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- ちとら ひろなが
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1 DPO-based Seeplex Technology: DPO テクノロジーと診断への適用 キムデヨンシージェンジャパン
2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 1983 年 Dr. Kary Mullis によって開発されて 1993 年ノーベル賞を受賞した PCRは感度が いが特異性が低いのが問題点である ( 特異 PCR 産物が増幅される ) 特異性の問題のため遺伝 検査には確認過程が必要であったのが現実である 鋳型 DNA ポリメラーぜ PCR の特異性はプライマーが決めることである M 従来のプライマー 2. DPOプライマー バッファ プライマー
3 DPO TM とは I < 参考文献 > Chun JY, Kim KJ, Hwang IT, Kim YJ, Lee DH, Lee IK, Kim JK. Nucleic Acids Research 2007 Feb.7 Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene. Award from Korean Ministry of Sciences and Technology PCT 特許
4 Target Gene Amplification Multiplex PCR Sequencing Genotyping DPO TM の構造と原理 Molecular Diagnostic 5 SNP Detection Integration Site detection 3 - 従来のプライマー O O Target Non-target -5 Target product Non-target product A 3 B 3 C 3 Non-target site X No extension Non-target site X No annealing Target site O Extension 5 5
5 DPO TM 技術の実施例 (Evaluation data from T 社 ) Single band in a wide range of annealing temperature MTH conventional DPO primer M GAPDH conventional DPO primer M INS conventional DPO primer M M : 100bp size marker 1 : 50 (Annealing temp.) 2 : 55 (Annealing temp.) 3 : 60 (Annealing temp.) 4 : 65 (Annealing temp.)
6 DPO Multiplex の特異性検証 (Seeplex PneumoBacter) Pneumonial Bateria Lane Organism Result 1 Chlamydophila pneumoniae 2 Bordetella pertussisnegative 3 Haemophilus influenzae 4 Streptococcus pneumoniae 5 Leionella pneumophila 6 Mycoplasma pneumoniae Positive Positive Positive Positive Positive Positive 8 Human coronavirus 229E Negative 9 Huam parainfluenza virus 1 Negative 10 Influenza A virus (H3N2) Negative 11 Influenza B virus Negative 12 Rhinovirus A Negative 13 Human coronavirus OC43 Negative Lane Organism Result 15 Human respiratory syncytial virus A Negative 16 Staphlylococcus aureus sub sp. aureus Negative 17 Stapylococcus epidermidis Negative 18 Streptococcus agalactiae Negative 19 Streptococcus mitis Negative 20 Klebsiella pneumoniae Negative 21 Klebsiella oxytoca Negative 22 Serratia marcescens Negative 23 Pseudomonas aerogionosa Negative 24 Human gdna Negative 25 puc 19 vector Negative 14 Human metapneumo virus Negative
7 DPO PCR の感度検証 (Single & Multiplex) 10 copies FIG. 2. Sensitivity of multiplex PCR. PCR amplicons from six STD causing bacteria were cloned into the puc19 vector and used as templates in single and multiplex PCR. One million copies of purified plasmid DNA from each bacterial strain were tenfold serially diluted in sterile water down to 0.1 copies per reaction. The copy numbers of the template plasmids in each lane are as follows: lane 1, 1x10 6 ; lane 2, 1x10 5 ; lane 3, 1x10 4 ; lane 4, 1x10 3 ; lane 5, 1x10 2 ; lane 6, 10; lane 7, 1, lane 8, 0.1. Lane 9, negative control (without template DNA); SM, STD-specific size marker. (A-F): Single PCR using the primer set specific for T. vaginalis (A), M. hominis (B), U. urealyticum (C), C. trachomatis (D), M. genitalium (E), N. gonorrhoeae (F). (G) Multiplex PCR using the same plasmid dilutions as for Fig. A-F. Note that single PCR reactions did not include the internal control plasmid or specific primers.
8 Seeplex ラボ自動化 多数の検査項目 少量の検体数のため マニュアルでは遺伝子検査は難しいだがオートメーション化すると少数の実験者で遺伝子検査が可能になる コストダウンの実現
9 Seeplex システム概要 Integrated MoDx solutions 核酸抽出 Multiplex PCR 検出 [Conventional Electrophoresis System] [ABI 3100 & ABI 3130 Automated Electrophoresis System] 動核酸抽出 [Labchip 90 Automated Electrophoresis System] Seeplex 製品群 [Lab 901 Automated Electrophoresis System]
10 Seeplex VRE ACE Detection ( 院内感染対策システム ) 既存の問題 : 1. 培養中 VRE 以外の細菌が育つ (Leuconostoc spp. Pediococcus spp. Lactobacillus spp. など ) 2. vanbの表現型を持ている Enterococcus spp. が6~8 ug/ml MICで育つしないこともある 3. 既存の方法ではVREの確認まで48 時間が掛かる 4. Enterococcus spp. が培養されないこともある 迅速 正確な判別 遺伝子型の判別が必要です また 効果的な院内感染対策が必要です Seeplex VRE ACE Detection
11 Seeplex PneumoBacter ACE Detection ( 細菌性及び異形肺炎検出システム ) 異型肺炎とは ( マイコプラズマ クラミジア肺炎 レジオネラ肺炎など ) : 異型肺炎は細菌性肺炎と違い その特徴は痰を伴わない頑固な咳と発熱が続く場合に疑われ 般に 齢者よりも若年成 に多く 細菌性肺炎に使 されるペニシリン系やセフェム系の抗 剤が効かないものです その治療としてはマクロライド系やテトラサイクリン系の抗 剤が いられ ニューキノロン系も効果があるといわれています Seeplex PneumoBacter ACE Detection システムは 6 種の病原体を同時に検出するシステムです Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis Streptococcus pneumomiae Haemophilus influenzae
12 Seeplex Pneumobacter ACE Detection
13 Seeplex RV ACE detection ( 呼吸器感染ウイルス同時測定 ) 参考論 1. Practical Implementation of a Multiplex PCR for Acute Respiratory Tract Infections in Children. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 2004, p : 急性呼吸器疾患の 児患者のため様々なMultiplex PCRの構築が必要である 2. Comparison of the Seeplex Reverse Transcription PCR Assay with the R-mix Viral Culture and Immunofluorescence Techniques for Detection of Eight Respiratory VIruses. Annals of Clinical & Laboraroty Science, Vol. 38, No. 1, p , : 8 種の呼吸器ウイルスにおいてSeeplex PCRと免疫検査の 較
14 Seeplex RV 12 ACE Detection RV-A Set Agarose gel M M NC Screentape system M NC IC MPV AdV 229E/NL63 PIV 2 PIV 3 PIV 1
15 Seeplex RV 12 ACE Detection RV-B Set Agarose gel Screentape system M NC M NC IC Flu B OC43/HKU1 HRV RSV A Flu A RSV B
16 Seeplex HPV ACE Detection Application of ScreenTape System HPV Test Application of Agarose Gel System HPV Test
17 Seeplex HPV18 ASE Genotyping Seeplex HPV18 ASE Genotyping は cervical swabs から 18 種の HPV High risk と Low risk 群を genotyping する製品としてキャピラリーシーケンサーシステムに適 できます
18 Seeplex HPV ACE Detection Seegene Seeplex method Sample Hybrid Capture System Sample PCR-RFLP Sample Nucleic acid extraction (30 min) Denature (45 min) Nucleic acid extraction (30 min) PCR (3hrs) Hybridize (60 min) Capture (60 min) PCR (3hrs) Purification (30min) Detection (Genotyping 1hr) (Screening 10 min) Turnaround time: 4hrs Detection & Typing at once Detect (30 min) Read after (15 min) Turnaround time: 4hrs Yes/ No Screening only Digestion (1hr) Detection (1hr) Turnaround time: 5hr 30min Typing
19 Seeplex HPV/STD4 Detection
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