終了後の固相カートリッジに精製水 5 ml を通して洗浄した後 N 2 ガスを 5 分間通気して乾燥する次いで 5 ml のメタノールで溶出し 2 ml 容なす型フラスコに受けるロータリーエバポレーター (Water Bath 3 ) にて乾固直前まで濃縮 ( 注 5) しメタノール : 精製水 =1:9 で 1 ml に転溶後内標準として BPA-d 14 を添加して試料液とする空試験液の調製試料と同じ量の精製水を用い試料の前処理及び試料液の調製の項に従って操作し得られた試料液を空試験液とする標準液の調製 1. mg を正確に秤取り ( 有効数字 3 桁 ) 1 ml 全量フラスコに入れメタノールを用いて溶解し 1. mg/ml の標準原液とする BPA-d 16 1.mg を正確に秤取り ( 有効数字 3 桁 ) 1 ml 全量フラスコに入れメタノールを用いて溶解し 1. mg/ml の内標準原液とする測定 LC/MS 条件 ( 注 6) LC/MS 機種名 :Agilent 11/API 32 LC 機種 : Agilent 11 カラム : Ascentis TM RP-Amide(Supelco 社製 )(1 cm 2.1 mm 3 µm) カラム温度 : 3 注入量 : 1 µl 移動相 : A: 精製水 B: メタノール 25 min A:9 5 B:1 95 linear gradient min A:B=5: min A:5 9 B:9 1 linear gradient min A:B=9:1 流量 :.2 ml/min

3 (MS) 機種 :API 32 LC/MS/MS システムイオンスプレー電圧 :-45 V ネブライザーガス :N 2 ターボガス温度 :7 イオン化法 : ESI(-)-SRM モニターイオン : BPA-d 検量線検量線用標準溶液は濃度の有効数字が 2 桁以上かつ許容差 ±15% 以下である事を基本とするメタノール : 精製水 =1:9 の溶液とし.1~1 ng/ml の範囲に亘る 4 種類以上の濃度で作成する各濃度の標準溶液には 1 ng/ml の濃度となるように内標準物質 (BPA-d 14 ) を添加する内標準物質のみを添加した溶媒ブランクを含めて 5 種類以上の検量線用標準溶液 1 µl を LC/MS/MS に導入して分析する溶媒ブランク試料からは被検物質のピークが検出されない事を確認する得られる各クロマトグラムにおいて標準物質のピーク面積を内標準物質のピーク面積で割って得られる比を計算し検量線の縦軸とする分析した検量線用標準溶液に含まれる標準物質の濃度を内標準物質の濃度で割って得られる比を計算し検量線の横軸とする重み付けなしで最小二乗法により原点を通過する一次の検量線を作成し関係式及び寄与率 (r 2 ) を計算する寄与率が.995 以上であることを確認する各測定点における濃度比の残さを計算し測定誤差が ±15% 以下であることを確認する検量線用標準溶液調製の手順例 : ( 用意するもの ) 器具 :1 ml 全量ピペット (6 本 ) 5 ml 全量ピペット (1 本 ) 1 ml 全量ピペット (3 本 ) 5 ml 全量ピペット (1 本 ) 1 ml 全量フラスコ (11 本 ) 標準原液 (1. mg/ml 1 ml 以上 ) BPA-d 14 標準原液 (1. mg/ml 1 ml 以上 ) ( 内標準母液の調製 ) 内標準 (BPA-d 14 ) の標準原液 (1. mg/ml メタノール溶液 ) を 1 ml 全量ピペットと 1 ml の全量フラスコを用いてメタノールで希釈し 1. µg/ml の内標準母液を作成する ( 標準溶液の調製例 ) 標準原液 (1. mg/ml) を 1 ml 全量ピペットと 1 ml の全量フラスコを用いてメタノールで希釈し 1. µg/ml の標準母液 -1 とする標準母液 -1 を 1 ml 全量ピペットと 1 ml の全量フラスコを用いてメタノールで希釈し 1. ng/ml の標準母液 -2 とする標準母液 -2 を 1 ml 全量ピペットと 1 ml の全量フラスコを用いてメタノールで希釈し 1. ng/ml の標準母液 -3 とする標準母液 -1 を 1 ml の全量ピペットで 1 ml 全量フラスコに量り取る標準母液 -2 をそれぞれ ml の全量ピペットで 1 ml 全量フラスコに量り取る標準母液 -3 を 1 ml の全量ピペットで 1 ml 全量フラスコに量り取る続いて 1. µg/ml の内標準母液を 1 ml の全量ピペットを用いて標準母液を入れた 1 ml 全量フラスコ ( 計 7 本 ) 及びブランク用 1 ml 全量フラスコにそれぞれ加える ( 総計 8 本 ) メタノール: 精製水 =1:9 を各 1

4 ml 全量フラスコの標線まで加えそれぞれ.1 ng/ml.5 ng/ml 1. ng/ml 5. ng/ml 1. ng/ml 5. ng/ml 及び 1. ng/ml の検量線用標準液とするこの標準液中の内標準 (BPA-d 14 ) 濃度は 1. ng/ml である定量試料液 1 µl を LC/MS/MS に導入して分析する得られた被検物質のピーク面積を内標準物質のピーク面積で割った比から検量線を基にして被検物質濃度を内標準物質濃度で割った比 (R) を求める濃度の算出試料水中濃度 C (ng/l) は次式により算出する C =R Q/V R : 検量線から求めた被検物質濃度を内標物質濃度で割った比 Q : 試料中に添加した内標準の量 (ng)(= 添加する内標準の濃度 (ng/µl) 添加する内標準の容量 (µl)) V : 試料水量 (L) 本分析法に従った場合以下の数値を使用する Q = 1. (ng) (= 添加する内標準の濃度 (1. ng/µl) 添加した内標準の容量 (1. µl)) V =.2 (L) 即ち C = R 5. (ng/l) である装置検出下限(IDL) 本分析に用いた LC/MS(Agilent11 /API32) の IDL を下表に示す ( 注 7) 物質 IDL(ng/mL) 試料量 (ml) 最終液量 (ml) IDL 試料換算値 (ng/l) 測定方法の検出下限(MDL) 定量下限(MQL) ( 注 8) 物質試料量 (ml) 最終液量 (ml) 検出下限値 (ng/l) 定量下限値 (ng/l) (4) 注解 ( 分析上の注意点等 ) ( 注 1) ガラス器具等は理化学用洗剤で洗浄水洗乾燥後メタノールで洗浄すること ( 注 2) 試料に皮膚が触れると皮膚表面に付着していたが溶出しコンタミネーションの原因になる本物質は市販化粧品 ( 主にスキンケア用品など ) に使用されているおそれがあるためコンタミネーションには充分に注意が必要である今回の分析にあたって開封後 5 年経過した化粧品中 ( パラベン含有を表示 ) からパーセントオーダーのメチルパラベンを検出した

5 ( 注 3) 手が触れたガラス器具等はに汚染されている可能性が高いので試料液が触れる部位は充分メタノールで洗浄する必要がある表面にが付着していない手袋を使用すると突発的な操作ブランクの上昇を抑えることができる ( 注 4) 固相カートリッジは 2 ml の LC/MS 用メタノールと 5 ml の精製水でコンディショニングしたものを使用する ( 注 5) 溶出液を KD 濃縮管に取り N 2 パージにて 1 ml へとメスアップを行った後に内標準を加えて測定しても良い ( 注 6)LC/MS の条件は本測定に使用した機種 (Agilent11/API32) 特有のものである

6 ( 注 7) 装置検出下限 (IDL) は化学物質環境実態調査実施の手引き ( 平成 17 年 3 月 ) に従って表 1 のとおり算出した表 1 装置検出下限 (IDL) の算出 (Agilent11/API32) 物質名試料量 (ml) 最終液量 (ml) 注入量濃度 (ng/ml) 装置注入量 (µl) 結果 1(ng/mL) 結果 2(ng/mL) 結果 3(ng/mL) 結果 4(ng/mL) 結果 5(ng/mL) 結果 6(ng/mL) 結果 7(ng/mL) 平均値 (ng/ml) 標準偏差 (ng/ml) IDL(ng/mL) IDL 試料換算値 (ng/l) S/N CV(%) IDL=t(n-1,.5) σn XIC of -MRM (2 pairs): 151./92. amu from Sample 8 (idl.1ppb) of 8228.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (2 pairs): 241.2/223. amu from Sample 8 (idl.1ppb) of 8228.wiff (Turbo Spray) Max cps 図 1 IDL(.1 ng/ml) 測定時のクロマトグラム

7 ( 注 8) 測定方法の検出下限 (MDL) 及び定量下限 (MQL) は化学物質環境実態調査実施の手引き ( 平成 17 年 3 月 ) により次のとおり算出した表 2 測定方法の検出下限 (MDL) 及び定量下限 (MQL) の算出 ( 精製水 ) 物質名試料量 (ml) 2 標準添加量 (ng).15 試料換算濃度 (ng/l).75 最終液量 (ml) 1. 注入量濃度 (ng/ml).15 装置注入量 (µl) 1 操作ブランク平均 (ng/l) 無添加平均 (ng/l) 結果 1(ng/L).798 結果 2(ng/L).849 結果 3(ng/L).761 結果 4(ng/L).93 結果 5(ng/L).917 結果 6(ng/L).933 結果 7(ng/L).828 平均値 (ng/l).8556 標準偏差 (ng/l).64 MDL(ng/L).25 MQL(ng/L).64 S/N 3 CV(%) 7.5 MDL=t(n-1,.5) σn-1 2 MQL=σn 操作ブランク平均 : 試料マトリクスのみがない状態で他は同様の操作を行い測定した値の平均値 2 無添加平均 : MDL 算出用試料に標準を添加していない状態で含まれる濃度の平均値 XIC of -MRM (2 pairs): 151./92. amu from Sample 12 (mdl(.15ng)) of 8229.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (2 pairs): 241.2/223. amu from Sample 12 (mdl(.15ng)) of 8229.wiff (Turbo Spray) Max. 1.3e4 cps. 1.3e4 1.e 図 2 MDL 測定時 ( 精製水 2 ml に.15 ng 添加 ) のクロマトグラム

8 分析法フローチャート 2 解説試料水 Oasis HLB 洗浄乾燥溶出濃縮内標添加 LC/MS 2 ml, 酸性 1 ml/min 精製水 N 2 MeOH エバポレーター ESI(-)-SRM 検量線及びマススペクトル検量線及びマススペクトル等を次に示す検量線検量線 (.1~1 ng/ml) 検量線 (1~1 ng/ml) 面積比 ( 対象物質 / 内標準物質 ) y = x R 2 = 濃度比 ( 対象物質 / 内標準物質 ) 面積比 ( 対象物質 / 内標準物質 ) y = x R 2 = 濃度比 ( 対象物質 / 内標準物質 ) 図 3 検量線 ( 内標準物質 1 ng/ml 対象物質.1~1 ng/ml 及び 1~1 ng/ml) マススペクトル -Q1:.134 to min from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wiff (Turbo Spray), Centroided 151. Max. 1.3e6 cps e6 1.3e6 1.25e6 1.2e6 1.15e6 1.1e6 1.5e6 1.e e5 9.e5 8.5e5 8.e5 7.5e5 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e e e e m/z, amu 図 4 MS スペクトル

9 -MS2 (151.):.268 to min from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wiff (Turbo Spray), Centroided Max. 4.2e5 cps. 4.2e5 4.e e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e m/z, amu 図 5 MS/MS スペクトル -Q1:.67 to min from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wiff (Turbo Spray), Centroided 2.7e6 2.6e Max. 2.7e6 cps. 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e m/z, amu 図 6 内標準物質 (BPA-d 14 ) MS スペクトル

10 -MS2 (241.2): to min from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wiff (Turbo Spray), Centroided 1.7e5 Max. 1.7e5 cps e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e e4 1.e m/z, amu 図 7 内標準物質 (BPA-d 14 ) MS/MS スペクトル代表的なクロマトグラム XIC of -MRM (2 pairs): 151./92. amu from Sample 17 (std1ppb) of 8228.wiff (Turbo Spray) Max. 3.1e4 cps. 3.e e4 1.e XIC of -MRM (2 pairs): 241.2/223. amu from Sample 17 (std1ppb) of 8228.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e4 cps. 1.15e4 1.e 図 8 検量線 (:1 ng/ml / BPA-d 14 :1 ng/ml) のクロマトグラム XIC of -MRM (2 pairs): 151./92. amu from Sample 3 (sblk) of 8229.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (2 pairs): 241.2/223. amu from Sample 3 (sblk) of 8229.wiff (Turbo Spray) Max. 95. cps 図 9 操作ブランクのクロマトグラムわずかに検出

11 構造異性体の分離 XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 4 (Std3-MP,EP1ppb&4-MP,EP4ppb26) of SepaMRM15.wiff (Turbo Spray) Max. 4.4e4 cps. 4.e4 2.e XIC of -MRM (13 pairs): 165./91.9 amu from Sample 4 (Std3-MP,EP1ppb&4-MP,EP4ppb26) of SepaMRM15.wiff (Turbo Spray) Max. 4.5e4 cps. 4.e4 2.e XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 4 (Std3-MP,EP1ppb&4-MP,EP4ppb26) of SepaMRM15.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e4 cps. 1.e4 5. m-mp m-ep p-ep 図 1 構造異性体の分離 (SRM)(m-MP m-ep1 ng/ml/ p-ep 4 ng/ml) メタ体はパラ体に比べ 3~5 倍感度が悪い抽出クリーンアップ等の検討試料の前処理及び試料液の調製の項に従って操作し固相カートリッジによる回収率の比較を行った (n=3 添加量 5 ng) 但し MP: メチルパラベン EP: エチルパラベン n-prop: プロピルパラベン i-prop: イソプロピルパラベン n-bp: ブチルパラベン i-bp: イソブチルパラベン sec-bp:sec- ブチルパラベン n-penp: ペンチルパラベン i-penp: イソペンチルパラベン Hex-P: ヘキシルパラベン HepP: へプチルパラベン OP: オクチルパラベン NP: ノニルパラベン DP: デカニルパラベン PheP: フェニルパラベン BenP: ベンジルパラベンの略とする固相抽出検討 AutoPrep EDS-1 Sep-Pak tc18 Sep-Pak PS-2 Oasis HLB Sep-Pak C18 Bond Elute NEXUS GL Pak PLS-3 Sep-Pak NH2 回収率 (%) MP EP n-prop i-prop n-bp i-bp sec-bp n-penp i-penp 試験項目 HexP HepP OP NP DP PheP BenP 図 11 固相カートリッジによる回収率の違い

12 表 3 固相からの回収率 (%) Auto Prep EDS-1 Sep-Pak C18 Sep-Pak tc18 Bond Elute Nexus Sep-Pak PS-2 GL Pak PLS-3 Waters Oasis Sep-Pak NH2 MP EP n-prop i-prop n-bp i-bp sec-bp n-penp i-penp HexP HepP OP NP DP PheP BenP 低濃度添加回収試験精製水河川水 ( 紀の川 ) 及び海水 ( 紀の川河口 ) への標準物質添加回収実験結果を表 4 に示す表 4 添加回収実験結果試料名試料量添加量測定回数検出濃度回収率変動係数 (ml) (ng) (ng/l) (%) (%) 精製水 2 無添加河川水 2 無添加海水 2 無添加分解性スクリーニング試験結果分解性スクリーニング試験結果を表 5 に示す表 5 分解性スクリーニング試験結果 ph 初期濃度 (ng/ml) 1 時間後の残存率 (%) 5 日後の残存率暗所 (%) 明所 (%)

13 環境試料分析例 XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 18 (SampleKinokawaUpX2-2) of SampleMRM222.wiff (Turbo Spray) Max. 54. cps XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 18 (SampleKinokawaUpX2-2) of SampleMRM222.wiff (Turbo Spray) Max. 35. cps 図 12 河川水 ( 紀の川にて.571 ng/l 検出時 ) のクロマトグラム XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 21 (SampleKinokawaDownX2-1238) of SampleMRM222.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 21 (SampleKinokawaDownX2-1238) of SampleMRM222.wiff (Turbo Spray) Max cps 図 13. 海水 ( 紀の川河口部にて 3.25 ng/l 検出時 ) のクロマトグラム河川水 ( 紀の川 ) 海水 ( 紀の川河口 ) から検出した添加回収試験のクロマトグラム XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 1 (Rec.1ppm1uL/2mlX2-1) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 1 (Rec.1ppm1uL/2mlX2-1) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max. 69. cps 図 14 精製水 2 ml に 1. ng 添加したクロマトグラム

14 XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 1 (SampleKinokawaUp+.1ppm1uLX2-1) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 1 (SampleKinokawaUp+.1ppm1uLX2-1) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max. 41. cps 図 15 河川水 ( 紀の川 )2 ml に 1. ng 添加したクロマトグラム XIC of -MRM (13 pairs): 151./92. amu from Sample 13 (SampleKinokawaDown+.1ppm1uLX2-1237) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max cps XIC of -MRM (13 pairs): 241.2/223. amu from Sample 13 (SampleKinokawaDown+.1ppm1uLX2-1237) of RecMRM222.wiff (Turbo Spray) Max. 4. cps 図 16 海水 ( 紀の川 )2 ml に 1. ng 添加したクロマトグラム評価本法により水試料中の.25 ng/l レベルの検出 (.64 ng/l レベルで定量 ) が可能である参考文献環境省環境安全課 :LC/MS を用いた化学物質分析法開発マニュアル担当者氏名連絡先担当和歌山県環境衛生研究センター住所和歌山市砂山南 TEL: FAX: 担当者高良浩司麓岳文 takara_k1@pref.wakayama.lg.jp fumoto_t1@pref.wakayama.lg.jp

15 Methyl 4-Hydroxybenzoate This method provides procedures for the determination of methyl 4-hydroxybenzoate in water samples by liquid chromatography/tandem quadrupole mass spectrometry (LC/MS/MS). This analysis will need to be careful about contamination. Two hundred milliliters of water sample is adjusted at 1 mm with 12 mg of acetic acid, and applied to Oasis HLB plus cartridge at the flow rate of 1mL/min or less. Methyl 4-hydroxybenzoate is eluted with 5 ml of methanol. The eluate is dried up by evaporator, and exchanged to 1. ml of 1% methanol-water solution. Bisphenol A-d 14 1 ng is added to the sample solution as a internal standard. The analytes are determined in the multiple-reaction-monitoring(mrm) mode as the precursor/product ion pair of m/z 151/92 for methyl 4-hydroxybenzoate and m/z 241/223 for the internal standard bisphenol A-d 14. The method detection limit (MDL) and the method quantification limit (MQL) is.25 and.64 ng/l, respectively. The average of recoveries (N=3) from 1. ng methyl 4-hydroxybenzoate added surface water from the sea and the river are 94% and 11%, and the relative standard deviation are 4.4% and 6.%, respectively. Using this method, the concentrations of methyl 4-hydroxybenzoate in sea and river water sampled in Wakayama city were determined. The concentrations were 3.25 and.57 ng/l, respectively. Water 2 ml Acetic acid Solid Phase Extraction Cartridge Oasis HLB Elution Methanol LC/MS/MS-MRM ESI-Negative

16 物質名分析法フローチャート備考 4- ヒドロキシ安息香酸メチル水試料 2 ml 抽出洗浄酸性固相カートリッジ精製水 Oasis HLB LC/MS/MS-SRM 負イオンカラム Ascentis RP-amide 乾燥溶出濃縮 N 2 ガスメタノール 5 ml エバポレーター長さ 1 mm 内径内標添加 BPA-d 14 LC/MS/MS-SRM ESI, 負イオンモード粒径 2.1 mm 3 µm 検出下限水質.25 ng/l

平成26年度化学物質分析法開発報告書

平成26年度化学物質分析法開発報告書 2,2-2,2 -Iminodiethanol Diethanol amine CAS 111-42-2 C 4 H 11 NO 2 105.1356-105.0790-28 C 1) 1.0881 g/cm 3 1)