の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる図4 研究である研究内容私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行ったこの結果これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形

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ひできさかいざわ
6 years ago
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AKT活性を抑制するペプチド阻害剤の開発野口昌幸北海道大学遺伝子病制御研究所教授広村信北海道大学遺伝子病制御研究所ポスドク岡田太北海道大学遺伝子病制御研究所助手柳舘拓也株式会社ラボ研究員ナーゼAKTに結合するタンパク分子を検索しこれまで機能の分からなかったプロトオンコジンTCL1がAKTと結合し AKT の活性化を促す AKT活性補助因子

1 AKT活性を抑制するペプチド阻害剤の開発野口昌幸北海道大学遺伝子病制御研究所教授広村信北海道大学遺伝子病制御研究所ポスドク岡田太北海道大学遺伝子病制御研究所助手柳舘拓也株式会社ラボ研究員ナーゼAKTに結合するタンパク分子を検索しこれまで機能の分からなかったプロトオンコジンTCL1がAKTと結合し AKT の活性化を促す AKT活性補助因子であることを見い出したこの結論はTCL1がAKTを介した細胞分裂細胞死アポトーシスの抑制などを促進し白血病やヒトリンパ系の腫瘍の病因となっていることを明らかにした 2000 野口昌幸実験医学 2000 図2参照図2 研究の背景 TCL1-Akt 複合体モデルセリンスレオニンキナーゼAKT Protein Kinase Bの別称は細胞死アポトーシスを制御する重要な細胞内シグナル伝達因子である図1参照 AKTの活性化は乳癌肺癌を始め様々なヒト悪性腫瘍において病因となる一方プロトオンコジン TCL1はヒトT細胞芽球白血病をはじめ EBV感染症 Ataxia Telangiectasiaなど様々な悪性腫瘍でその発現が上昇している図1 AKT.キナーゼは細胞死制御の要の分子である我々はこれまで機能のわからなかったプロとオンコジンTCL1が AKTと２量体を形成を促すような形で複合形成し活性化を促進するAKT活性化補助因子であることを証明しヒトT細胞芽球性白血病の分子学的原因を明らかにした αβγ AKT/PKB する分子学的な機序を明らかにし Laine et al.,.2002 TCL１とAKTの結合ならびにTCL１の重合形 к к 我々はTCL1-AKT複合体内部でTCL１がAKTを活性化成が共にAKT活性補助因子としての機能アポトーシスの抑制細胞増殖に必要不可欠のものであることを明らかにした AKTキナーゼは細胞内での細胞死アポトーシス制御の要の分子であり細胞外刺激によりPI3K, PDK1などのキナーゼを介して活性化される活性化されたAKTはBAD, FKHRL,IKBKなど様々な分子と結合しリン酸化により細胞死細胞増殖などの細胞反応を制御している申請者は先にプロトオンコジンTCL1が細胞内のアポトーシスを制御しているAKTキナーゼに結合し AKTを活性化する AKT活性補助因子であることを明らかにしヒトT細胞芽球 Kunstle et al., さらに AKT-TCL1 複合体の結晶構造解析を行い特にAKTのPleckstrin Homology ドメインの構造を明らかにし膜リン脂質PIP3との構造的な関係を明らかにした Auguin et al., 2003;Auguin et al., et al., 2004; Auguin 2004 研究目的 AKTの活性化はヒトの様々な悪性腫瘍や血液疾患の原因白血病の分子学的な原因を明らかにした AKT は細胞外からの刺激により細胞膜へ移行し AKTの因子となっており細胞死制御の要であるAKT活性化の制御 P Hドメインに膜リン脂質 P I P 3 が結合し P D K 1 は重要なポストゲノムの研究課題であるしかしこれまでAKT Phosphoinositide Dependent Kinase１の働きにより活性の活性を抑制する特異的阻害剤は有効なものがなかった化される活性化されたA K TはF K H R F o r k H e a d 我々はこれまでの研究を元に細胞死を抑制する中心的な役 Transcription Factor BAD Nur77など様々な細胞内基割を担う細胞内シグナル分子セリンスレオニンリン酸化酵素質をリン酸化しアポトーシスや細胞増殖を制御する AKTの活性を特異的に阻害するペプチドを同定する本研究申請者はこれまでインターロイキン２のコモンガンマ鎖からのはアポトーシス制御など癌の基礎的研究のみならず TCL1遺細胞内シグナル伝達因子の研究を続けセリンスレオニンキ伝子の過剰発現や癌抑制遺伝子PTENの異常によるAKT 59

の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる図4 研究である研究内容私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行ったこの結果これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形成しAKTを活性化させる AKT活性補助因子であることを示したこの結果 TCL1

2002 さらに Reversed Yeast Two Hybrid法を用いたランダムアミノ酸ライブラリーを用いてプロトオンコジン TCL1がAKT PHドメインに結合するために必須な結合ドメインのアミノ酸配列を同定した Kunstle et al., Mol Cell Biol. 1.

NMR 2003 Homology Domain PH domain に結合する Akt-inペプチ図3 ドはTCL1のAkt結合配列の一部であるこのペプチドがAkt 特異的結合分子の同定とその解析法に結合するか否かあるいはもし結合すればどの部位と結合するかを検討する必要があるこのためリコンビナント蛋白を用いたPull Down Assay により標的ペプチドのＰＨドメイン選択

2 の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる図4 研究である研究内容私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行ったこの結果これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形成しAKTを活性化させる AKT活性補助因子であることを示したこの結果 TCL1 の異常により発症するヒトT細胞リンパ芽球性白血病TPLL T Cell Prolymphocytic Leukemia の分子学的な病因機序を明らかにした Laine et al.,mol. Cell 2000; Laine et al., J. Biol. Chem さらに Reversed Yeast Two Hybrid法を用いたランダムアミノ酸ライブラリーを用いてプロトオンコジン TCL1がAKT PHドメインに結合するために必須な結合ドメインのアミノ酸配列を同定した Kunstle et al., Mol Cell Biol また AKTのTCL1結合部位の結晶構造を明らかにし標的ペプチドとAKTの結合に関する検討野生型プロトオンコジンT C L 1はA k tのp l e c k s t r i n た Auguin et al., J. Biomol. NMR 2003 Homology Domain PH domain に結合する Akt-inペプチ図3 ドはTCL1のAkt結合配列の一部であるこのペプチドがAkt 特異的結合分子の同定とその解析法に結合するか否かあるいはもし結合すればどの部位と結合するかを検討する必要があるこのためリコンビナント蛋白を用いたPull Down Assay により標的ペプチドのＰＨドメイン選択性ならびにAKT特異性を検証した図5 Akt-inペプチドはとを介して結合するスライド我々はYeast Two Hybrid 法を用いてAKTに結合する細胞内分子を検索したさらにこれらのAKT結合分子の結合のAKT検証しそのリン酸化などのAKT活性への効果を検討した AKTとの結合部位を結合分子のランダムライブラリーを用いて同定した我々はこれらの生化学的構造学的な研究を通しプロトオンコジンTCL1のAKT結合に必須なアミノ酸配列がTCL1の beta A sheetならびにｂe sheetからなる平面で形成される平面であることを示した本研究ではこれまでの研究により図4に方法 βc GST TCL1のコントロールペプチドとともにAKT-in ペプチドを大腸菌にて作成した示すこのTCL1のAKT結合平面も一部を形成するbeta A Akt-inペプチド: NH2-AVTDHPDRLWAWEKF sheetに相応するアミノ酸配列に基づいたペプチドakt-in COOH AVDTHPDRLWAWEKF を作成し AKT活性の抑制効 TAT-Flag Akt-in: NH2-YGRKKRRQRRR- 果生化学的反応性生物反応を解析しこのペプチドによる DYKDDDDK- AVTDHPDRLWAWEKF-COOH AKT阻害剤としての可能性を検証するコントロールペプチド βc: NH2- EKQHAWLPLTIECOOH 60

3 Akt-in ペプチドは Akt の活性をで抑制する M

4 Akt-in ペプチドはAKTとPtdIns(1,3,4,5)P4 結合を抑制する

5 Akt-in は in vitro での細胞増殖を抑制する

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル 60 秒でわかるプレスリリース 2007 年 12 月 17 日独立行政法人理化学研究所免疫の要 NF-κB の活性化シグナルを増幅する機構を発見 - リン酸化酵素 IKK が正のフィーッドバックを担当 - 身体に病原菌などの異物 ( 抗原 ) が侵入すると誰にでも備わっている免疫システムが働いて異物を認識し排除するためにさまざまな反応を起こしますその一つに免疫細胞である B 細胞が