biomapping 組み換えタンパク質の発現 抽出 精製 検出 1 ベクター ( コンストラクト ) 作成 ( サブクローニング ) 大腸菌を形質転換 ( トランスフォーメーション ) 大腸菌の培養 ( 少量 ) ベクターの選択 プライマーのデザイン インサートの PCR プラスミドの制限酵素によ

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1 2014 FLAG SAJ1783

2 biomapping 組み換えタンパク質の発現 抽出 精製 検出 1 ベクター ( コンストラクト ) 作成 ( サブクローニング ) 大腸菌を形質転換 ( トランスフォーメーション ) 大腸菌の培養 ( 少量 ) ベクターの選択 プライマーのデザイン インサートの PCR プラスミドの制限酵素による切断 インサートとライゲーション シークエンス確認 プラスミド精製 ( ミニプレップ ) 発現用の大腸菌を形質転換 ( トランスフォーメーション ) 哺乳動物細胞にプラスミドを導入 ( トランスフェクション ) 大腸菌の培養 ( 大量 ) 細胞の培養 ( ディッシュ ) 細胞の培養 ( プレート ) タンパク質発現 抽出タンパク質発現 抽出タンパク質発現 抽出 発現の確認 ( 電気泳動 or ウェスタンブロット ) 発現の確認 ( ウェスタンブロット ) 発現の確認 ( ウェスタンブロット ) タンパク質精製 ( アフィニティ精製 ) タンパク質精製 ( アフィニティ精製 ) 免疫染色 ( 免疫蛍光染色 免疫組織化学 ) 機能解析構造解析など

3 IP WB ELISA FLAG 48

4 biomapping 組み換えタンパク質の発現 N C DH5 BL21 DE3 FLAG tac T7 tac FLAG laci IPTG FLAG T7 tac T7 Sigma lac laco T7 FLAG T7 RNA BL21 DE3 DE3 laci IPTG FLAG

5 tac プロモーターシステム 分泌 ( ペリプラズム ) 大腸菌用発現ベクター選択チャート タ プ sigma.com/vectors 5 FLAG E8158, pflag-ats N 末端 細胞質内発現 FLAG E8033, pflag-mac E9533, pflag-shift 12C MAT E5530, ptac-mat -Tag-1 分泌 ( ペリプラズム ) FLAG E8283, pflag-cts C 末端 細胞質内発現 FLAG MAT E8408, pflag-ctc E5405, ptac-mat-tag-2 T7 プロモーターシステム ( すべて細胞質内発現 ) FLAG amp r /kan r P9618, pt7-flag -3 N 末端 MAT デュアルタグ P1118, pt7-flag -1 E5780, pt7-mat -Tag-1 E5155, pt7-mat-tag-flag -1 FLAG amp r /kan r P9743, pt7-flag -4 C 末端 MAT デュアルタグ P1243, pt7-flag -2 E5655, pt7-mat-tag-2 E5030, pt7-flag -MAT -Tag-2 N,C 末端 デュアルタグ E5280, pt7-flag -MAT-Tag-1 (N 末端 FLAG, C 末端 MAT) E4905, pt7-mat-tag-flag -2 (N 末端 MAT, C 末端 FLAG) P3871, pt7-flag-sbp -1 (N 末端 FLAG, C 末端 SBP)

6 biomapping 大腸菌用発現ベクター価格表 tac Promoter FLAG MAT OmpA Ek Site amp r kan r CAT.NO. pflag-ats E8158 tac N P P P 10µg E UG 30,000 pflag-mac E8033 tac N P P 10µg E UG 30,000 pflag-cts E8283 tac C P P 10µg E UG 40,400 pflag-ctc E8408 tac C P 10µg E UG 40,400 pflag-shift 12C E9533 tac N P P 10µg E UG 44,700 ptac-mat -Tag-1 E5530 tac N P 10µg E UG 45,300 ptac-mat-tag-2 E5405 tac C P 10µg E UG 47,500 T7 Promoter FLAG MAT OmpA Ek Site amp r kan r CAT.NO. pt7-flag -1 P1118 T7/lacO N P P 10µg P UG 42,500 pt7-flag -2 P1243 T7/lacO C P 10µg P UG 42,500 pt7-mat- Tag-1 E5780 T7/lacO N P 10µg E UG 41,600 pt7-mat-tag-2 E5655 T7/lacO C P 10µg E UG 47,500 pt7-flag -MAT -Tag-1 E5280 T7/lacO N C P P 10µg E UG 45,300 pt7-mat-tag-flag -2 E4905 T7/lacO C N P 10µg E UG 47,500 pt7-flag-sbp -1 P3871 T7/lacO N 注 10µg P UG 45,900 pt7-mat-tag-flag -1 E5155 T7/lacO N N P P 10µg E UG 47,500 pt7-flag -MAT-Tag-2 E5030 T7/lacO C C P 10µg E UG 45,300 pt7-flag -3 P9618 T7/lacO N P P P 10µg P UG 47,200 pt7-flag -4 P9743 T7/lacO C P P 10µg P UG 47,200 N:N 末端タグ C:C 末端タグ ompa:periplasmic localization Ek: エンテロキナーゼ切断部位 amp r = アンピシリン耐性遺伝子 kan r = カナマイシン耐性遺伝子注 : C 末端は SBP( ストレプトアビジン結合ペプチド ) タグ sigma.com/vectors

7 一過性発現 タ sigma.com/vectors 7 分泌 3xFLAG E9908, p3xflag-cmv -8 哺乳動物用発現ベクター選択チャート N 末端 細胞質内発現 3xFLAG E7408, p3xflag-cmv-7 E7533, p3xflag-cmv-7.1 FLAG E7033, pflag-cmv2 E2275, pflag-cmv -6a,b,c デュアルタグ C5989, pcmv-mat-tag-flag -1 バイシストロン性発現 E7029, pbicep-cmv -3 N 末端 FLAG+ タグなし ( 同時発現 ) E5905, pcmv-bicep -4 N 末端 FLAG+N 末端 c-myc( 同時発現 ) C 末端 細胞質内発現 FLAG E6908, pflag-cmv -5.1 E3762, pflag-cmv -5a,b,c デュアルタグ C6114, pcmv-flag-mat -Tag-2 N,C 末端 分泌 デュアルタグ E8658, pflag-myc-cmv -19 (N 末端 FLAG, C 末端 c-myc ) E9158, p3xflag-myc-cmv -23 (N 末端 3xFLAG, C 末端 c-myc) 細胞質内発現 デュアルタグ E9283, p3xflag-myc-cmv -24 (N 末端 3xFLAG, C 末端 c-myc) E8783, pflag-myc-cmv -20 (N 末端 FLAG, C 末端 c-myc) C5864, pcmv-flag-mat-tag-1 (N 末端 FLAG,C 末端 MAT)

8 biomapping 哺乳動物用発現ベクター選択チャート タ sigma.com/vectors 安定発現 3xFLAG E9783, p3xflag-cmv -9 分泌 FLAG E6783, pflag-cmv -3 N 末端 3xFLAG E7658, p3xflag-cmv-10 細胞質内発現 FLAG E7158, pflag-cmv -4 バイシストロン性発現 E0904, pbicep -CMV -2 N (MCS1) (N 末端 3xFLAG) E0779, pbicep -CMV -1 N (MCS1) (N 末端 FLAG) 分泌 3xFLAG E7783, p3xflag-cmv-13 C 末端 細胞質内発現 3xFLAG E7908, p3xflag-cmv-14 分泌 デュアルタグ E9408, p3xflag-myc-cmv -25 (N 末端 3xFLAG,C 末端 c-myc) N,C 末端 細胞質内発現 デュアルタグ E7283, p3xflag-myc-cmv-26 (N 末端 3xFLAG,C 末端 c-myc) E9033, pflag-myc-cmv -22 (N 末端 FLAG,C 末端 c-myc)

9 哺乳類用発現ベクター一覧表 sigma.com/vectors 9 PPT FLAG 3x FLAG c-myc MAT Ek Site amp r CAT.NO. pflag-cmv2 E7033 N P P 20µg E UG 80,300 pflag-cmv -5.1 E6908 C P 20µg E UG 74,600 pflag-cmv-5a,b,c E3762 C P 1set E3762-1SET 104,100 pflag-cmv-6a,b,c E2275 N P P 1set E2275-1SET 115,500 p3xflag-cmv -7 E7408 N P P 20µg E UG 86,300 p3xflag-cmv-7.1 E7533 N P P 20µg E UG 82,100 p3xflag-cmv-8 E9908 P N P P 20µg E UG 82,200 pflag-myc-cmv -19 E8658 P N C P P 20µg E UG 100,300 pflag-myc-cmv-20 E8783 N C P P 20µg E UG 96,100 p3xflag-myc-cmv -23 E9158 P N C P P 20µg E UG 78,500 p3xflag-myc-cmv -24 E9283 N C P P 20µg E UG 78,400 pcmv-flag -MAT- Tag -1 C5864 N C P P 20µg C UG 100,500 pcmv-mat-tag- FLAG -1 C5989 N N P P 20µg C UG 109,900 pcmv-flag-mat - Tag-2 C6114 C C P 20µg C UG 107,100 pbicep-cmv -3 E7029 N(MCS1) P P 20µg E UG 113,600 pcmv-bicep -4 E5905 N(MCS1) N(MCS2) P P 20µg E UG 109,900 N = N 末端タグ C= C 末端タグ PPT = 直接分泌に関するプレプロトリプシンリーダー ( 細胞外分泌シグナル ) c-myc = c-myc エピトープ MAT = 金属アフィニティタグ amp r =アンピシリン耐性遺伝子 Ek =エンテロキナーゼ切断部位 PPT FLAG 3x FLAG c-myc Ek Site amp r neo r CAT.NO. pflag-cmv3 E6783 P N P P P 20µg E UG 72,500 pflag-cmv4 E7158 N P P P 20µg E UG 77,800 p3xflag-cmv-9 E9783 P N P P P 20µg E UG 78,400 p3xflag-cmv-10 E7658 N P P P 20µg E UG 82,200 p3xflag-cmv-13 E7783 P C P P 20µg E UG 82,100 p3xflag-cmv-14 E7908 C P P 20µg E UG 80,000 pflag-myc-cmv-22 E9033 N C P P P 20µg E UG 100,500 p3xflag-myc-cmv -25 E9408 P N C P P P 20µg E UG 91,300 p3xflag-myc-cmv -26 E7283 N C P P P 20µg E UG 78,400 pbicep-cmv-1 N (MCS1) E0779 N(MCS1) P P P 20µg E UG 103,700 pbicep-cmv-2 N (MCS1) E0904 N(MCS1) P P P 20µg E UG 108,200 N = N 末端タグ C = C 末端タグ neo r = 安定発現に関するネオマイシン耐性 (G418 でセレクション可能 ) PPT = 直接分泌に関するプレプロトリプシンリーダー c-myc = c-myc エピトープ amp r =アンピシリン耐性遺伝子 Ek =エンテロキナーゼ切断部位

10 biomapping 発現ベクターキット紹介 哺乳動物用 N 末端 FLAG 安定発現キット Mammalian Amino-terminal FLAG Stable Expression Kit 哺乳動物用 N 末端 FLAG 安定発現キットには 哺乳動物細胞中でリコンビナント N 末端 FLAG 融合タンパク質を発現させるために必要な専用の FLAG コンポーネントが用意されています pflag-cmv3 (CAT.NO.E8770) pflag-cmv4 (CAT. NO.E1775) 発現ベクターにより 融合タンパク質を分泌性 あるいは細胞質で一過性または安定発現させることができます 安定発現はネオマイシン選択 (G 418) です また キットには発現 検出やアフィニティー精製用のコントロールが付属します キット同梱発現ベクター Hind III Not I EcoR I Bgl II EcoR V Kpn I Xba I BamH I キット構成 ANTI-FLAG M2 monoclonal antibody ANTI-FLAG M5 monoclonal antibody C-CMV-24 sequencing primer N-CMV-30 sequencing primer FLAG Peptide Met-FLAG-BAP control protein pflag-cmv-3-bap control plasmid pflag-cmv-4-bap control plasmid pflag-cmv-4 expression vector (no leader) pflag-cmv-3 expression vector (preprotrysin leader) 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) 哺乳動物用 N 末端 FLAG 安定発現キット FLMAS-1KT 145,400

11 CAT.NO その他発現関連製品 LB 培地 (1x 溶液 )L2542 L ML 3,500 LB 培地 ( 錠剤 )1 錠 50mL 用 L TAB 12,200 LB ブロス EZMix 粉末 L7658-6X500ML 4,900 LB アガー培地 ( 錠剤 )1 錠 50mL 用 L7025 L TAB 12,900 アガー ( 寒天 )A1296 A G 7,300 LB アガー EZMix 粉末 L7533-6X500ML 6,500 アンピシリン ( アンピシリンナトリウム塩 ) A G 34,300 カナマイシン ( カナマイシン硫酸塩 ) K1377-1G 4,500 G 418(G418 二硫酸塩 ) A1720-1G 17,400 D- グルコース G7021 G G 5,600 IPTG(Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside) I5502 I5502-1G 9,600 X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β -D-galactopyranoside) B MG 19,400 プラスミド精製ミニプレップキット (10 回分 )PLN10 PLN10-1KT 3,700 プラスミド精製ミニプレップキット (70 回分 )PLN70 PLN70-1KT 7,800 プラスミド精製ミニプレップキット (350 回分 )PLN350 PLN350-1KT 37,800

12 biomapping タンパク質抽出 P.15 超音波破砕 ( 大腸菌 ) Sonication buffer Tris-HCl, ph 7.5 NaCl 50 mm mm 5 10 mm 手順 1 3,000g Sonication buffer 4 C 3 10 PMSF ,000g 20 プロテアーゼインヒビターカクテルのラインアップは P.17 をご覧ください

13 凍結融解 ( 培養細胞 ) Rudolph Anal Biochem 269, Lysis buffer Tris-HCl, ph mm KCl 600 mm Glycerol 20% 13 手順 1 PBS 2 PBS 3 10,000g 30 4 Lysis buffer 10cm 50 L 5 4 C CAT.NO.E DNA CAT.NO. トリス塩酸塩 (Trizma 塩酸塩 ) T G 3,700 トリス塩基 (Trizma 塩基 ) T G 8,300 Trizma Pre-set crystals BioPerformance Certified, ph 7.8 T G 19,100 グリセロール G ML 5,600 Benzonase ヌクレアーゼ E1014-5KU 12,800

14 biomapping 界面活性剤抽出 ( 酵母 ) の場合 Saccharomyces cerevisiae 4 CelLytic Y Cell Lysis Reagent Yeast Protease Inhibitor Cocktail, DMSO solution CAT.NO. C4482 P8215 手順 1 3,000g mL ,000g mM DTT 大腸菌 ( バクテリア ) 哺乳動物細胞用抽出試薬は次のページをご覧ください

15 タンパク質抽出関連試薬セルリティックシリーズ : タンパク質を効率的にかつ失活させずに抽出できる界面活性剤 CelLytic は各発現系に合わせて細胞を溶解し タンパク質を抽出するために調製された試薬です プロトコールに従って操作するだけで簡単に細胞を溶解できます CelLytic は数々のプロテアーゼインヒビター キレート剤 カオトロピック塩などと共に用いることが可能です CelLytic を除去せずにアフィニティー精製やウェスタンブロット ゲルシフトアッセイ リポーター検出などを行えます 従来の凍結融解法や超音波破砕よりも簡単 高収率で抽出できる試薬です 15 大腸菌( バクテリア ) サンプル用 サンプルタイプ 大腸菌 ( バクテリア ) 用 製品名 CelLytic B CelLytic B 2X CelLytic B 10X CAT.NO./ 価格 ( ) B ML B ML 9,200 47,500 B ML B ML 17,500 60,200 C ML C ML C ML 14,600 48,200 83,400 製品特徴 独自の両性イオン界面活性剤を配合した 40mM Trizma HCl 溶液 CelLytic B の 2 倍濃縮タイプ 全体の液量を減らしたい場合やタンパク濃度を高くしたい場合に適しています CelLytic B の 10 倍濃縮タイプ バッファー成分不含のため 抽出試薬のカスタマイズが可能です 用法 バクテリア培養液を遠心して得た細胞ペレットに CelLytic B を添加して溶解します 小スケール :1.5 ml 培養からのペレットあたり 0.4 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり 10 ~ 20mL バクテリア培養液を遠心して得た細胞ペレットに CelLytic B を添加して溶解します 小スケール :1.5 ml 培養からのペレットあたり 0.2 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり 5mL ご希望のバッファーで 倍希釈でご使用下さい バクテリア培養液を遠心して得た細胞ペレットに CelLytic B を添加して溶解します 小スケール :1.5 ml 培養からのペレットあたり希釈した CelLytic 0.4 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり希釈した CelLytic 10 ~ 20mL 菌株 / 細胞株 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等 界面活性剤のタイプ両性イオン両性イオン両性イオン サンプルタイプ 大腸菌 ( バクテリア ) 用 製品名 CelLytic B Express CelLytic B Express Tablet CelLytic B plus kit CAT.NO./ 価格 ( ) C ML C X25ML C1990-6X500ML 4,800 25, ,100 C EA C EA 13,600 41,500 CB0050-1KT CB0500-1KT 33, ,100 製品特徴 培養液を遠心せずにワンステップでタンパク質を抽出できます CelLytic Express は 界面活性剤や酵素などを独自配合した粉末です CelLytic Express により得られた細胞ライセートもそのままアフィニティー精製することが可能です CelLytic B Express の錠剤タイプです 25 個入り 100 個サイズがあります 本キットにはグラム陰性菌および溶解が難しいグラム陽性菌の溶解に必要な試薬が揃っています (CelLytic B Lysozyme Benzonase Protease inhibitor Cocktail) FLAG ポリヒスチジン GST などのタグ融合タンパク質精製に適用可能 CB0050 は少量サイズ (5g のサンプル ) CB0500 は 50g サンプルサイズです 適用サンプル培養液中のバクテリア ( 大腸菌 ) ( 遠心不要 ) 用法 菌株 小スケール :25mL 培地に対し 1 パック (25mL サイズ ) 大スケール :500mL 培地に対し 1 パック (500mL サイズ ) BL21 DH5α JM109 等 培養液中のバクテリア ( 大腸菌 ) ( 遠心不要 ) 培地 1mL に対し 1 錠使用 BL21 DH5α JM109 等 グラム陰性 陽性菌 ペレット湿重量 1g あたり 10mL(CB0050 は 50mL CB0500 は 500mL の CelLytic B が付属 ) BL21 DH5α JM109 等

16 biomapping 哺乳動物細胞用 サンプルタイプ 哺乳動物細胞用 製品名 CelLytic M RIPA Buffer Mammalian Cell Lysis Kit CAT.NO./ 価格 ( ) C ML C ML 12,500 42,900 R ML R ML 10,900 65,800 MCL1-1KT 64,400 製品特徴 培養哺乳類細胞から効果的に全細胞タンパク質を抽出するためにデザインされた マイルドな界面活性剤を含む Ready-touse 試薬です 浮遊細胞 付着細胞のどちらからでも効果的で迅速な細胞溶解とタンパク質可溶化が可能です 一般的な細胞溶解用の Ready-to-use 溶液 50mM Tris-HCl (ph8.0) 150mM NaCl 1% IGEPAL CA % デオキシコール酸ナトリウム 0.1% SDS 含有 免疫沈降やウェスタンブロット用のタンパク質溶解に適しています 哺乳類細胞と組織溶解用に必要な全ての試薬が揃っています (5 バッファー (Tris- EDTA) 5 NaCl 5 SDS 5 デオキシコール酸 5 IGEPAL CA-630 Protease Inhibitor Cocktail) 1 キットでリシスバッファー 250mL 分 (100mm プレート 250 枚の抽出可能 ) 適用サンプル付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 細胞株例 HeLa Jurkat HL-60 COS PC-12 A431 CHO Bovine Aorta Endothelial Cells(BAEC) など 哺乳類細胞株 HeLa CHO Jurkat PC-12 COS Bovine Aorta Endothelial Cells(BAEC) など 用法浮遊細胞 :125 µl/10 6 ~ 10 7 個付着細胞 :500 ~ 1,000µL/100mm プレートあるいは 200 ~ 400µL/35mm プレート RIPA バッファー 1mL で 100mm プレートの細胞 (0.5 ~ 個 ) 溶解 リシスバッファーは付着細胞または浮遊細胞 10 6 ~ 10 7 個につき 1mL 使用 組織 5 ~ 20mg につき 1mL 使用 界面活性剤のタイプ マイルドな界面活性剤 ( 非公開 )/ 透析可能 非イオン性および陰イオン性 非イオン性および陰イオン性 その他 サンプルタイプ 酵母用 製品名 CelLytic Y CelLytic Y PLUS KIT CAT.NO./ 価格 ( ) C ML C ML 9,700 58,200 CYP1-1KT 117,100 製品特徴 効果的な酵母細胞溶解およびタンパク質酵母細胞の溶解 タンパク質抽出に必要可溶化のためのリン酸フリーな溶液です な試薬が揃っています ( 反応バッファー タンパク質を変性させず抽出します DTT Lyticase 抽出バッファー Triton X-100 Protease Inhibitor Cocktail) 適用サンプル酵母細胞酵母細胞 用法 酵母細胞 1g あたり2.5 ~ 5mL 1キットで酵母細胞 10 ~ 40gからスフェロ プラスト形成とタンパク質抽出可能 細胞株 様々な Saccharomyces cerevisiae[y187,y190,w303(a) S288C SP1 Σ1278b BJ2168 cdc25] Schizosaccharomyces pombe Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Schizosaccharomyces pombe 界面活性剤のタイプマイルドな界面活性剤 ( 非公開 ) ( 非公開 ) その他の溶解試薬は以下をご参照下さい

17 プロテアーゼ & ホスファターゼインヒビターカクテル プロテアーゼインヒビターカクテル サンプルタイプ一般用 CAT.NO./ 価格 ( ) P2714-1BTL 8,700 I3911-1BO 13,000 S8820-2TAB 8,700 P8465-5ML 11,700 S TAB 80,100 P ML 43,800 阻害特異性 セリンプロテアーゼ システインプロテアーゼ アスパラギン酸プロテアーゼ メタロプロテアーゼ アミノペプチダーゼ 形状凍結乾燥粉末 ( 水溶性 ) (100mL 分 ) 調製方法 容器に 10mL のバッファーを入れて粉末を溶かし 別の容器に移して 100mL に希釈 (=1x 濃度 ) 凍結乾燥粉末 ( 水溶性 ) (100mL 分 ) 容器に 10mL のバッファーを入れて粉末を溶かし 別の容器に移して 100mL に希釈 (=1x 濃度 ) 10mL に溶解後 (10x 濃度 10mL に溶解後 (10x 濃度の状態 ) 分注して -20 で 1ヶの状態 ) 分注して -20 で 1ヶ月保存可能月保存可能 使用量目安細胞溶解液 100mL あたり 1 本 (1BTL) 組成 ( 調製後の濃度 ) 細胞溶解液 100mL あたり 1 本 (1BO) 錠剤 ( 水溶性 ) 個包装 1 錠で 100 ml の 1x カクテル (10 ml に溶解して 10x 濃度でも調製可能 ) 各種細胞溶解液 100mL あたり 1 錠 (1TAB) 凍結乾燥粉末 +DMSO( 別バイアル ) 5ML サイズ 1mL の DMSO で溶解後 4mL の水で希釈 25ML サイズ 5mL の DMSO で溶解後 20mL の水で希釈 細胞溶解液 20mL あたり本溶液 1mL AEBSF (2mM) (2mM) (23mM) アプロチニン (0.3µM) (0.3µM) ベスタチン (130µM) (130µM) (2mM) EDTA (1mM) (1mM) (100mM) E-64 (14µM) (14µM) (0.3mM) ロイペプチン (1µM) (1µM) ペプスタチン A (0.3mM) 特長 動物由来原料不使用 タブレット型 保存温度 ( 未開封時 ) サンプルタイプ 哺乳動物用 培地添加用 ( 分泌タンパク質 ) CAT.NO./ 価格 ( ) P8340-1ML 9,800 I3786-1ML 17,900 P1860-1ML 21,100 P8340-5ML 33,900 I3786-5ML 60,800 阻害特異性 セリンプロテアーゼ システインプロテアーゼ アスパラギン酸プロテアーゼ メタロプロテアーゼアミノペプチダーゼ 形状 DMSO 溶液 DMSO 溶液 DMSO 溶液 調製方法 そのまま使用可能 そのまま使用可能 そのまま使用可能 使用量目安 細胞または組織溶解液 mL あたり 1mL 細胞または組織溶解液 mL あたり 1mL 培地に対して 200 倍以上の希釈率になるように添加 A431, COS 細胞 = 1/200 CHO, HeLa, HepG2, Jurkat, HL-60 細胞 = 1/800 組成 ( 調製後の濃度 ) AEBSF (104mM) アプロチニン (80µM) ベスタチン (4mM) EDTA E-64 (1.4mM) ロイペプチン (2mM) ペプスタチン A (1.5mM) 特長 動物由来原料不使用 保存温度 ( 未開封時 )

18 biomapping サンプルタイプ His タグ融合タンパク質用 酵母 真菌用 植物用 CAT.NO./ 価格 ( ) P8849-1ML 11,100 S8830-2TAB 8,700 P8215-1ML 11,700 P9599-1ML 11,100 P8849-5ML 38,300 S TAB 77,100 P8215-5ML 42,300 P9599-5ML 38,300 阻害特異性 セリンプロテアーゼ システインプロテアーゼ アスパラギン酸プロテアーゼ メタロプロテアーゼ アミノペプチダーゼ サーモリシン様プロテアーゼ 形状 DMSO 溶液 錠剤 ( 水溶性 ) 個包装 DMSO 溶液 DMSO 溶液 調製方法 そのまま使用可能 1 錠で 100 ml の 1x カクテルそのまま使用可能 そのまま使用可能 (10 ml に溶解して 10x 濃度でも調製可能 ) 使用量目安 各種細胞溶解液 100mL あたり 1mL 各種細胞溶解液 100mL あたり 1 錠 (1TAB) 酵母細胞の溶解液 100mL あたり 1mL 植物組織の溶解液 100mL あたり 1mL 組成 ( 調製後の濃度 ) AEBSF (2mM) (100mM) アプロチニン (0.2µM) ベスタチン (130µM) EDTA E-64 (14µM) (1.4mM) ロイペプチン (1µM) ペプスタチン A (10µM) (2.2mM) ホスホラミドン (1µM) フェナントロリン (500mM) 特長 EDTA 不含 EDTA 不含 タブレット型 保存温度 ( 未開封時 ) ホスファターゼインヒビターカクテル ホスファターゼインヒビターカクテルホスファターゼインヒビターカクテル 2 ホスファターゼインヒビターカクテル 3 CAT.NO./ 価格 ( ) P5726-1ML 14,900 P0044-1ML 14,400 阻害特異性 P5726-5ML 50,700 P0044-5ML 48,200 チロシンホスファターゼ 酸性ホスファターゼ アルカリホスファターゼ 形状水溶液 DMSO 溶液 調製方法そのまま使用可能そのまま使用可能 セリン / スレオニンホスファターゼ アルカリホスファターゼ (L- アイソザイム ) 使用量目安各種の細胞 組織溶解液 100mL あたり 1mL 各種の細胞 組織溶解液 100mL あたり 1mL 組成 オルトバナジン酸ナトリウム モリブデン酸ナトリウム 酒石酸ナトリウム イミダゾール カンタリジン (-)- ブロモレバミゾール カリクリン A 特長 2 種類添加で幅広くホスファターゼを阻害可能 ウシ肝臓 ヒト胎盤 ウサギ筋肉など様々な動物組織および A431 や Jurkat 細胞で試験済み保存温度 ( 未開封時 )

19 タンパク質の精製 FLAG c-myc FLAG FLAG P.48 ヒスチジン -タグ融合タンパク質の精製 - HIS-Select CAT.NO. H CAT.NO. P6611 8M CAT.NO. U1250 Refolding) Equilibration Buffer Sodium phosphate ph mm 50 mm Sodium chloride 0.3 M Urea 8 M Wash Buffer Sodium phosphate ph mm 50 mm Imidazole 5 mm 5 mm Sodium chloride 0.3 M Urea 8 M Elution Buffer Sodium phosphate ph mm 50 mm Imidazole 250 mm 250 mm Sodium chloride 0.3 M Urea 8 M

20 biomapping 1 HIS-Select L 3 1,000rpm 823g 1 HIS-Select L 823g L 823g L L 823g 1 1 ph ph ph mM M 5mM CAT.NO. リン酸ナトリウム一塩基性 ( リン酸二水素ナトリウム ) S G 2,700 塩化ナトリウム for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, 98% S G 5,500 HIS-Select 溶出バッファー H ML 28,700 イミダゾール I5513-5G 7,700 尿素, 8 M (after reconstitution with 16 ml high purity water) U4883-6X25ML 9,000

21 免疫沈降法 IP SDS-PAGE A G, L A, G, L A, G, 21 L 1 Species Immunoglobulin Protein A Protein G Protein L Human IgG (normal) IgG IgG IgG IgG IgM IgA IgE IgD Fab K light chains L light chains ScFv Mouse IgG IgG2a IgG2b IgG Rat IgG IgG2a IgG2b IgG2c Bovine IgG Cat IgG N/A Chicken IgG Dog IgG Goat IgG +/ Guinea Pig IgG Hamster IgG Horse IgG /- Pig IgG Rabbit IgG Sheep IgG +/- ++ -

22 biomapping 使用する試薬 1 A G, L c-myc CAT.NO. A7470 G- CAT.NO. E3403 HNTG buffer HEPES, ph 7.5 NaCl TRITON X-100 Glycerol 20 mm 150 mm 0.1% (w/v) 10% (w/v) Washing buffer (Ice cold): HNTG buffer or PBS, ph 7.4 or other buffers (CAT.NO.P4417) e.g., RIPA buffer 直接免疫沈降法 ( マイクロカラム ) c-myc CAT.NO. A7470 FLAG P.48 1 c-myc L PBS 1mL PBS RIPA 200 L PBS 1mL L 9 10

23 ラージスケール (5mL) の手順 c-myc CAT.NO. A mL PBS 2 PBS M ph mL 3 PBS 5mL OD PBS 9 c-myc 0.1M ph mL 10 1N L ph

24 biomapping 間接免疫沈降法 A G, L 2 A G, L Resin first Lysate first Resin first 法 ,000g L L L ,000g mL 3 3,000g mL ,000g mL 4 3,000g 4 2 Lysate First 法 ,000g mL 10 L L L ,000g mL 4 3,000g 4 2

25 精製関連製品紹介 25 HIS タグ精製 製品名 説明 CAT.NO. 価格 ( ) HIS-Select Nickel Affinity Gel 小から中スケールのヒスチジンタグ融合タンパク質精製用レジンです キレ P6611-5ML 17,500 よく ート基とアガロースが独自の非電荷親水性結合しているため ヒスチジンタ P ML 52,800 使われています グ融合タンパク質に対する選択性を高め 他のタンパク質との非特異的結合 P ML 167,800 を低減させます 選択性が高いため 単一工程で精製できます アフィニテ P ML 722,600 ィーゲルは 変性条件と非変性条件のいずれにおいても使用できます :6% アガロースビーズ :>15 mg/mlゲル ( 約 30 kdaのタンパク質の場合 ) :30% のエタノール溶液に 50% のアガロースビーズを懸濁 HIS-Select HF Nickel Affinity Gel 大規模での精製および FPLC 用途に使用できるよう設計されたヒスチジン H0537-1ML 9,200 タグ融合タンパク質精製用のNickel Affinity Gelです HIS-Select High H ML 36,800 Flow (HF) は HIS-Select 技術の優れた選択性を高度に架橋したアガロー H ML 73,500 スに付与することで 加圧下での高流速および機械的安定性を実現しまし H ML 233,300 た H ML 957,100 : 高架橋 6% アガロースビーズ :>15 mg/mlゲル ( 約 30 kdaのタンパク質の場合 ) :30% のエタノール溶液に 50% のアガロースビーズを懸濁 HIS-Select Cobalt Affinity Gel ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製に アフィニティー金属としてコバルト H8162-5ML 20,600 をお使いになりたい方にお勧めです HIS-Select Cobalt Affinity Gel は高 H ML 74, H ML 純度 低非特異的結合 高結合容量のレジンです ヒスチジンタグ融合タンパク質を変性条件と非変性条件のいずれにおいても精製できます マトリックス :6% アガロースビーズ : >15 mg/mlゲル ( 約 30 kdaのタンパク質の場合 ) :30% のエタノール溶液に 50% のアガロースビーズを懸濁 HIS-Select Nickel Spin Columns HIS-Select Spin Columnはスモールスケールの細胞抽出液からヒスチジン H EA タグ融合タンパク質を高速かつ安定的に精製できる ready-to-use のスピン H EA カラムです 低非特異的吸着 高純度タンパク質精製を達成する HIS- Select テクノロジーを用いたシリカ粒子マトリクスが充填されています 15 分以内で精製できます 結合能 : 1カラムあたり500 µg 以上 EZview Red HIS-Select HC Nickel Affinity Gel HIS-Select ilap 5 ml Column プルダウン法のような小量スケールの精製を行う際 マイクロチューブ内のレジンは無色なため識別しにくいことがあります EZview Red Affinity Gel は レジンが赤色に着色しているため 沈殿と上清を容易に識別できます そのため 沈殿を吸引するリスクを劇的に減少させます EZview レジンは通常の無着色レジンと同様の性質を持ちます 目的タンパク質のロスを少なくすることで より正確なデータを得ることができます アガロースビーズ ( 赤色 ) の 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) :> 15 mg/ml ゲル E3528-1ML E3528-5X1ML HIS-Select ilap(integrated Lysis and Affinity Purification: 溶解および H9913-1EA アフィニティー一体型精製 ) カラムは 細胞溶解およびタンパク質精製ステ H EA ップを一度に行えます カラムは ヒスチジンタグ付きタンパク質を 5 ml の細菌培養から直接 1 ステップで精製できるようにデザインされています この 1 ステップ法は Sigma の特許取得済みiLAP テクノロジーを使用しており これにより 組み換えクローン株からのヒスチジンタグ付きタンパク質精製を迅速かつ簡便に行えます 224,800 25,900 92,500 8,900 30,100 9,200 81,600 HIS-Select Wash Buffer HIS-Select Elution Buffer カラム 1 本で 大腸菌培養液 5 ml から1 mg 以上のヒスチジンタグ付きタンパク質を 1 時間未満で精製 精製タンパク質は プロテインアッセイ SDS-PAGE ウェスタンブロッティング および MALDIに使用できます HIS-Select 洗浄バッファーは 10 mmイミダゾール溶液です 非変性条件 H ML 28,700 において HIS-Select 製品を用いてヒスチジンタグ融合タンパク質を精製す る際 洗浄ステップで非特異的タンパク質結合の低減に最適です :10 mmイミダゾール, 0.3 M 塩化ナトリウム, 50 mmリン酸ナトリウ ム含有 (ph 8.0) HIS-Select 溶出バッファーは 250 mmイミダゾール溶液です HIS-Select H ML 28,700 製品やその他の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー製品からヒス チジンタグ融合タンパク質の溶出に最適です :250 mmイミダゾール, 0.3 M 塩化ナトリウム, 50 mmリン酸ナトリ ウム含有 (ph 8.0)

26 biomapping HA タグ精製 Anti-HA Agarose Affinity Gel よく使われています EZview Anti-HA Agarose Affinity Gel よく使われています 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 : 0.01M PBS (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 懸濁液, 抗体 / レジン固定率 :2.0 ~ 2.4mg/ ml 結合能力 :HA 融合タンパク質 30 ~ 50 nmol/ml ゲル標識 : アガロースビーズ :N 末端またはC 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 :HA タグ融合タンパク質約 0.4 mg/ml ゲル (27 kdaタンパク質の場合 ) : アガロースビーズ ( 赤色 ) の50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) HA Peptide 分子量 : : 凍結乾燥粉末 : human influenza virus hemagglutinin (HA) の アミノ酸に相当する合成ペプチド :Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala Anti-HA Immunoprecipitation Kit 免疫沈降 免疫アフィニティ精製 免疫沈降 HA 融合タンパク質の競合的溶出標準使用濃度 5 ~ 10µg/mL Anti-HA Immunoprecipitation Kitは 免疫沈降において 免疫沈降 HAタグ融合タンパク質を最大限に回収します マイクロ遠心 免疫アフィニティ精製チューブの代わりにミニスピンカラムで全ての処理を行うため 抗原 - 抗体結合ビーズの洗浄が簡単で 実験ごとのばらつきは最小限に抑えられます 哺乳動物細胞を迅速 効果的に溶解する細胞溶解試薬 CelLytic M Cell Lysis Reagentもキットに含まれています A2095-1ML A2095-5X1ML E6779-1ML E6779-5X1ML I MG I2149-1MG 91, ,400 61, ,200 13,700 23,000 IP0010-1KT 128,000 その他タグ精製製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格 ( ) Anti-c-Myc Agarose Affinity Gel : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 免疫沈降 免疫アフィニティ精製 A7470-1ML 98,200 : 0.01M PBS(pH7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 懸濁液 :c-myc 融合タンパク質約 2 nmol/ml ゲル : アガロースビーズ EZview Red Anti-c-Myc Affinity Gel c-myc Peptide Anti-c-Myc Immunoprecipitation Kit Anti-V5, Agarose Affinity Gel V5 Peptide Glutathione Agarose lyophilized powder :c-myc タグ融合タンパク質 : 赤色アガロースビーズの PBS 懸濁液 (50% グリセロール 抗菌 防腐剤として %Kathon CG/ IPCII 含有 ) : : 凍結乾燥粉末 : ヒト c-myc の C 末端の アミノ酸に相当する合成ペプチド : Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu 免疫沈降 c-myc 融合タンパク質の競合的溶出 5 ~ 10 µg/ml E6654-1ML E6654-5X1ML M2435-1MG M2435-4MG M MG 96, ,600 15,300 38, ,500 免疫沈降において c-myc タグタンパク質を最大限に回収で 免疫沈降 IP0020-1KT 128,200 きるよう 特別にデザインされたキットです 工程はマイク 免疫アフィニティ精製ロチューブではなくミニスピンカラム中で行われるので 抗原 抗体結合ビーズを簡便に洗浄でき 実験ごとの結果のばらつきも最小限に抑えられます 哺乳動物細胞を迅速 効果的に溶解する細胞溶解試薬 CelLytic M Cell Lysis Reagent もキットに含まれています 1 キット 50 回分 :V5 タグ (GKPIPNPLLGLDST) 融合タンパク質を認識 免疫沈降 A7345-1ML 99,400 します 免疫アフィニティ精製 :0.01M PBS(pH 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 懸濁液 :V5 タグ融合タンパク質約 2.5 nmol/ml ゲル : アガロースビーズ : V5 融合タンパク質の V7754-4MG 52,600 : パラミクソウイルス SV5 の非構造タンパク質 V お 競合的溶出 よび RNA ポリメラーゼαサブユニット (P タンパク 質 ) の アミノ酸に相当する配列の N 末端に 5 ~ 10 µg/ml システインを付加した合成ペプチド : 凍結乾燥粉末 : Cys-Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu- Gly-Leu-Asp-Ser-Thr :GST( グルタチオン -S- トランスフェラーゼ ) :5 ~ 10 mg(gst)/ml レジン : 凍結乾燥粉末 ( 安定化のためラクトース含有 ) 粉末 1 g を 10.5 ~ 16.0 ml に膨潤させて使用 : 架橋 4% アガロースビーズ EZview Red Glutathione Affinity 特異性 : GST( グルタチオン -S- トランスフェラーゼ ) Gel : 5 ~ 10 mg(gst)/ml レジン : アガロースビーズ ( 赤色 ) の 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) : 架橋 4% アガロースビーズ アフィニティ精製 アフィニティ精製 G4510-1ML G4510-5ML G ML G ML E6406-1ML E6406-5X1ML 9,200 28,700 41, ,500 22,200 83,400

27 タグ精製 FLAG 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG アフィニティゲル ANTI-FLAG M1 特異性 : N 末端 FLAG 融合タンパク質用 (Ca Agarose Affinity Gel 依存性 ) 免疫沈降 A4596-1ML 64,400 Ca 2+ イオンの欠如で抗原 - 抗体複合体は解離します N 末端 FLAG 融合タンパク質 A4596-5ML 139,600 細胞質内で発現した Met-FLAG 融合タンパク質とはの精製 A ML 249,700 反応しません プロセッシングされていない細胞質発 A ML 480,900 現したタンパク質を認識しません 結合能力 : タンパク質 >0.6mg/1mL gel 結合には Ca 2+ が必要溶出 :FLAG ペプチド グリシン緩衝液 (ph3.5) EDTA 形状 : アガロースビーズの 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール, 0.02%(w/v) アジ化ナトリウム含有 ) ANTI-FLAG M2 Agarose 特異性 : すべての位置の FLAG および 3xFLAG 融合タンパ 免疫沈降 A2220-1ML 33,000 Affinity Gel ク質 FLAG 3xFLAG 融合タンパク A2220-5ML 98,000 結合能力 : タンパク質 > 0.6mg/1mL gel よく質の精製 A ML 198,000 使われています溶出 :FLAG ペプチド 3xFLAG ペプチド グリシン (ph A ML 439, ) 形状 : アガロースビーズの 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール, 0.02%(w/v) アジ化ナトリウム含有 ) 特異性 : すべての位置の FLAG および 3xFLAG 融合タンパク 免疫沈降 F2426-1ML 78,000 EZview Red ANTI- FLAG M2 Affinity Gel 質結合能力 : 0.6mg/1mL gel 溶出 :FLAG ペプチド グリシン (ph 3.5) 3xFLAG ペプチド形状 : 赤色アガロースビーズの PBS 懸濁液 (50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/ IPCII 含有 ) FLAG 3xFLAG 融合タンパク F2426-5X1ML 質の精製 200,000 FLAG ペプチド FLAG Peptide よく使われています アミノ酸配列 :Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 分子量 : 形状 : 凍結乾燥粉末 FLAG 融合タンパク質の ANTI-FLAG M1 及び M2 アフィニティゲルからの溶出 標準使用濃度 : 100µg/mL F3290-4MG F MG 21, ,200 3xFLAG Peptide よく使われています アミノ酸配列 : Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr- Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys 解説 :Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp 配列が 3 回繰り返されています C 末端の 8 アミノ酸は標準的な FLAG 配列 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 分子量 : 形状 : 凍結乾燥粉末 3xFLAG 融合タンパク質の ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルからの溶出 標準使用濃度 : 100µg/mL F4799-4MG F MG 61, ,600 キット構成 CelLytic M 10x Wash Buffer Elution Buffer 3xFLAG Peptide ANTI-FLAG M2-Agarose Affinity Gel Amino-terminal FLAG-BAP Fusion Protein Polypropylene chromatography column FLAG M 精製キット FLAG M Purification Kit FLAG M Purification Kit では CelLytic M を用いて哺乳動物細胞の迅速かつ効果的な溶解 タンパク質抽出を行い ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルを用いて FLAG タグ融合タンパク質のアフィニティ精製を行います 特異性の高いモノクローナル抗体をアガロースに共有結合した ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルにより精製や免疫沈降を行います アフィニティゲルを用いることにより 前処理やキャリブレーションしなくても 効率的に FLAG 融合タンパク質を結合させることができます 結合した融合タンパク質は酸性条件や 3xFLAG ペプチドによる競合で効果的に溶出できます 溶出されたタンパク質は活性 サイズ 翻訳後修飾 相互作用などの分析に用いることができます 1mL アフィニティ精製カラムで 3 ~ 5 回分の試薬が入っています ご注文情報製品名 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG M Purification Kit CELLMM2-1KT 146,200

28 biomapping FLAG 免疫沈降キット FLAG Immunoprecipitation Kit シグマの FLAG Immunoprecipitation Kit を用いて迅速かつ効率的に活性のある FLAG 融合タンパク質の免疫沈降 溶出をすることができます 結合した FLAG 融合タンパク質のうち通常 70 ~ 90% が生物学的活性を保持したま ま溶出されます 免疫沈降はタンパク質やタンパク質複合体の単離に非常に有効な方法です 免疫沈降は図のようなステップで行われます キット構成 ANTI-FLAG M2 affinity gel Elution Buffer FLAG-BAP Control Protein 3xFLAG Peptide Lysis Buffer 2x Sample Buffer 10x Wash Buffer 特異性の高い抗体を用いてエピトープタグ融合タンパク質のアフィニティ精製や免疫沈降を行うため その後の生化学的 免疫学的分析が容易になります 特長 ANTI-FLAG M2 3xFLAG ご注文情報 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG Immunoprecipitation Kit FLAGIPT1-1KT 141,300 FLAG タグの除去に エピトープタグ除去 エンテロキナーゼ製品名 説明 認識ペプチド CAT.NO. 価格 ( ) Enterokinase from bovine intestine エンテロキナーゼは特異性の高いセリンプロテアーゼで FLAG ペプチドの切断に利用されています 凍結乾燥粉末 溶解用のバッファーが付属しています FLAG (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys-X*-C) の Lys-X を切断します * X 位置が Pro の場合は切断できません E UN 45,800 エンテロキナーゼ除去セット 製品名 説明 キット構成 CAT.NO. 価格 ( ) Enterokinase Removal Kit PRKE-1KT 79,900 エンテロキナーゼ ( ウシ由来 ) を除去するためのキットです 抗ウシエンテロキナーゼ抗体を固定化したアガロースビーズにエンテロキナーゼを結合させ フィルターろ過によってエンテロキナーゼを除去することができます Anti-Enterokinase-Agarose Conjugate, 1.5 ml 20 Wash Buffer, 4 ml Spin Filters, 10 each FLAG タグを利用した精製法に関しては巻末の特集ページ (P.48) をご覧ください

29 テクニカルサポート タンパク質の確認 検出 タグをつけて発現させたタンパク質の検出は通常水性条件下で行われることから 親水性のタグはタンパク質 表面に提示される確率が高くなり それにより抗体に近づき 物質を捕捉することができます 全てのタグが親 水性ですが 特に親水性の高いものがあります 荷電 酸性又は塩基性 残基をもつことで親水性が高まりま すが これは天然に存在するエピトープの 1 つの特徴です タグがもつ親水性という特徴のため 発現タンパク質の可溶性を向上させることもあります タグの大きさと位 置も その作用に影響します Dyson ら 2004 大型のタグは 立体的に抗体に近づきやすいため 検出がより容易になることが多くあります SDS の存在下 であっても 小分子タグはホストタンパク質の中に折り畳まれ 検出から免れてしまうことがあります しかし 荷電残基を取り込んだタグの利用が これの克服に役立ちます それがもつ親水性により表面に押し出され 抗体認識のための強いモチーフになります タグのサイズと荷電という現象を活用した 実際の 1 例が FLAG エピトープです これは 8 個のアミノ酸の長さ しかもっていませんが 全ての残基 DYKDDDDK が荷電しているため 非常に高感度の検出ができます エピトープの大きさを 3 倍にして 3xFLAG タンデムリピート DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDK にする ことで この感度は 10 倍になっています 免疫蛍光法 基質 シグナルを 蛍光顕微鏡で 観察 蛍光標識をした 2次抗体 ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ HRP 標識抗体 基質の酸化 化学発光シグナル 1次抗体 タンパク質 エピトープタグ ブロット膜 免疫組織化学 スライドに固定された組織等 ELISA 酵素結合免疫測定法 基質 基質 酵素標識 2次抗体 発色 発色 酵素標識 2次抗体 1次抗体 1次抗体 エピトープタグ タンパク質 エピトープタグ タンパク質 スライドに固定された組織等 タンパク質溶液 例 培養細胞のライセートなど エピトープタグ 96ウェルプレートなどの容器内 出 イムノブロッティング 検 検出は免疫検出に限られません クロラムフェニコールアセチル基転移酵素 CAT と緑色蛍光タンパク質 GFP はそれぞれ 酵素アッセイ又は蛍光アッセイにより測定できます GFP は生細胞上で画像化することができ そ のプロセスを固定化した切片から外挿するのではなく リアルタイムで調べることができます 種々の検出法を 以下の図に比較して示します

30 biomapping イムノブロッティング ( ウェスタンブロット ) HRP TMB 3,3',5,5'- HRP CAT. NO.A7058 CAT.NO. H Transfer Buffer 1 Tris-HCl, ph M Methanol 20% 2 Transfer Buffer 2 Tris-HCl, ph M Methanol 20% 3 Transfer Buffer 3 Tris-HCl, ph M Methanol 20% -amino caproic acid 25 mg/ml 2 SIGMA FAST BCIP /NBT BCIP/NBT AEC TMB SIGMA FAST DAB NC 0.45 m % BSA CAT.NO.A9647 TBS PBS CAT.NO. メタノール JIS 特級 ML-J 710 ε - アミノカプロン酸 A G 5,600 トリスバッファー塩 T PAK 8,900 Tween 20 含有トリス緩衝生理食塩水 (ph 8.0) T PAK 8,900 リン酸緩衝生理食塩水 P PAK 8,600 ニトロセルロース (NC) 膜 孔径 0.45µm(CAT.NO.N8267) N8267-5EA 19,600 アルカリホスファターゼ基質 :SIGMA FAST BCIP/NBT タブレット B5655-5TAB 6,000 アルカリホスファターゼ基質 :BCIP/NBT 溶液 B ML 13,000 ペルオキシダーゼ基質 : AEC 染色キット AEC101-1KT 22,700 ペルオキシダーゼ基質 : メンブレン用 TMB 基質液 T ML 18,200 ペルオキシダーゼ基質 : SIGMA FAST DAB タブレット D4418-5SET 8,700

31 SDS-PAGE 10 20% SDS-PAGE 80 80mm g g g/well 1cm V Disc Electrophoresis and Related Techniques of Polyacrylamide Gel Electrophoresis by H.R. Mauer de Gruyter;Berlin, New York, 1971 タンパク質のブロッティング PVDF 1 PVDF mA/cm S 2 -ve +ve

32 biomapping 免疫検出 1% TBS PBS BSA 1 NC ml NC TBS/Tween PBS/Tween NC TBS/Tween PBS/Tween 1 7 NC 4 TBS アルカリホスファターゼの場合 : SIGMA FAST BCIP /NBT BCIP/NBT ペルオキシダーゼの場合 : AEC DAB TMB 1 NC NC 3 NC Burnette, W.N., Anal. Biochem., 112, (1981) 2. Hames, B.D., and Richwood, D.(eds.), Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford (1981) 3. Gershoni, J.M., and Palade, G. E., Anal. Biochem., 131, 1-15 (1983)

33 免疫組織化学 HRP 2 HRP 1 2 Extravidin 10mM ph7.4 PBS CAT.NO. P3813 P4417 BSA CAT.NO. A BSA PBS CAT.NO. P3688 CAT.NO CAT.NO PBS 4mM CaCl2 CAT.NO. T mM ph PBS CAT.NO. T7168 CAT.NO. P mM ph 6.0 CAT.NO. S4641) 1mM EDTA, ph 8.0 CAT.NO. E AEC CAT.NO. AEC101 DAB CAT.NO. D4418 TR AS-MX CAT.NO. F4648 CAT.NO. MHS1 CAT.NO. S5641 パラフィン除去 / 再水和 PBS 30

34 biomapping 抗原回復 ( シグナルが弱い場合のオプション ) 1 酵素法 PBS 0.1 PBS PBS マイクロ波回復法 W ペルオキシダーゼの不活化 (HRP 検出法を利用した場合 ) 2 ExtrAvidin PBS 5 PBS 2

35 次抗体反応 1 5 BSA( L PBS PBS 次抗体反応 Extravidin L L PBS 7 PBS PBS 14 PBS 5 15

36 biomapping オプション 2: 酵素標識 2 次抗体 L PBS 7 PBS 5 発色 1mM CAT.NO. L

37 対比染色 ( カウンターステイン ) AEC AEC Harris' 1 Mayer s Mayer s CAT.NO. アルブミンウシ血清由来 A G 11,900 リン酸緩衝生理食塩水 P3813-1PAK 1,500 リン酸緩衝生理食塩水 (BSA 含有 ) P PAK 37,700 キシレン ML 4,900 エタノール ML-J 2,000 トリプシンブタ膵臓由来 T TAB 6,200 トリプシンブタ膵臓由来 T7409-1G 4,700 プロテアーゼ Bacillus licheniformis P MG 8,100 クエン酸三ナトリウム二水和物, ACS グレード S G 3,400 エチレンジアミン四酢酸 E G 2,800 ExtrAvidin -ペルオキシダーゼ E ML 16,700 ExtrAvidin アルカリホスファターゼ E ML 15,800 AEC Staining Kit(AEC 染色キット ) AEC101-1KT 22,700 過酸化水素溶液 ML-J 880 SIGMAFAST 3,3 - ジアミノベンジジンタブレット D4418-5SET 8,700 SIGMAFAST ファストレッド TR/ ナフトールタブレット F4648-5SET 5,000 SIGMAFAST BCIP /NBT B5655-5TAB 6,000 ヘマトキシリン溶液 マイヤー法 MHS1-100ML 1,700

38 biomapping 免疫蛍光法 1, PBS 0.01M ph CAT.NO. P3813 P CAT.NO CAT.NO X-100 PBS 3 4 CAT.NO. P6148 5M NaOH PBS PBS CAT.NO. T PBS 1 CAT.NO. P6148 5M NaOH PBS -20 CAT.NO PEM mM EGTA 2mM MgCl2 6H2O 0.1M PIPESNaOH ph 6.8 CAT.NO mm CAT.NO. S8902

39 細胞の調製 PBS 固定 4 メタノール - アセトン固定 パラホルムアルデヒド - トリトン固定 PBS X パラホルムアルデヒド - メタノール固定 PBS PEM- エタノール固定 1 PEM 10 2 PBS PBS 3 1 5

40 biomapping 1 次抗体反応 1 1 PBS 60 2 PBS 次抗体反応 PBS 30 2 PBS PBS 評価 1 2 Fc CAT.NO. リン酸緩衝生理食塩水 P3813-1PAK 1,500 リン酸緩衝生理食塩水 ( タブレット ) P TAB 12,000 メタノール SAJ 特級 ML-J 1,600 アセトン histological grade, ML 5,100 パラホルムアルデヒド P G 3,500 Triton X-100 T ML 10,400 メタノール SAJ 特級 ML-J 1,600 スライド ( 顕微鏡用 ) S8902-1PAK 4,000

41 法 ELISA ELISA PBS - ph 9.6 PBST 2 抗原のコーティング 10mM ph mM NaCl 0.1 CAT.NO. P4417 CAT.NO. C mM ph mM NaCl 0.05 TWEEN 20 CAT.NO. P HRP SIGMAFAST pnpp CAT.NO. N1891 HRP SIGMAFAST OPD CAT.NO. P9187 3M NaOH HRP 3M HCl 3M H2SO4 1 - PBS 2 0.2mL PBST 3 5 BSA-PBS 30 Vogt, R.F., et al., 1987 J. Immunol.Meth., 101, 43.

42 biomapping 1 次抗体反応 1 1 PBST 2 0.2mL PBST 次抗体の利用 1 2 PBST 0.2mL 発色 0.2mL 30 pnpp OPD pnpp 405nm OPD 450nm 1 50 L CAT.NO. リン酸緩衝生理食塩水 P TAB 12,000 リン酸緩衝生理食塩水 (BSA 含有 ) P PAK 8,600 アジ化ナトリウム S2002-5G 1,600 炭酸 - 重炭酸バッファー C CAP 17,400 SIGMAFAST p-npp タブレット N1891-5SET 5,000 SIGMAFAST OPD P9187-5SET 5,000

43 検出関連製品紹介 43 FLAG 製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG 抗体 ANTI-FLAG M1 : N 末端融合タンパク質 (Ca 2+ 依存性 ) Ca 2+ イオン 免疫沈降 F MG 80,400 Monoclonal Antibody, の欠如で抗原 - 抗体複合体は解離します 細胞質内 ウェスタンブロット F3040-1MG 137,100 Purified IgG で発現した Met-FLAG 融合タンパク質とは反応しま (10µg/mL, 化学発光法 ) F3040-5MG 231,400 せん : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) ANTI-FLAG M2 : すべての位置の FLAG 融合タンパク質 アフィニテ 免疫沈降 F UG 38,000 Monoclonal Antibody, ィ精製済み抗体のため より高い特異性 免疫細胞化学 F1804-1MG 72,000 Affinity Purified : 溶液 (50% グリセロール 10mM リン酸ナトリウム ウェスタンブロット F1804-5MG 116,000 よく 150mM NaCl ph7.4 保存剤非含有) タンパク質 (1µg/mL, 化学発光法 ) 使われています 濃度は約 1mg/mL EIA ANTI-FLAG M2 : すべての位置の FLAG 融合タンパク質 免疫沈降 F MG 38,600 Monoclonal Antibody, : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl 免疫細胞化学 F3165-1MG 76,800 Purified IgG ph % アジ化ナトリウム含有 ) タンパク質濃 ウェスタンブロット F3165-5MG 213,000 よく 度は約 4 mg/ml (0.5 ~10µg/mL, 化学発光法 ) 使われています ANTI-FLAG M5 : Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 哺乳動物細胞 ウェスタンブロット F MG 45,800 Monoclonal Antibody 粗精製物中の Met-FLAG 組み換えタンパク質の検出 (10µg/mL, 化学発光法 ) F4042-1MG 96,900 に適 大腸菌発現系には不適 F4042-5MG 173,600 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) 免疫沈降 F UL 84, Rabbit Monoclonal ANTI-FLAG, ascites fluid :N 末端と C 末端 FLAG 融合タンパク質 :15 mm アジ化ナトリウムを含む腹水 免疫細胞化学 (1:125~1:250) EIA ウエスタンブロット (1:1,000 ~ 1:2,000, 化学発光法 ) Rabbit ANTI-FLAG Polyclonal Antibody よく使われています : N 末端 C 末端 Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 免疫沈降 : 溶液 (10mM PBS ph7.4 1% BSA および 15 mm 免疫細胞化学アジ化ナトリウム含有 ) ウェスタンブロット (2.5µg/ ml, 化学発光法 ) 免疫蛍光染色 (5µg/mL) F MG 66,100 標識 FLAG 抗体 ANTI-FLAG BioM2 Antibody, Biotin Conjugate ANTI-FLAG BioM5 Monoclonal Antibody, Biotin Conjugate : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質用 : 50% グリセロール溶液 (10mM リン酸ナトリウム ph mM NaCl 0.02% アジ化ナトリウム含有 ) : ビオチン : Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 大腸菌発現系には不適 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) : ビオチン 免疫細胞化学 ウェスタンブロット (1 ~ 10µg/mL, 化学発光法 ) 免疫細胞化学 ウェスタンブロット (2µg/mL, 化学発光法 ) F MG F9291-1MG F9291-5X1MG 47,300 97, ,500 F2922-1MG 112,600 ANTI-FLAG M2 Alkaline Phosphatase : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質用 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 : 溶液 (TBS 50% グリセロール 1mM MgCl 2 15mM アジ化ナトリウム含有 ) : アルカリホスファターゼ ウェスタンブロット ( 1:1,000) ELISA (1:20,000) A MG A9469-1MG 55, ,900 ANTI-FLAG M2 Peroxidase よく使われています : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 : 溶液 (PBS 50% グリセロール 安定剤 防腐剤 ) : ペルオキシダーゼ (HRP) 免疫細胞化学 (1:100 ~ 1:1,000) ウェスタンブロット (1:100 ~ 1:1,000) ELISA (1:20,000) A MG A8592-1MG A8592-5X1MG 49,900 95, ,000

44 biomapping FLAG 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) 標識 FLAG 抗体 ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody FITC 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl 1% BSA 0.1% アジ化ナトリウム ph7.4) : FITC 免疫蛍光染色 (10µg/mL, メタノール : アセトン固定 ) フローサイトメトリー F MG F4049-1MG F4049-5X1MG 54, , ,100 ANTI-FLAG M2 Cy3 Conjugate : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム ph mM NaCl 1% BSA 15 mm アジ化ナトリウム ) : Cy3 免疫蛍光染色 (10µg/mL, メタノール : アセトン固定 ) A MG A9594-1MG A9594-5X1MG 57, , ,800 お奨め二次抗体 Rabbit Anti-Mouse IgG, (whole molecule) Peroxidase Conjugate : マウス IgG すべてのマウスイムノグロブリンと結合します : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有 : ペルオキシダーゼ (HRP) ELISA(1:40,000) 免疫組織化学 (1:200, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) ウェスタンブロット ( 1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) A9044-2ML 42,200 Goat Anti-Mouse IgG, : マウス IgG Fab Fab Fragment Peroxidase Conjugate, Adsorbed with Human IgG Goat Anti-Mouse IgG, Fab Fragment Peroxidase Conjugate, Adsorbed with Human IgG and Rat Serum Proteins Fab フラグメントを認識し Fc とは交差しません すべてのマウスイムノグロブリンと交差します ヒト IgG で吸収済み : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有 : ペルオキシダーゼ (HRP) : マウス IgG Fab Fab フラグメントを認識し Fc とは交差しません すべてのマウスイムノグロブリンと交差します ヒト IgG ラット血清タンパク質で吸収済み : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有 : ペルオキシダーゼ (HRP) ELISA(1:60,000) 免疫組織化学 (1:150, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) ウェスタンブロット ( 1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) A9917-1ML 36,300 ELISA(60,000) 免疫組織化学 (1:150, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) ウェスタンブロット ( 1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) A3682-1ML 51,000

45 poly-his 45 製品名 説明 CAT.NO. 価格 ( ) :N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリ H ML 54,200 ヒスチジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します H ML 123,900 : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) : ウェスタンブロット 1:3,000( 大腸菌中で発現誘導させたポ リヒスチジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) 免疫蛍 光染色 免疫沈降 ELISA :N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリ A ML 133,100 ヒスチジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します :0.05Mトリス緩衝液 (ph 8.0, 1% BSA, 1.0 mm MgCl2, 50% グリセロール, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) : アルカリホスファターゼ : ウェスタンブロット 1:2,000( 大腸菌中で発現誘導させたポリ ヒスチジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) :N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリ A7058-1VL 138,500 ヒスチジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します : 凍結乾燥品 0.5mL の脱イオン水で復元 0.01M PBS (1% BSA, 0.01% チメロサール含有 ) : ペルオキシダーゼ (HRP) : ウェスタンブロット 1:2,000( 大腸菌中で発現誘導させたポリ ヒスチジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) HIS-Selectニッケルコーティング高感度マルチウェルプレートは 少 S5688-1EA 10,100 量のヒスチジンタグ融合タンパク質の検出を高精度で行えるようデザ インされたプレートです 捕捉されたタンパク質は ELISA 法を用い て検出可能です 1well あたり 最低 1ng ヒスチジンタグ融合タン パク質を検出できます HIS-Select High Capacity(HC)Nickel Coated Plate は 独自の S5563-1EA 17,826 高密度ニッケルキレートマトリクスによりコーティングされています 他社のプレートと比べて 高結合容量 低非特異結合を示し 得ら れたヒスチジンタグ融合タンパク質は様々な用途に使用可能です Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse Monoclonal Anti-polyHistidine-Alkaline Phosphatase antibody produced in mouse Monoclonal Anti-polyHistidine-Peroxidase antibody produced in mouse HIS-Select HS Nickel-Coated 96-Well Plates HIS-Select HC Nickel-Coated 96-Well Plates Nickel Filter Plates96-well 96 ウェルプレートで 4µg/well 以上のタンパク質が結合できます HIS-Select Filter Plate は 固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) を利用した精製用フィルタープレートで スモールスケールの細胞抽出物からヒスチジンタグ融合タンパク質を精製するのに適しています ニッケルでチャージした独自の 4 座配位キレートで誘導体化したシリカ粒子 (20µm) の親水性層が 96 ウェルプレートに充填されています 安定した結合性 (2 mg/well 以上 ) CelLytic 細胞溶解試薬と併用可能 H0413-1EA H0413-5X1EA 44, ,600 GST 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) Anti-GST antibody produced in rabbit Anti-GST Alkaline Phosphatase Conjugate antibody produced in rabbit Anti-GST Peroxidase Conjugate antibody produced in rabbit : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 溶液 : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します : トリス緩衝液 (ph 8.0, 1% BSA, 1mM MgCl 2, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) : アルカリホスファターゼ : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します :PBS 溶液 (ph 7.4, 0.01% チメロサール含有 ) : ペルオキシダーゼ (HRP) ウェスタンブロット (1:2,000) ELISA G ML G ML 78, ,000 ウェスタンブロット A ML 154,800 (1:20,000, 化学発光法 ) ELISA(1:400) ウェスタンブロット (1:2,000, 比色法 1:20,000, 化学発光法 ) ELISA(1:10,000) A ML 145,000 Monoclonal Anti-GST antibody produced in mouse Monoclonal Anti-GST antibody produced in rat :GST 融合タンパク質を認識します :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :GST 融合タンパク質を認識します Schistosoma japonicum 由来 GST と特異的に反応し ラット ウサギ ブタ ウシの肝臓およびヒト胎盤由来の GST は認識しません :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) ウェスタンブロット (0.2 ~ 0.4 µg/ml) ウェスタンブロット (0.05 ~ 0.1 µg/ml) 免疫沈降 ELISA SAB UL 81,700 SAB UL SAB UL 12,400 75,900

46 biomapping HA 製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格 ( ) :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ H ML 88,000 融合タンパク質 : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse ウェスタンブロット (1:10,000, 比色法 ) 免疫沈降 免疫細胞化学 ELISA Anti-HA-Tag antibody produced in rabbit Anti-HA tag antibody produced in chicken :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 :PBS 溶液 (0.02% アジ化ナトリウム含有, 50% glycerol) : HA (YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 : PBS 溶液 (0.02% アジ化ナトリウム含有 ) ウェスタンブロット SAB UG 32,600 (1:500 ~ 1:1000, 比色法 ) ELISA GW UG 51,500 Anti-HA antibody produced in rabbit, Affinity Isolated : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 :PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) ウェスタンブロット (1:1,000) 免疫沈降 (1:200) 免疫細胞化学 (1:50) H ML H ML 95, ,800 Monoclonal Anti-HA, Biotin Conjugate antibody produced in mouse :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 :PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) : ビオチン ウェスタンブロット B UG 65,700 (0.25 ~ 0.50 µg/ml, 化学 発光法 ) Monoclonal Anti-HA - Alkaline Phosphatase antibody produced in mouse Monoclonal Anti-HA - Peroxidase antibody produced in mouse :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 :Tris 緩衝液溶液 ph 8.0(1%BSA 1mM MgCl 2 50% グリセロール 防腐剤として 15mM アジ化ナトリウム含有 ) : アルカリホスファターゼ :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質 : 凍結乾燥品 0.5mL の脱イオン水で復元後 PBS 溶液 (1% BSA, 0.01% チメロサール含有 ) : ペルオキシダーゼ (HRP) ウェスタンブロット (1:4,000, 比色法 ) ウェスタンブロット (1:4,000, 化学発光法 ) A UG 169,800 H6533-1VL 124,700 Monoclonal Anti-HA, FITC conjugate antibody produced in mouse :N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融 免疫蛍光染色合タンパク質 (1 ~ 5 µg/ml) :PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :FITC H UG 65,900 Monoclonal Anti-HA - TRITC antibody produced in mouse :N 末端および C 末端 HA タグ (YPYDVPDYA) 免疫蛍光染色融合タンパク質 (10 ~ 15 µg/ml) :PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :TRITC( ローダミン ) H UG 111,900

47 c-myc 47 製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格 ( ) Monoclonal Anti-c- :N 末端および C 末端 c-myc タグ ウエスタンブロット M UL 77,200 Myc antibody produced (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 (1:5,000, 化学発光法 ) in mouse :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含 免疫沈降 有 ) 免疫組織化学 よく 免疫蛍光染色 使われています Monoclonal Anti-c- :N 末端および C 末端 c-myc タグ ウェスタンブロット M ML 77,000 Myc antibody produced (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 (1:100, 比色法 ) M ML 153,600 in mouse : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 免疫沈降 免疫組織化学 (1:500) ELISA Anti-c-Myc antibody :N 末端および C 末端 c-myc タグ ウェスタンブロット C MG 95,900 produced in rabbit, (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 (0.5~1.0µg/mL) Affinity Isolated :PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナト 免疫細胞化学 (5 ~ 10 リウム含有 ) µg/ml, メタノール : アセ : 約 0.5mg/mL トン固定細胞 ) 免疫沈降 Monoclonal Anti-c- :N 末端または C 末端 c-myc タグ ( EQKLISEEDL) ウェスタンブロット B UG 70,900 Myc - Biotin antibody 融合タンパク質 (0.05 ~ 0.1 µg/ml, 化学 produced in mouse :PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 発光法 ) mm アジ化ナトリウム含有 ) : ビオチン Monoclonal Anti-c- :N 末端および C 末端 c-myc タグ ウェスタンブロット A ML 147,400 Myc - Alkaline (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 (1:100, 比色法 ) Phosphatase antibody : トリス緩衝液 (ph 8.0, 1%BSA, 1mM MgCl 2, produced in mouse 50% グリセロール, 0.1% アジ化ナトリウム含有 ) Anti-c-Myc - Peroxidase antibody produced in rabbit : アルカリホスファターゼ :N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 :PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 0.01% チメロサール含有 ) : ペルオキシダーゼ (HRP) ウェスタンブロット (1:5,000) A UG 85,600 Monoclonal Anti-c- Myc - FITC antibody produced in mouse :N 末端または C 末端 c-myc タグ ( EQKLISEEDL) 免疫蛍光染色 (5.0 µg/ 融合タンパク質 ml) :PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :FITC F UG 58,800 Monoclonal Anti-c- Myc - Cy3 antibody produced in mouse :N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質 :PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :Cy3 免疫蛍光染色 (1:50) C ML 106,400 Monoclonal Anti-MYC, (C-terminal) antibody produced in mouse Monoclonal Anti-MYC- FITC, (C-terminal) antibody produced in mouse : ヒト c-myc の C 末端領域 (AEEQKLISEEDLL) :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) : ヒト c-myc の C 末端領域 (AEEQKLISEEDLL) :PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) :FITC フローサイトメトリー (1 ~ 5 µg/ml) フローサイトメトリー (1:200) SAB UG 30,900 SAB UG 46,800

48 biomapping FLAG 発現システム FLAG FLAG 8 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys FLAG ANTI-FLAG M1, M2, M5 FLAG FLAG FLAG FLAG (1)FLAG システムを使用する実験のフロー プラスミド ( コンストラクト ) の作製 FLAG PCR DNA 大腸菌による発現 哺乳動物細胞による発現 タンパク質の精製 FLAG SDS-PAGE 目的の用途に使用

49 大腸菌における FLAG タグ融合タンパク質の発現 G FLAG (A) 大腸菌発現用ベクターの種類 FLAG N C 5~10 (B) 発現用宿主 ( タンパク質を発現させる大腸菌 ) について DH5 BL21 DE3 FLAG 4 (C) 発現の誘導条件 FLAG OD600 Sigma LE392 FLAG-BAP 0.4% 50 g/ ml LB 37 OD M IPTG 2 49Fタンパク質発現の誘導条件検討プロトコール例 1 FLAG 50 g/ml 0.4% LB 1.5 2mL ml 50 g/ml 0.4% 20 ml LB OD OD ml 25 L SDS-PAGE M IPTG OD600 IPTG OD LB 0.5 ml 25 L SDS-PAGE SDS FLAG M IPTG LA

50 biomapping 大腸菌宿主で発現させたタンパク質の抽出 FLAG FLAG FLAG (A) 発現した FLAG タグ融合タンパク質の局在確認 FLAG SDS FLAG a b c d d -70 発現したタンパク質の局在確認のプロトコール例 a d 50 ml a c ml a ml L SDS-PAGE SDS b ml 2 2 c CelLytic B CAT.NO.B ml SDS-PAGE SDS SDS-PAGE 5 15 L c 1. b 1 ml 2 TCA SDS-PAGE SDS d 1 50 ml 5,000 x g ml 0.5 M Sucrose, 0.03 M Tris-HCl ph 8.0, 1mM EDTA 3 3,500 x g ml 5 3,500 x g L 50 L 2xSDS-PAGE SDS

51 各分画のタンパク質抽出 G (B) Bulletin, Product Information Sheet ml 5,000 x g 10 OD g g ml CelLytic B CAT.NO.B ,000 x g g 8 ml CelLytic IB CAT.NO.C ,000 x g 15 5 CelLytic IB CAT.NO.C F 2. FLAG 250 ml 5,000 x g OD g 1 10 mm Tris-HCl ph ml 1 g ml 2 3,500 x g mm Tris-HCl ph ml 4 3,500 x g M Sucrose, 0.03 M Tris-HCl ph 8.0, 1 mm EDTA 40 ml 1 g 40 ml 6 3,500 x g ml 1 g ml 8 3,500 x g xTBS ph FLAG M1 1 mm CaCl ,000 x g Whatman Grade No 1 LA

52 biomapping FLAG タグ融合タンパク質の精製 FLAG FLAG Sigma FLAG M1 FLAG M2 (I) 抗 FLAG 抗体アフィニティーゲルの特徴 27 FLAG CAT.NO. M1 A4596 N M2 A2220 F2426 Met-N FLAG FLAG M1 FLAG M1 Ca 2+ EDTA EDTA FLAG 3xFLAG N C FLAG 3xFLAG Met-N CAT.NO.F2426 (II)FLAG タグ融合タンパク質の溶出方法について 1 EDTA FLAG M1 EDTA 2 FLAG M1 FLAG 2 2 FLAG FLAG FLAG 3 ph 3.5 ph (III)FLAG タグ融合タンパク質の精製プロトコール例 FLAG FLAG M2 FLAG M2 CAT.NO.A ml 0.6 mg FLAG 49 kda 20 FLAG DTT 2-2- mercaptoethanol FLAG M2 FLAG M2 CelLytic CelLytic FLAG M2 CelLytic

53 アフィニティー精製プロトコール概要 G (1) アフィニティーゲルの準備と吸着 ( 以下のいずれかの方法 ) a Immunoprecipitation 1 2 ml b Batch Absorption c Column Chromatography 100 ml (2) 溶出 ( 以下のいずれかの方法 ) a FLAG b c SDS (3) アフィニティーゲルの再利用 保存 ( 必要に応じて ) タンパク質抽出液 ( 細胞溶解液 ) について FLAG M M NaCl ph Sigma CelLytic FLAG M2 CAT.NO.A (1) (a) (c) FLAG 53F 1 mm a Immunoprecipitation 1 2 ml ml 1 FLAG M2 40 L 1.5 ml L TBS 50 mm Tris HCl, 150 mm NaCl, ph 7.4 8,200 x g ml 3 1 ml ,200 x g L TBS ,200 x g LA

54 biomapping b Batch Absorption 1 a c Column Chromatography FLAG M2 1 3 ml 100 ml DNA RNA 1 CAT.NO.C TBS 50 mm Tris HCl, 150 mm NaCl, ph TBS 3 FLAG M2 4 TBS M ph TBS TBS FLAG M2 4% agarose bead Sepharose CL4B CAT.NO.CL4B200 IgG- CAT.NO.A0919 (2) 溶出 a c FLAG 2-8 a FLAG FLAG FLAG 3xFLAG 3xFLAG 3xFLAG FLAG FLAG 3xFLAG FLAG 3 FLAG FLAG CAT.NO.F3290 TBS 100 g/ml ( 150 g/ml) 100 L ,200 x g 30 5 b 0.1 M ph 3.5

55 0.5 M Tris HCl, ph 7.4, 1.5 M NaCl 10 L G L 0.1 M ph 3.5 (1) ,200 x g M Tris, ph L 2-2. (1) 1 ml ph c SDS ( 50 kda) ( 25 kda) 2- DTT 5% 50 mm 1 20 L 2xLaemml CAT.NO.S3401; 125 mm Tris HCl, ph 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.004%bromophenol blue (1) 2 5 8,200 x g 30 SDS (3) アフィニティーゲルの再利用 保存 M ph TBS ph TBS % TBS PBS 55F4 5 ml 50% TBS PBS 0.02% (IV)FLAG タグの切断プロトコール例 N FLAG 3xFLAG enterokinase mm Tris ph mm CaCl2, 1% TWEEN 20 FLAG 1.5 mg/ml,ph mg 0.02 units CAT.NO.E FLAG LA 2 18 FLAG FLAG CAT.NO.PRK-E

56 biomapping 抗 FLAG 抗体による実験プロトコール (A) 抗 FLAG 抗体について FLAG DYKDDDDK FLAG FLAG 3xFLAG ELISA Sigma FLAG FLAG FLAG FLAG FLAG M2 M2 FLAG M2 FLAG 3xFLAG N -FLAG Met-N FLAG C FLAG FLAG FLAG M2 CAT.NO.F3165 CAT.NO.F1804 FLAG M2 CAT.NO.F3165 F1804 FLAG M2 CAT.NO.A2220 FLAG 3xFLAG FLAG CAT.NO.F7425 FLAG 3xFLAG N -FLAG Met-N FLAG C FLAG FLAG よく使われている抗 FLAG 抗体 マウス産生モノクローナル抗 FLAG M2 抗体 FLAG FLAG M2 CAT.NO.F3165 F1804 FLAG M2 CAT.NO.A2220 FLAG FLAG M2 ウサギ産生ポリクローナル抗 FLAG 抗体 FLAG FLAG CAT.NO.F7425

57 抗 FLAG 抗体によるウェスタンブロッティング ( 化学発光法 ) のプロトコール例 G B) FLAG SDS g 2 PDVF % TBS, ph 8.0CAT.NO.T8793) ml/cm 57F2 5 4 TBS, ph ml/cm 2 6 FLAG M2 CAT.NO.F3165 F FLAG M2 1:1, % TBS, ph ml/cm 2 7 TBS, ph ml/cm 2 8 IgG- CAT.NO.A Sigma 1 CAT.NO.CPS160 1:30, % TBS, ph ml/cm 2 9 TBS-T 0.5% TWEEN 20 TBS, ph 8.0 CAT.NO.T ml/cm CAT.NO.CPS Expose BioMax Light film CAT.NO.Z LA

58 biomapping (C) 抗 FLAG 抗体による蛍光染色のプロトコール例 FLAG M2 CAT.NO.F3165 F1804 IgG IgG -FITC 1 FLAG 2 4% CAT.NO.P6148 4% CAT.NO.S1888 PBS, ph PBS % Triton X-100 CAT.NO.T9284 PBS 5 5 PBS % BSA CAT.NO.A9647 PBS FLAG M2 CAT.NO.F3165 F % BSA PBS FLAG M2 1:500 1:2,000 8 PBS IgG - FITC CAT.NO.F % BSA PBS IgG - FITC 1:1, PBS 5 3 D) 抗 FLAG 抗体による免疫沈降 FLAG FLAG M2 FLAG 3 FLAG FLAG 53~55

59 哺乳動物細胞における FLAG タグ融合タンパク質の発現 G FLAG 1 DNA FLAG 2 DH5 3 DNA 4 COS HeLa 5 COS G418 7 FLAG CAT.NO. CAT.NO. LB (1x ) L2542 FLAG F7425 LB ( ) 1 50mL L7275 FLAG M2 F3165 LB ( ) 1 50mL L7025 FLAG M2 F1804 ( ) A1296 IgG -FITC F9137 ( ) A0166 IgG A F(7) 付録関連製品リスト D- IPTG (Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside) (10 ) (70 ) (350 ) CelLytic B ( ) CelLytic IB ( ) CelLytic M ( ) G418 FLAG M1 FLAG M2 FLAG M2 CL-4B IgG- (10 ml ) FLAG 3xFLAG G7021 I5502 PLN10 PLN70 PLN350 B7435 C5236 CAT.NO. C2978 A1720 CAT.NO. A4596 A2220 F2426 CL4B200 A0919 C2103 F3290 F4799 E4906 PRKE EDTA ( ) Tris-HCl, ph 8.0 (1M ) TBS, ph 7.4 (10x ) TBS-T (TBS + TWEEN 20, ph 8.0, ) 1 1L E5134 T2694 T5912 T9039 3% TBS, ph 8.0 ( ) 1 100mL T8793 PBS, ph 7.4 (10x ) PBS, ph 7.4 ( ) 1 200mL PBS, ph 7.4 ( ) 1 1L PBS-T, ph 7.4 (PBS + TWEEN 20, ) 1 1L P5493 P4417 P3813 P3563 3% PBS, ph 7.4 ( ) 1 100mL P2194 1% BSA PBS, ph 7.4 ( ) 1 1L P3688 BSA (Albumin from bovine serum) Triton X-100 ( X-100) SDS-PAGE 2x (2x ) X (Carestream Kodak BioMax 35 x 43cm) A9647 P6148 S1888 T9284 S3401 Z LAFLAG FLAG

60 CelLytic シリーズ プロテアーゼインヒビターシリーズ 2 HIS シリーズ HIS-Select 4 その他のタグ製品 FLAG poly-his c-myc HA GST FLAG シリーズ FLAG Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SAFC, SIGMA-ALDRICH and SUPELCO are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. FLUKA is a registered trademark of Sigma-Aldrich GmbH. Ascentis, Astec, SupelMIP, CHIROBIOTIC and HybridSPE are registered trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC. Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at ANTI-FLAG, BCIP, ExtrAvidin, FLAG, HIS-Select, ilap and Trizma are registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. 3xFLAG, CelLytic, EZMix, Ezview, FLAG-BAP, p3xflag, p3xflag-cmv, p3xflag-myc-cmv, pbicep-cmv, pcmv-bicep, pcmv-flag-mat, pcmv-mat-flag, pflag-ats, pflag-cmv, pflag-cmv2, pflag-cmv3, pflag-cmv4, pflag- CTC, pflag-cts, pflag-mac, pflag-myc-cmv, pflag-shift, pt7-flag, pt7-flag-mat, pt7-mat, pt7-mat-flag, ptac-mat and SIGMAFAST are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC. BioMax and Carestream are registered trademarks of Carestream Health, Inc. TWEEN is a registered trademark of Croda International PLC. Kodak is a registered trademark of Eastman Kodak Company. Benzonase is a registered trademark of Merck KGaA. IGEPAL is a registered trademark of Rhodia Operations. Kathon is a registered trademark of Rohm and Haas Co. Cy3 and FPLC are trademarks of GE Healthcare. DH5 is a tardemark of Invitrogen Corp. Triton is a trademark of The Dow Chemical Company or an affiliated company of Dow. 本記載の製品および情報は 2014 年 9 月 1 日現在の情報であり 収載の品目 製品情報 価格等は予告なく変更される場合がございます / 最新の情報は 弊社 Web サイト (sigma-aldrich.com/japan ) をご覧ください / 掲載価格は希望納入価格 ( 税別 ) です 詳細は販売代理店様へご確認ください / 弊社の試薬は試験研究用のみを目的として販売しております 医薬品原料並びに工業用原料等としてご購入の際は こちらの Web サイト (sigma.com/safc-jp) をご覧ください お問い合わせは下記代理店へ シグマアルドリッチジャパン 東京都品川区東品川 天王洲セントラルタワー 4F 製品に関するお問い合わせは 弊社テクニカルサポートへ TEL : FAX : sialjpts@sial.com 在庫照会 ご注文方法に関するお問い合わせは 弊社カスタマーサービスへ TEL : FAX : sialjpcs@sial.com SAJ