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やすもりぜんじゅう
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イタリア中央南部の様々な栽培地で栽培される三つの主要なオリーブ栽培品種内変異とマイクロサテライトマーカーの分析 2012/5/17 12am111s MATRA, Deden Derajat 要約多様なイタリア中央南部栽培地 ( アブルッツォプーリアカラブリアウンブリア ) で 3 つの主要な品種 ( 'Carolea' と 'Coratina' と 'Frantoio')70

1 イタリア中央南部の様々な栽培地で栽培される三つの主要なオリーブ栽培品種内変異とマイクロサテライトマーカーの分析 2012/5/17 12am111s MATRA, Deden Derajat 要約多様なイタリア中央南部栽培地 ( アブルッツォプーリアカラブリアウンブリア ) で 3 つの主要な品種 ( 'Carolea' と 'Coratina' と 'Frantoio')70 サンプルのオリーブを収集して 10 のマイクロサテライト座の遺伝子型を分析した合計で 44 平均で 4.4 遺伝子座が検出された分子解析では 3 つ栽培品種 'Carolea' と 'Coratina' と 'Frantoio' の遺伝的多様性を明らかにしたそして 'Carolea' が多クローン栽培品種で 'Coratina' と 'Frantoio' がおそらく単一クローン状態であった SSR 分析で品種内多形性の解析を通して品種分化および品種内分化を明らかにした現在オリーブは他の経済的植物材料に比べて遺伝的変異の研究が進んでいない本研究ではオリーブを経済的に主要な栽培品種にするため遺伝的変異を明らかにした

2 緒言オリーブ果樹 (Olea europaea L.) は約 1300 のシノニムがあり 680 品種以上が広大な遺伝子プールを示す ( そのような広大な遺伝的変異性によって多くの現象が引き起こされるオリーブの果樹はヘテロ接合性と遺伝子多型が高いレベルで存在 (Angiolillo ら 1999 と Rallo ら 2000) するさらに人間によって有用な栄養繁殖における新品種が開発されたそのためオリーブ果樹が長寿であることと品種が多様であることでその変異性を保存し遺伝的多様性が保たれたこの種の生物多様性の増加に貢献しているもう一つ要因は遺伝的変異性の広さでありまた最終産物が搾汁油であるため遺伝子変異が見過ごされたことにあるこのため多クローン栽培品種の異種表現型 ( 栽培品種 - 個体群 ) は単一クローン栽培品種を形成するのよりも時間がかかった品種内多型が実際には論文の参考で報告されている (Cipriani ら 2002 と Lopes ら 2004 と Muzzalupo ら 2009a) 体細胞突然変異して栄養繁殖をした同じ品種内を調査したいままでのほうこくではオリーブ品種研究のリファレンスとしてはまだデータが足りなかった (Roselli と Scaramuzzi 1974) 最近いくつかの研究プロジェクトはこの問題を提起しており別のイタリアの地域で様々な " 標準証明書 " を作ろうとしている品種内多型は主要な研究になっているこれは過去に重要と考えられていなかったが活発な研究によって現代的なオリーブが生産されるかもしれない ( 例 : 低活性耐低温性耐塩性 ) 最近ではマイクロサテライトマーカー ( 単純反復配列 ) を用いた新しい方法が導入され非常に多型が分析でき信頼でき役に立つ品種の遺伝子型分類とオリーブ種間の変異性が分析できた (sefc ら 2000 と Rallo ら, 2000 と Carriero ら, 2002 と Cipriani ら, 2002 と Ipek ら, 2009 と Muzzalupo ら, 2009b) 特性分析と個体識別と遺伝子資源収集の管理とオリーブオイルの遺伝的追跡可能度が存在する多クローン品種は問題だがしかし変異の多様性により遺伝的改良によって新しい遺伝子型を作成し形質遺伝になる生成形質および耐性または抵抗性の遺伝物質の材料とできる可能性がある Mirto-Crosia (Cosenza, Calabria, Italy), Spoleto (Perugia, Umbria, Italy) and Città Sant Angelo (Pescara, Abruzzo, Italy) の CRA Centro di Ricerca per l OLivicoltura e l Industria olearia ( オリーブ栽培とオイル生産研究所, CRA-OLI) 国立植物遺伝資源研究所にオリーブの遺伝子資源収集部門である実際には様々な約 600 品種がイタリアで収集され 50 品種以上が地中海諸国から Mirto-Crosia (CS) CRA-OLI に収集された CRA- OLI でイタリアのオリーブの遺伝資源収集の目的は遺伝的多様性の損失を避けることと将来の育種プログラムにとって重要な遺伝的基礎を提供するために主な国の品種を維持しさらに微遺伝子型を保護することである本研究の目的は 10 マイクロサテライト遺伝子座における 70 本のオリーブ果樹に属する栽培品種を原産地および分布地と 4 カ所別のイタリア中央南部栽培地について 'Carolea' と 'Coratina' および 'Frantoi のイタリアの主要な栽培品種を比較する材料および方法 70 本のオリーブ果樹は中央から南側のイタリア ( 表 1 および図 1) の地域から選んだ原産地および分布地と 3 カ所の栽培地で栽培されている 'Carolea' と 'Coratina' および Frantoi の幼葉のサンプルを採取した植物材料が取得された農場は Mirto-Crosia (Cosenza, Calabria), Città Sant Angelo (Pescara, Abruzzo), と Spoleto (Perugia, Umbria). に属する Andria (Bari, Apulia) から個人農場の材料も採取した遺伝子マーカーにおけるオリーブ果樹の材料を分析したリストは表 1 に示されている幼葉から Murry と Tompson(1980) が開発しさらに Muzzalupo と Perri(2002) によって改良された CTAB プロトコルによってゲノム DNA を抽出した 10 マイクロサテライト遺伝子座が選択されさらに前論文からも適当に特性分析と個体識別を分析する (Baldoni ら, 2009; Ipek ら, 2009; Muzzalupo ら, 2009a,b; Rekik ら, 2008)

3 使用する遺伝子座は Carriero ら (2002) の研究によって 4 遺伝子座 (GAPU59 GAPU71A GAPU71B と GAPU103A) Cipriani ら (2002) によって 4 遺伝子座 (UDO09 UDO12 UDO28 および UDO39) および Sefc ら (2002) によって 2 遺伝子座 (DCA9 と DCA18) であるさらに Badoni ら (2009) の結果とデータをするためにマーカー (GAPU71B GAPU103A DCA9 DCA18) の 4 つの遺伝子座である Muzzalupo ら (2006) によって 25μL PCR 反応液を含む 25ng 全 DNA 1.5mM MgCl 2 10mMTris-HCl(pH 8.0) 0.2mM dntp 0.25M forward と Reverse プライマー 0.05 U Taq DNA ポリメラーゼ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) である Thermal cycler GeneAmp PCR system Model 9600 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて GAPU59 GAPU71A GAPU71B GAPU103A UDO09 UDO012 UDO28 UDO39 プライマーを採用した PCR 反応条件 : 最初に 94 C 3 分の予備加熱を行い次いで 94 C 30 秒 60 C 40 秒 72 C 60 秒のサイクルを 40 回行った後最後に 72 C 5 分の伸長反応を行ったさらに DCA9 プライマーを採用した PCR 反応条件 : 最初に 95 C 5 分の予備加熱を行い次いで 95 C 20 秒 50 C 30 秒 72 C 30 秒のサイクルを 35 回行った後最後に 72 C 5 分の伸長反応を行った増幅産物は 2100 Bio-Analyzer instrument (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) を用いて DNA 7500 LabChip kit を行って検出し 2100 BioSizing software (version A.02.12) を用いて増幅断片長を決定した (Muzzalupo et al., 2007b) 遺伝子座数 (Na) 頻度 (fa), ヘテロ接合度の期待値 (He), ヘテロ接合度の実測値 (Ho) および遺伝的類似度 (Genetic Identity/g.i) POPGENE32 ソフトウェア (Yeh ら 1997) を用いて算出した Brookfield (1996) によってヌル対立遺伝子 (r) を算出した定式を以下に示す : Brenner and Morris (1990) によって SSR 座あたり対立遺伝子頻度 (power of discrimination-pd) を算出した定式を以下に示す : g.i.(nei,1993) による類似性マトリックスを開発した NTSysPc v2.1 を用いて UPGMA 法によって分子系統樹を作成した

ヘテロ接合性実測値結果は接合性期待値が高い UDO39 の方は接合性実測値が低いヌル対立遺伝子率が高いかもしれない (r=0.23) 識別能の SSR 座は 0.459 の GAPU71B から 0.748 の DCA18 まで及んでいるさらに識別能の SSR 座の結合は 0.

4 表 1 マイクロサテライトマーカーにおけるオリーブ遺伝子型の分析結果本研究ではすべての 10 のマイクロサテライトマーカーにおける多形性の分析を成功し 44 の遺伝子座あたり平均 4.4 が作成され 3 の遺伝子座の GAPU71A および GAPU71B から 6 の遺伝子座の DCA09 および UDO28 を検出した ( 表 2) この研究結果は Lopes ら (2005) の結果より低く Muzzalipo ら (2009a) 結果より高い UDO39 座以外ヘテロ接合性実測値結果は接合性期待値が高い UDO39 の方は接合性実測値が低いヌル対立遺伝子率が高いかもしれない (r=0.23) 識別能の SSR 座はの GAPU71B からの DCA18 まで及んでいるさらに識別能の SSR 座の結合はであり同じ遺伝子型の中で二つ品種を区別する可能性は 1 対である図 1 イタリア南側における 4 カ所別栽培された栽培所サンプルを収集した地図表 2 SSR 座データを取り込んだ Carolea,Coratina, および Frantoio 遺伝子座あたり遺伝子座数 (Na) ヘテロ接合度の期待値 (He), ヘテロ接合度の実測値 (Ho) ヌル対立遺伝子 (r) を表示した

図 2 UPGMA 法による Nei s Genetic Identity により 70 のオリーブ遺伝子型の系藤樹を分析した UPGMA 法より類似性マトリックスから系統樹を作成し別の栽培地域で栽培したサンプルが 3 個別のクラスターを示した一つ目は 25 サンプルの Carolea 栽培品種および二つ目は 21 サンプルの Coratina 栽培品種および 3 つ目は 24 サンプルの

5 図 2 UPGMA 法による Nei s Genetic Identity により 70 のオリーブ遺伝子型の系藤樹を分析した UPGMA 法より類似性マトリックスから系統樹を作成し別の栽培地域で栽培したサンプルが 3 個別のクラスターを示した一つ目は 25 サンプルの Carolea 栽培品種および二つ目は 21 サンプルの Coratina 栽培品種および 3 つ目は 24 サンプルの Frantoio である 1 つ目のクラスターは非常に多様な品種内を持てる 'Carolea' である同じ栽培品種地 (Città Sant Angelo, Abruzzo) では遺伝的類似度が非常に低い CaroleaXXIV を示すこのサンプルは遺伝的類似度が低いから栽植か収集かのとき付票を間違えたかもしれないもう 1 つ同じクラスターで Carolea I は低く遺伝的類似度はであった Carolea クラスターの中で以上の遺伝的類似度により 3 つ目サブクラスターを示した 11 サンプルを含む A サブクラスターと 7 サンプルを含む B サブクラスターと 5 サンプルを含む C サブスラスターはそれぞれ別れた A サブクラスターの中では 8 サンプルが Calabria に起原し 3 サンプルが Andria(Apulia) に起原したこのサブクラスターでは Carolea V および Carolea VIII を持っている 1 つ対立遺伝子座が違う B サブクラスターの中では 5 サンプルが Spoleto (Umbria) に起原し 2 サンプルが Andria(Apulia) に起原した. このサブクラスターは非常に同種である CaroleaXI とういう対立遺伝子 1 つだけが異なる最後に C サブクラスターの中では 5 サンプルが Città Sant Angelo (Abruzzo) に起原しまた Carolea XX という 1 サンプルが 1 つ対立遺伝子座が違う

6 表 3SSR 座データを取り込んだ 70 のオリーブ POPGEN32 を用いて遺伝子座数 ( 塩基対を示す ) および数度を算出したサンプルの中で低対立遺伝子頻度を持っている遺伝子座を発見した CaroleaXXIV の中で 214bp の GAPU59 座および 197bp の GAPU103A 座を発見しさらに CaroleaVIII の中で 161 の UDO28 座を発見した 212bp の GAPU59 座の中ではの非常に高い対立遺伝子座を発見した ( 表 3) Nei s (1973) によると栽培品種内の中で様々なサンプルの遺伝的類似度が高いそれから様々な品種内で非常に遺伝的類似度が低いのは Carolea と Coratina がおよび Carolea と Frantoio がおよび Coratina と Frantoio がであるそれでもクラスターの 'Coratina' と 'Frantoio' は両方も遺伝的類似度率が高い ( 約 1.000). 全サンプルは区別不能で同遺伝子型を示す結果はマイクロサテライトマーカーによってそれぞれ Coratina および Frantoio が非常に近縁であると示す SSR 分析におけるオリーブ栽培品種の特性分析と個体識別法を開発した全 SSR 遺伝座は品種内分離を信頼できる結果を示す本研究では結合マーカーにおける品種内間変異の特性分析を使用した分析によりオリーブの栽培品種は明らかに 3 つ分かれ Carolea の栽培品種が多クローンを示し Coratina と Frantoio が単一クローンを示すかもしれない Carolea 栽培品種内では別栽培地 (Abruzzo, Apulia, Calabria, Umbria) における種子か栄養繁殖か人間の分布によってオリーブを起原したことが同品種の生態型の原因かもしれないこの原因はさらに Carolea は 3 つのサブクラスターを持ち A サブクラスターが Calabria 栽培地 (~75%) を構成し, B サブクラスターが Umbria 栽培地 (~71%) を構成し, C サブクラスターが Abruzzo 栽培地 (100%) を構成したこれは同じ生態型であるが体細胞突然変異によって 1 か 2 かの対立遺伝子座の相違が起きたと考えられる Carolea 栽培品種内で表現型として区別できないだが分子遺伝子マーカーによって違いが確認されたからオリーブの品種保証を行うとき必ず分子マーカーと表現型特性を両方証明する必要がある

■リアルタイムPCR実践編

■リアルタイムPCR実践編リアルタイム PCR 実践編 - SYBR Green I によるリアルタイム RT-PCR - 1. プライマー設計 (1)Perfect Real Time サポートシステムを利用し設計済みのものを購入するヒトマウスラットの RefSeq 配列の大部分については Perfect Real Time サポートシステムが利用できます目的の遺伝子を検索して購入してください (2) カスタム設計サービスを利用する