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ありおきおおはし
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1 Product code: MIS-MSNL001 NuLigand CoA-BAP System ER kit 1. Description Nuclear receptors are ligand-inducible transcriptional factors and regulate the transcriptional activity of various target genes. At the start of the initiation step of transcription, nuclear receptors interact with coactivators (TIF2, SRC1, ACTR, CBP/p300 etc.) in an agonist-dependent manner. By using the interaction of the nucler receptor with a coactivator, we have development a novel rapid ligand screening in vitro method which is easy to use and has high sensitivity. This method, called by us the CoA-BAP (coactivator-bacterial alkaline phosphatase) system, is applicable to most nuclear receptors and is suitable for high-throughput screening because of the entire experimental operation is carried out on a microplate. The CoA-BAP system- ER kit is designed for the ligand screening of human estrogen receptor (ER ), which contain TIF2-BAP (BAP-conjugated TIF2) as coactivator and ER as nucleic receptor. Principal of a screening method

2 2. Product Components This contains sufficient reagents for 96wll reactions. Product Components Storage Condition l ER 1 tube -80 * l TIF2-BAP 1 tube -80 *1 50 l 1M DTT 1 tube l 10-2 M 17- Estradiol 1 tube l NPP *2 1 tube ml BufferA 1 bottle ml BufferB 1 bottle ml 0.1M Carbonate buffer 1 tube ml 1M Tris-HCl (ph8.0) 1 tube 2 8 3ml 0.5N NaOH 1 tube well microplate 1 plate room temperature plate sealer 1 pice room temperature *1; Avoid repeating freeze-thaw cycles. *2; NPP (p-nitrophenyl phosphate) is substrate for alkaline phosphatase. Assay Procedure The following procedure is designed for 96well reactions. Once reagents have been added to the plate, take care NOT to let plate DRY at any time during assay. 3.1 Immobilization of ER on Microplate Wells Place a microplate on ice Pipette 100 l of ice-cold 1xER solution(see 4) into each well Cover plate with a plate sealer Incubate overnight at 2 5

3 Remove the plate sealer Wash three times with 180 l of ice-cold buffer A-DTT (See 4) Note. Plate shaking is not need. 3.2 TIF2-BAP and Sample Incubation Pipette 100 l of ice-cold 1xTIF2-BAP solution(see 4) into each well Pipette 1 l of sample into each well Incubate 60min at Plate Washing Wash three times with 180 l of ice-cold buffer B Note. Plate shaking is not need. Blot plate onto paper towels or other absorbent material 3-4. Substrate Incubation and Absorbance Measurement Pipette 100 l of substrate solution into each well (See 4) Incubate min at 30 Stop enzymatic reaction by adding 25 l of 0.25N NaOH Measure absorbance on an ELISA plate reader set at 405nm ( or 410nm). 4. Reagent Preparation Buffer A-DTT Prepare just before use Add 50 l of 1M DTT to 100ml of ice-cold buffer A Mix gently 1 ER solution (Prepare just before use) Thaw a ER tube on ice to. Don t use Vortex mixer Add ER solution (about l) to 10ml of ice-cold 0.1M Carbonate buffer Mix gently TIF2-BAP solution (Prepare just before use) Thaw a TIF2-BAP tube on ice. Don t use Vortex mixer

4 Add TIF2-BAP solution buffer A-DTT. Mix gently (about l) to 10ml of ice-cold Substrate solution (Prepare just before use) Add 0.1ml of NPP solution to 10ml of 1M Tris-HCl (ph8.0) Mix gently Standards Prepare 10-3 g/ml, 10-4 g/ml, 10-5 g/ml, 10-6 g/ml, 10-7 g/ml, 10-8 g/ml, and 0 g/ml 17- Estradiol solutions by diluting with DMSO for Standard curve. Note. Prepare a Standard curve (including a zero/blank) in each experiment. Reference Kanayama T., Mamiya S., Nishikawa J., Nishihara T. (2003) Basis of a high-throughput method for nuclear receptor ligands. J.Biochem (Tokyo)., 133(6): Nishikawa J., Saito K., Goto J., Dakeyama F., Matsuo M., Nishihara T. (1999) New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicol. Appl. Pharmacol., 154(1):

5 Procedure Summary Ligand 1 l ER 100 l Immobilize BAP TIF2 wash 100 l well 4 overnight 180 l 3 substrate NPP) 100 l NaOH 25 l Incubate 4 wash 180 l yellow microplate reader at 405nm Example Note; The horizontal(x) axis shows the final concentration of Lignds in assay. Distributor TOYO 2CHOME, KOTO-KU, TOKYO, , JAPAN export@cosmobio.co.jp Phone : FAX :

6 NuLigand シリーズ - エストロゲンレセプター α- 概要核内受容体はリガンドとの結合によりその立体構造が変化し転写共役因子と相互作用することが知られています本キットはこの原理を利用しています本キットはヒトエストロゲンレセプター αに結合する化合物の検索及び親和性を評価する研究に利用できますマイクロプレート上で全ての操作を実施でき発色法により 24 時間以内に結果の判定が行えます測定に必要な全ての試薬がキットに含まれていますキットの内容(1 キット 96 ウェル分 ) 試薬名等容量数量保存温度 1. エストロゲンレセプター濃縮液約 300μl * 1 本 TIF2-BAP 濃縮液約 150μl * 1 本 M DTT 溶液 0.05ml 1 本 β-エストラジオール (10-2 M) 0.01ml 1 本 -20~-80 5.NPP 溶液 0.1ml 1 本 -20~-80 6.DMSO 1.0ml 1 本 -20~ M 炭酸緩衝液 10ml 1 本緩衝液 A 100ml 1 本緩衝液 B 100ml 1 本 M Tris-HCl (ph8.0) 10ml 1 本 N NaOH 3ml 1 本穴マイクロプレート 1 枚室温 13. プレートシール 1 枚室温 * ; ロット毎に液量は変動します 1

7 準備 1. キットに含まれる試薬等の安定性を確保するために保存温度に従って保管してください以下は本書の操作手順に従って適切なタイミングで行って下さい 2.17β- エストラジオール希釈系列 (6 濃度 ) の作成 ;17β- エストラジオール (10-2 M) を DMSO で希釈し 10-4 M 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M 溶液を作成して下さい 3. 緩衝液 A(+DTT); 緩衝液 A 100ml あたり 50μl 1M DTT 溶液を加えてご使用下さい 4.1xTIF2-BAP 液 ;TIF2-BAP 濃縮液 1 本を氷上で融解し全量を氷冷緩衝液 A(+ DTT) 10ml に加え混和します混和後は速やかにご使用ください 5.1x エストロゲンレセプター液 ; エストロゲンレセプター濃縮液 1 本を氷上で融解し全量を氷冷 0.1M 炭酸緩衝液 10ml に加え混和します混和後は速やかにご使用ください 6. 基質液 ;NPP 溶液 100μl を 1M Tris-HCl (ph8.0) 10ml に加えて混和します混和後は速やかにご使用ください 7. 試料の調製 ; 脂溶性の試料は DMSO に溶解して下さい水溶性の試料は蒸留水又は適切な緩衝液 ( 緩衝液 A 等 ) に溶解してご使用ください操作 1.1xエストロゲンレセプター液 100μl/ ウエル分注しますプレートシールを貼り遮光のためアルミホイルでプレート全体を包み 4 で一晩静置して下さい * この操作によりエストロゲンレセプターがウエルに固定化されます * 分注操作は低温室 (2-8 ) 又はマイクロプレートを氷上に置いて実施して下さい 2

8 2. プレートシールを剥がし氷冷緩衝液 A(+DTT) 180μl/well で 3 回洗浄して下さい 3.1xTIF2-BAP 液 100μl/ ウエル添加します 4. 適当な濃度となるように調製した試料 (Ligand) 1μl を添加し 4 で 1 時間静置して下さい * 反応確認用試料としてDMSO 及び 10-4 ~10-9 M 17βエストラジオール溶液について実験毎に測定して下さい ( コントロールウエルの設定参照 ) 5. 氷冷緩衝液 B 180μl/well 3 回洗浄して下さい 6. 基質液 100μl/well 加えます 30 で 1 時間反応させます ( 発色の度合いにより反応時間を調節してください ) 7.0.5N NaOH 25μl/well 加えて反応を停止後 405nm の吸光度を測定して下さい ( 気泡はバラツキの原因となりますので注射針等でつぶしてから測定下さい ) コントロールウエルの設定反応を確認する目的のために試薬ブランク DMSO コントロール ( 陰性コントロール ) 10-4 ~10-9 M 17β- エストラジオール ( 陽性コントロール ) の測定を実施して下さい試料分注するウエル位置 (3 ウエル / 試料 ) 試薬ブランク A1,A2,A3 DMSO のみ B1,B2,B M 17β-エストラジオール C1,C2,C M D1,D2,D M E1,E2,E M F1,F2,F M G1,G2,G M H1,H2,H3 * 基質液自身の吸光度を試薬ブランクとします即ち操作の 1~5 ステップをスキップし 6~7 ステップのみ実施して下さい 3

9 操作上の注意 TIF2-BAP 濃縮液エストロゲンレセプター濃縮液を融解する際はボルテックスを使わないようにして下さい TIF2-BAP 濃縮液エストロゲンレセプター濃縮液を繰り返し凍結融解すると活性が低下します分割使用される際は初回融解時に小分けして保存 (-80 ) 下さい実施例縦軸 ; ( サンプルの吸光度 )-( 試薬ブランクの吸光度 ) 横軸 ; 終濃度 ( 試料濃度 x0.01) ER α キット ( 発色条件 30 1~2 時間 ) Abs Log Dose (M) 17β エストラジオール ( 発色 ;1 時間 ) p ノニフェノール ( 発色 ;2 時間 ) ビスフェノール A ( 発色 ;2 時間 ) 製造元販売元 ( 有 ) マイクロシステムズ京都府相楽郡精華町光台 1-7 けいはんなプラザラボ棟 4F TEL FAX info@misys.co.jp 4

基質溶液 ( 脂質成分を含む製品では本手順はデータの精度に大きく影響します本手順の記載は特に厳守ください ) 添付の基質溶液は希釈不要です融解し室温に戻した後使用直前に十分に懸濁してください (5 分間の超音波処理を推奨いたします ) 解凍後の基質溶液の残りは繰り返しの凍結融解を避けるため

基質溶液 ( 脂質成分を含む製品では本手順はデータの精度に大きく影響します本手順の記載は特に厳守ください ) 添付の基質溶液は希釈不要です融解し室温に戻した後使用直前に十分に懸濁してください (5 分間の超音波処理を推奨いたします ) 解凍後の基質溶液の残りは繰り返しの凍結融解を避けるため QS S Assist KINASE _ADP-Glo TM Kit 測定法の概要本アッセイ系は KINASE による基質へのリン酸転移反応を ATP の消費を指標に Luminescent ADP Detection Assay (ADP-Glo TM ) 法で検出するものです本キットにはリン酸化反応に必要なアッセイバッファー酵素希釈バッファー酵素基質および検出試薬に添加する MgCl