上智大学研究機構Festival研究企画・研究成果報告書

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ふじよしはしかわ
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1 識別番号 P6 研究課題金属酵素モデルとしての二価金属錯体の合成と構造及び酵素活性の測定研究代表者猪俣芳栄 ( 理工学部化学科 ) 共同研究者 F.S.Howell( 理工学部化学科 ) 木山雅博 ( 応用化学専攻大学院生 ) 小林愛実( 応用化学専攻大学院生 ) Summary A small amount of indispensable metallic elements exist in vivo, and some part is related to the reaction in vivo as the metal-containing enzyme. The copper ion is included in the ascorbic acid oxidaze and the zinc ion is included in the protease and phosphate hydrolase. In this research, copper(Ⅱ) complexes with 4-amino-3-hydroxy butyric acid and L-citramalic acid (complexes and 2) were synthesized as the ascorbic acid oxidase model, and zinc(Ⅱ) complexes with -hydroxysuccinimide (complexes 3 and 4) were synthesized as a model of the phosphate hydrolase. The results of X-ray analysis show that the complex () has a trinuclear structure, the complex (2) has polynuclear structure, and the complexes (3, 4) have a mononuclear structure. In addition, the functions as the enzyme of these complexes were examined by a spectroscopy method, and the relations between the structures and the functions are considered. Ⅰ 本研究の背景及び目的背景 : 生体内には微量で正常な機能を発揮する微量必須金属元素 (V,Cr,Mn,Fe,Co,i,Zn,Mo) が存在しそれらは生命の基本的機能に直接関与する役割や基本的機能を補助する役割をもつている当研究室ではこの微量元素の働きに関心をもちアミノ酸錯体及び類似化合物錯体の合成と性質および構造について研究を続けてきた酵素は生体内の穏やかな環境と中性に近い状態で特定の化合物 ( 基質 ) とだけ反応 ( 基質特異性 ) し化学変化を素早く進行させる ( 活性発現 ) これら酵素の約 3 分のはその活性発現のために金属を必要とし酵素の活性部位において金属イオンが働いている物質を一般的に金属酵素とよび Fe,Zn,Cu は生体内で様々な形で利用されている金属酵素の反応活性中心付近は金属イオンとそれに結合している化合物 ( 配位子 : アミノ酸や水など ) から成り高い頻度でヒスチジンが存在しておりその活性に大きな役割をもっているその中でもアスコルビン酸酸化酵素 (A ) には図に示す様に3 種類の銅イオン周りの状態が存在するまた亜鉛含有酵素はリン酸エステルやペプチドの加水分解に重要な働きをしている酵素活性を有する化合物は 2つの金属原子を含む二核構造をとっている場合が多いが近年単核構造で酵素活性を有する化合物の合成例が報告されている ( 図 2) 図アスコルビン酸酸化酵素の活性中心の模式図

2 目的 : 本研究ではAと同様の作用をもつ銅錯体および Znに配位したH 2 や H His リン酸エステル加水分解反応を促進する亜鉛錯体を合種が反応機構に関与 H 成しそれら錯体の構造の解析を明らかにするととも Ser に錯体構造と酵素活性の有無酵素反応の速度との関係を明らかにすることを目的として研究を行った H 2 Zn Asp H Ⅱ 実験 H Zn ) 錯体合成 4-アミノ-3-ヒドロキシ酪酸 (H 2 ahb) 銅錯体 (): His His Asp 水溶液中でH 2 ahbとcu(h) 2 2H 2 とを物質量 H 比 :で加熱混合し不溶物をろ別後濃縮して His 銅錯体 () を得た図 2 リン酸エステルの加水分解 2 L-(+)-シトラマル酸 (H 2 cma) 銅錯体 (2): 水溶液中で H 2 cmaとcu(ch 3 C) 2 を用いて錯体 () と同じ方法で錯体濃縮溶液を作りエタノール雰囲気下に静置して銅錯体 (2) を得た 3 -ヒドロキシスクシンイミド (Hnhs) 亜鉛錯体 (3): 水溶液中でHnhsとZn(CH 3 C) 2 2H 2 を用いて錯体 () と同じ方法で合成して亜鉛錯体 (3) を得た 4 -ヒドロキシスクシンイミド (Hnhs)-イミダゾール(im) 亜鉛錯体 (4): 水溶液中で錯体 (3) とイミダゾールを物質量比 :で加熱混合し濃縮して亜鉛 -イミダゾール錯体(4) を得た CH H CH 2 H 2 H 2 ahb H 3 C CH H CH H 2 cma Hnhs 図 3 錯体合成に用いた化合物 2) 諸測定これらの錯体について元素分析 IR を測定し単結晶 X 線構造解析を行った 3) 酵素活性の測定 3-. アスコルビン酸酸化酵素 (A): アスコルビン酸 (H 2 AsA) はpH 5.60 付近において 266 nmに吸収が存在するが酸化されると L-デヒドロアスコルビン酸 (AsA) が生成し 266 nm の吸収が消失する ( 図 4) H 2 AsAと銅錯体との反応についてUVスペクトル H 2 AsA を用いて H 2 AsA 溶液に銅錯体溶液を加え吸光度の時間変化を追い H 2 AsA 酸化の影響を調べた ( 図 4) 3-2. リン酸エステル加水分解酵素 : リン酸エステル ( 基質 ) としてトリス (4-ニトロフェニル ) リン酸エステル (TPP) を用いた TPPは加水分解すると p-ニトロフェノールを生じ 404 nmに吸収が現れる ( 図 5) TPP 溶液に亜鉛錯体溶液を加え吸光度の時間変化を溶液のpH 亜鉛錯体濃度基質濃度などの条件を変化させながら測定した得られた 2 H H 2-2H H 2 P 2 TPP 2 + 4H + + 4e - 2H 2 AsA 図 4 アスコルビン酸酸化反応加水分解 2 分解物 p-nitrophenolate ion (λ max = 402 nm) 図 5 リン酸エステル加水分解反応

3 結果から速度定数を算出し活性評価を行った Ⅲ 結果と考察 ) 組成元素分析の結果より錯体の組成は表の通りであった表元素分析及び熱重量分析結果 ( 計算値 ) 錯体 C / % H / % / % H 2 / % () Cu 3 (DL-Hahb) 3 (H 2 ) (2.0) 5.43 (5.44) 6.5 (6.2) 20.9 () (2) Cu(L-cma)(H 2 ) (22.70) 4.39 (4.59) - (0) 8.9 (20.48) (3) Zn(nhs) 2 (H 2 ) (29.5) 3.6 (3.67) 8.36 (8.50) 0.7 (0.92) (4) Zn(nhs) 2 (imi) (39.3) 3.56 (3.75) 9.39 (9.56) - (0) 2) 単結晶 X 線構造解析 4 種の錯体は図 6~9 に示す構造をとっていた錯体 () はカルボキシル基原子ヒドロキシル基原子アミノ基原子が隣接 Cu 原子に配位して三核錯体を構成していた Hahb は不斉炭素を有するため三核錯体は S-S-R 体と R-R-S 体から成り立っていた錯体 (2) はカルボキシル基原子と水分子の原子が Cu 原子に配位した多核錯体であった錯体 (3) はヒドロキシル基原子とカルボニル基原子及び水分子の原子が Zn 原子に配位をした八面体錯体であった錯体 (4) はヒドロキシル基原子とイミダゾール (im) の原子が Zn 原子に配位した四面体錯体であった S 体 R 体錯体 (2) Cu(cma)(H 2 ) 2 図 8 錯体 (3) Zn(nhs) 2 (H 2 ) 2 の構造図 6 錯体 () S 体 Cu 3 (DL-Hahb) 3 の構造図 7 錯体 (2) Cu(L-cma)(H 2 ) 3 の構造 3) 酵素活性 3-. アスコルビン酸 (H 2 AsA) 酸化 ) ph 変化よる吸収極大波長のシフト基質としてH 2 AsAを酵素として錯体 (2) を用いて溶液の ph を変化させてスペクトル測定を行った ph を 8.00 から酸性側へと変化させていくにともない H 2 AsAに由来する吸収極大波長が 266 nm から 245 nm へとシフトした ( 図 0) 2) 酸化反応促進効果の ph 依存性錯体 () と (2) ついて上記 ) の結果から決定した各 phのh 2 AsAによる吸収極大波長における時吸光度図 9 錯体 (4) Zn(nhs) 2 (imi) 2 の構造 ph3.50_acetate ph4.50_acetate ph5.60_mes ph6.00_mes ph6.50_mes ph7.00_hepes ph7.50_hepes ph8.00_hepes 波長 / nm 図図錯体スペクトル変化測定 (2) のスペクトル変化 ([Cu(L-cma)(H 2 )] 2H 2 ) 3

4 間経過にともなう吸光度変化を測定したその結果から求めた反応初速度を ph に対してプロットした ( 図 ) 両錯体について活性が最大になる ph はおよそ 6.5 付近であることがわかった酵素反応における至適 ph は反応の活性種の種類に依存するのでこれら 2 つの錯体を用いた場合の酸化反応における活性種は互いに似ていると考えられる 3) 酸化反応促進効果の温度依存性 v 0 / 0-3 s 錯体 () 錯体 (2) 図 ph と初速度の関係 ph 錯体 () と (2) を用いて 266 nm における 3600 秒間の吸光度変化を測定温度を 25 から 0 毎に 65 まで変化させて測定を行った錯体 () と (2) では互いに異なる挙動を示したアスコルビン酸酸化酵素 (A) 自身を用いての温度依存性の測定では活性は 30 付近で最大となりその後ほぼ一定の活性を保つことがわかっている従って温度依存性の挙動はこれらモデル錯体を用いた場合と A 自身とでは異なると考えられる 4) 酸化反応促進効果の酸素濃度依存性銅 (Ⅱ) 錯体が酸化反応の間にMichaelis-Menten 挙動を示すと反応式は下式であらわされここで生成した - 2 は 2 とH 2 2 へと不均化される k k 2 H 2 AsA + Cu(Ⅱ) Cu(Ⅱ) H 2 AsA Cu(Ⅰ) + AsA k - k 3 Cu(Ⅰ) + 2 Cu(Ⅱ) この機構に対する速度式は V max / v = + K m / [S] + (k 2 / k 3 ) / [ 2 ] であらわされるここで V max は最大速度 vは基質濃度 [S] における反応速度 K m はMichaelis 定数である本測定では反応溶液中の酸素濃度を変化させ酸素濃度が初速度に影響を及ぼさないことを確認し酸素濃度の寄与がないとして取り扱った 5) 酸化反応促進効果の錯体濃度依存性酵素反応は次の経路で進行する E( 酵素 ) + S( 基質 ) ES( 酵素 - 基質複合体 ) P( 生成物 ) 反応速度 (v) は酵素と基質の濃度に依存するため v = k[s][e] () であらわされるここで基質が酵素に対して大過剰に存在しているとするすると基質濃度は酵素濃度に対してその変化量が無視でき式 () は v = k obs [E] (2) と表現でき反応速度は酵素濃度のみに依存する k obs ( 擬一次速度定数 ) は初速度法により初速度 - 酵素濃度 ( 錯体濃度 ) プロットの勾配から算出できる初速度と錯体濃度の関係はほぼ直線となった ( 図 2) このグラフの勾配より擬一次速度定数 (k obs ) は Cu 3 (DL-Hahb) 3 (H 2 ) 8 について M - s - と Cu(L-cma)(H 2 ) 3 について M - s - と決定された 4 0 / 0-3 s - v 錯体 ().50 錯体 (2) 錯体濃度 / 0-6 M 図 2 初速度と錯体濃度との関係

5 P 6) 酸化反応促進効果の基質濃度依存性酵素酵素基質複合体を形成しているとすれば Michaelis-Menten の式 (3) に従い反応速度基質濃度プロットは直角双曲線になる s- -3 kcat[s][e] 0 v = (3) K + [S] m v m = + (4) kcat [S][E] 0 kcat [E] 0 K m は Michaelis 定数であり結合定数の逆数である従って K m の値が小さいほうが酵素基質複合体を形成して酵素反応の機構で進行しているといえる K m は Lineweaver-Burk 両逆数プロット (( 初速度 ) - ( 基質濃度 ) - ) (4) 式より求められる図 3 4 に初速度基質濃度プロットと Lineweaver-Burk 両逆数を示す図 3 よりこの酸化反応は基質錯体複合体を形成して進行する Michaelis-Menten 挙動を示すということがわかった K v 0 / 錯体 () 錯体 (2) [S] / 0-5 M 図 3 初速度と基質濃度との関係 3-2 リン酸エステル加水分解反応反応は基質の初濃度を大過剰にし擬一次反応として取り扱い擬一次速度定数 k obs (s - ) を次のように定義した [S] - / 0 5 M - ln[(a -A t ) / (A -A 0 )] = -k obs t A は反応終了時図 4 Lineweaver- Burk 両逆数の吸光度 A t は t sec 時の吸光度 A 0 は 0 sec 時の吸光度 k obs は擬一次速度定数 t は測定時間 (sec) である Zn(nhs) 2 (H 2 ) 2 ( 錯体 (3)): 錯体溶液の ph を 6.50~.00 に変化させて測定したところおよそ ph 8 あたりで k obs が極大をもつことがわかった ( 図 5) また図 6 に示すように ph での錯体濃度変化と k obs との間には比例関係が成りたった直線の傾きを見かけ上の二次速度定数 k app とすると v 0 / 0 3 s プロット ph でそれぞれ M - s - 図 k obs ( 錯体 ) の ph 依存性 ph M - s M - s - になり各 ph の濃度によって反応性が違うことがわかった ph 8.00 で Zn(nhs) 2 (H 2 ) 2 溶液に対し TPP の濃度を変化させて初速度を求めたところ図 7 のように Michaelis-Menten 挙動を示した Zn(nhs) 2 (H 2 ) 2 に配位する H 2 の pka を測定し化学種の分布曲線を作成したその結果活性が最大な ph8 付近では [Zn(nhs) 2 - (H)(H 2 )] - が主な化学種として存在しこれを k obs / 0-4 s ph 図 5 錯体 (3) の kobs と ph 依存性活性種と考え反応機構を推定した ( 図 8) 錯体 (3)/ 0-4 mol dm -3 5 P 図 6 K obs と酵素 ( 錯体 (3)) 濃度との関係

6 図 8 錯体 (3) による TPP 加水分解機構 Zn(nhs) 2 (im) 2 ( 錯体 (4)): 基質 (TPP) 濃度変化に対図 7 初速度 v 0 とTPP 濃度との関係する擬一次速度定数 (k obs ) 及び初速度 (v 0 ) を求めたところ k obs に基質濃度依存性はなく錯体 (3) よりも値が小さいため活性が低いことが示唆されたまた v 0 はTPPの濃度増加と共に増加しているが Michaelis-Menten 挙動は示さず錯体 (3) とは異なる機構で反応が進んでいると考えられるこれは錯体 (4) においては Zn 原子に水分子が配位していないことによると考えられる Ⅳ 結論金属酵素の機能と構造との関係に関する知見を得るためにアスコルビン酸酸化酵素モデルとして2 種の銅 (Ⅱ) 錯体 ( 錯体,2) をおよびリン酸エステル加水分解酵素モデルとして 2 種の亜鉛 (Ⅱ) 錯体 ( 錯体 3,4) を合成したそれら4 種の錯体の構造を X 線構造解析により明らかにしたアスコルビン酸酸化酵素モデル錯体の場合温度依存性がアスコルビン酸酸化酵素と異なり反応機構が違うことが考えられるリン酸エステル加水分解酵素モデル錯体の場合錯体 (3) は一般的なエステル加水分解反応機構と同じであったしかし錯体 (4) は活性が低く錯体 (3) とは異なる反応機構が考えられるこれは錯体 (4) では反応に関与すると考えられる水分子が亜鉛イオンに配位していないためと推測される 6

(Microsoft Word - \230a\225\266IChO46-Preparatory_Q36_\211\374\202Q_.doc)

$(Microsoft Word - \230a\225\266IChO46-Preparatory_Q36_\211\374\202Q_.doc)$ 問題 36. 鉄 (Ⅲ) イオンとサリチルサリチル酸の錯形成 (20140304 修正 : ピンク色の部分 ) 1. 序論この簡単な実験では水溶液中での鉄 (Ⅲ) イオンとサリチル酸の錯形成を検討するその錯体の実験式が求められその安定度定数を見積もることができる鉄 (Ⅲ) イオンとサリチル酸 H 2 Sal からなる安定な錯体はいくつか知られているそれらの構造と組成はpHにより異なる酸性溶液では紫色の錯体が生成する