3D-Gene について 高性能 DNAチップ基板 3D-Gene は 東レ株式会社が独自に開発しました 特徴ある形状の基板とマイクロビーズを用いた反応時の攪拌方法およびナノレベルの分子制御による遺伝子の固定技術などの独自技術を開発し 超高感度 高再現性 定量性を実現しています 本紙では 3D-Ge

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1 プロトコル概要 2011 年 11 月

2 3D-Gene について 高性能 DNAチップ基板 3D-Gene は 東レ株式会社が独自に開発しました 特徴ある形状の基板とマイクロビーズを用いた反応時の攪拌方法およびナノレベルの分子制御による遺伝子の固定技術などの独自技術を開発し 超高感度 高再現性 定量性を実現しています 本紙では 3D-Gene のご利用をご検討のお客様にプロトコル概略と必要な機器 試薬一覧をご紹介します 3D-Gene ではmRNA 発現解析用プロトコルとmiRNA 発現解析用プロトコルの 2 通りがあります それぞれ別々に記載しておりますので必要な部分のみご確認ください その他 ご不明な点がありましたらお気軽にお問い合わせください 東レ株式会社 DNA チップグループ 目次 1. 遺伝子発現解析の実験フロー 参考資料 :1 色法と 2 色法について 2. 必要試薬 機器一覧 ( 遺伝子発現解析用 ) 3. mirna 発現解析の実験フロー 4. 必要試薬 機器一覧 (mirna 発現解析用 ) 5. 3D-Gene ご利用の際の制限事項 2

3 1. mrna 発現解析実験の流れ mrna 発現解析の実験は 実験開始からデータの取得までおよそ 3 日かかります 1 日目 2 日目のaRNAの調整 Cy DyeカップリングはAmino Allyl MessageAmp TM II arna Amplification kitのプロトコルに従っています ABI 社のホームページからダウンロードし ご確認ください ( 下図は 2 色法プロトコルのフローです 1 色法プロトコルとの違いは 使用する蛍光色素がCy5 のみである点のみで フローには違いはありません [ 実験の概略図 2 色法 ] 3

4 参考資料 :1 色法と 2 色法について 1 色法と 2 色法の名称は標識に用いる蛍光色素の種類に由来しており 1 色法は単一の蛍光色素を 2 色法は2 種類の蛍光色素を使用することを示します 1 色法は 1 種類のターゲットサンプルを 1 枚のDNAチップにハイブリダイゼーションさせます 2 色法は 2 種類のターゲットサンプルを 1 枚のDNAチップ上で競合的にハイブリダイゼーションさせます 初期のDNAチップでは 2 色法が採用されていました ここでは 2 色法から先にご紹介します 説明を簡単にするため 薬物の培養細胞への影響を無処理群 (A 群 ) と処理群 (B 群 ) 間で比較する 2 群実験を例にします ここでは A 群由来のターゲットサンプルをサンプルa B 群由来のターゲットサンプルをサンプルbとします 2 色法ではターゲットサンプルaとターゲットサンプルbがそれぞれ別々の蛍光色素で標識されます 一般的には Cy3(Cyanine 3) とCy5(Cyanine 5) が用いられています ハイブリダイゼーション反応の前にサンプルaとサンプルbを混ぜ 1 枚のDNAチップでハイブリダイゼーション反応を行います そのため 使用するDNAチップ枚数は標識ターゲット数の半分となります ( 図 ) 2 色法は 1 枚のDNAチップ上で 2 種類のターゲット核酸を競合させてハイブリさせるため 得られたサンプル間の蛍光強度比はサンプル間の分子数の比を反映していると考えることができます 2 色法の長所は 同一のDNAチップ内でサンプル間の比較を行えるため DNAチップの品質による影響を受けにくいという長所があります 1 色法ではターゲットサンプルaとターゲットサンプルbがどちらも一種類の色素で標識され それぞれ別々の DNAチップにハイブリダイズを行います 1 色法の長所は 実験計画が立てやすいことがあげられます 解析するサンプル数が急に増えたとしても 1 色法であれば困ることは少ないはずです 2 色法では比較用基準ターゲットサンプル (Reference) を用意する必要があります 1 色法は解析する検体数がどの程度増加するかわからない場合に選択すると良いのかもしれません ただし 短所もあります 複数のDNAチップ間のデータを取り扱うため DNAチップそのもののばらつきの影響を受けてしまいます 2 色法では 同一のDNAチップ内での比較であるためこのような問題は軽微と考えられます 図 4

5 2. 必要試薬 機器一覧 (mrna 発現解析用 ) 試薬 消耗品 あらかじめ 下記試薬 消耗品をご用意ください ハイブリダイゼーションバッファ フラグメンテーションバッファは製品に添付されています メーカー 品名 型番 Ambion Amino Allyl MessageAmpII arna Amplification kit AM1753 Bio Rad Micro Bio-Spin カラム 30 Tris 日本ミリポア AMICON ULTRA 0.5ML 30K 24PK UFC 日本ミリポア AMICON ULTRA 0.5ML 10K 24PK UFC GEヘルスケアバイオサイエンス Cy5 Mono-reactive Dye Pack PA25001 GEヘルスケアバイオサイエンス Cy3 Mono-reactive Dye Pack PA23001 Agilent RNA 6000 Nano kit シグマ エタノール (500ml) RNaseFreeであること ML シグマ 20XSSC Buffer RNaseFreeであること S6639 invitrogen 10%SDS RNaseFreeであること invitrogen 滅菌水 RNaseFreeであること 必要な機器 器具メーカー 機器名 型番 タイテック 保冷バケット ( 氷で代用できます ) EIB アズワン アルコール温度計 ギルソン ピペットマン (P-1000 P-200 P-20 P-10) ABI サーマルサイクラー Geneamp PCR system2720 LMS ボルテックス uzusio VTX-3000L 和研薬 プチVac PV-1200 日立 小型微量遠心機 (13000gまで遠心可能なもの/g 表記のあるもの ) CT15RE 和研薬 プチはち (PCRチューブ用卓上遠心機) 2816 TOMY 1.5mLチューブ用卓上遠心機 PMC-06 東レ 3D-Gene Hybridization Chamber TRT-XN005 EYELA 振とう機 * MMS-210 EYELA 振とう台 ( 粘着シート付 ) MMS FIT-S EYELA インキュベーター * FMS-100 アズワン シリコンフィルム アズワン サーマルロボ (water bath) TR-2A アズワン Staining Dish Thermo Electron corporation Staining Rack Staining Rack 113 和研薬 スピンドライヤー mini WAKEN MODEL2350 アズワン ファインセラミックピンセット アズワン フラットピンセット ULVAC アスピレーター MDF-015 東レ 3D-Gene Scanner * TRT-XS010 * ハイブリチャンバー インキュベータ ( シェイカーを含む ) スキャナをすでにお持ちのお客様へリストに記載のない場合でも お手持ちの機器がご使用可能か当社にてお調べいたします お気軽にお問い合わせください

6 3. mirna 解析実験の流れ mirna 発現解析の実験は およそ 2 日かかります Hy5 での標識反応は Exiqon 社の mircury LNA microrna Hy5 Power labeling kit を推奨しています 6

7 4. 必要試薬 機器一覧 (mirna 発現解析用 ) 試薬 消耗品 あらかじめ 下記試薬 消耗品をご用意ください メーカー 品名 型番 キアゲン mirneasy Mini Kit Exiqon mircury LNA microrna Hy5 Power labeling kit A ハイブリダイゼーションバッファは製品に添付されています 東レ mirna spike control for enzymatic labeling TRT-XR304 Agilent RNA 6000 Nano kit シグマ エタノール (500ml) RNaseFreeであること ML シグマ 20XSSC Buffer RNaseFreeであること S6639 invitrogen 10%SDS RNaseFreeであること invitrogen 滅菌水 RNaseFreeであること 必要な機器 器具 メーカー 機器名 型番 タイテック 保冷バケット ( 氷で代用できます ) EIB アズワン アルコール温度計 ギルソン ピペットマン (P-1000 P-200 P-20 P-10) ABI サーマルサイクラー Geneamp PCR system2720 LMS ボルテックス uzusio VTX-3000L 和研薬 プチVac PV-1200 日立 小型微量遠心機 (13000gまで遠心可能なもの/g 表記のあるもの ) CT15RE 和研薬 プチはち (PCRチューブ用卓上遠心機) 2816 TOMY 1.5mLチューブ用卓上遠心機 PMC-06 東レ 3D-Gene Hybridization Chamber TRT-XN005 EYELA 振とう機 * MMS-210 EYELA 振とう台 ( 粘着シート付 ) MMS FIT-S EYELA インキュベーター * FMS-100 アズワン シリコンフィルム アズワン サーマルロボ (water bath) TR-2A アズワン Staining Dish Thermo Electron corporationstaining Rack Staining Rack 113 和研薬 スピンドライヤー mini WAKEN MODEL2350 アズワン ファインセラミックピンセット アズワン フラットピンセット ULVAC アスピレーター MDF-015 東レ 3D-Gene Scanner * TRT-XS010 * ハイブリチャンバー インキュベータ ( シェイカーを含む ) スキャナをすでにお持ちのお客様へリストに記載のない場合でも お手持ちの機器がご使用可能か当社にてお調べいたします お気軽にお問い合わせください 7

8 5. 3D-Gene ご利用の際の制限事項 3D-Gene 製品の使用に当たっては 以下の制限事項があります あらかじめご承知おきください 発現遺伝子の同定および遺伝子発現量解析以外の目的に使用することはできません 遺伝子多型解析に使用することはできません 本製品購入者は 本製品の使用により得られたデータを第三者に販売することはできません 本製品の提供は 本製品が販売された国内における使用を前提にするものであり お客様が本製品の全部若しくは一部を単独で 又は他の製品と組み合わせ 若しくは他の製品の一部として 直接又は間接に次の各号に該当する取り扱いをする場合は 当社の文書による事前の同意を得るものとします (a) 本製品が販売された国から輸出するとき (b) 本製品が販売された国から 別の国または地域へ持ち出すとき 日本国内におきましては お客様が当社の同意を得て前項の各号に該当する取り扱いをする本製品のうち 外国為替及び外国貿易管理法 に定める 規制対象貨物等 に該当するものについては お客様は 日本国の輸出関連法規に従い必要な手続きをとるものとします なお 日本国外においても米国輸出管理法など外国の輸出関連法規の適用を受け 所定の手続きが必要となる場合も同様です 著作権お客様は本紙の記載内容に関して 一部又は全部を東レ株式会社に無断で複製 改変 転載することはできません 商標権 3D-Gene および 3D-Gene ロゴは日本およびその他の国おける東レ株式会社の商標または登録商標です お断り本製品の内 本説明書等に記載の内容に関して 改良の為に将来予告なしに変更することがあります お問い合わせ先 3D-Gene についてご質問のある方はホームページからお問い合わせください 問い合わせ先 東レ株式会社 東京都中央区日本橋室町 2 丁目 1 番 1 号 8

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