逆相 HPLC 分析におけるメソッド開発 1. 逆相 HPLC 分析におけるメソッド開発 1.1 カラム 1.2 移動相 1.3 試料 2. トラブルシューティング 1

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2 逆相 HPLC 分析におけるメソッド開発 1. 逆相 HPLC 分析におけるメソッド開発 1.1 カラム 1.2 移動相 1.3 試料 2. トラブルシューティング 1

3 メソッド開発のフロー例情報収集既存法類似情報献メソッド開発の標の設定 HPLC 条件の検討装置カラム移動相堅牢性の評価バリデーション 2

4 HPLC 条件の検討項カラムブランド修飾基サイズ粒径移動相有機溶媒緩衝液 ph 試料注量試料溶媒検討項も多く複雑知識経験ノウハウが必要どのように条件を決める? 3

5 HPLC 条件の設定化合物の性質構造の利初期条件を設定する解離性 pka 酸性物質酸性移動相塩基性物質中性弱アルカリ性移動相疎性 log Pow 有機溶媒率分量 5000 以上細孔径 30 nm の充填剤溶解性有機溶媒 4

6 初期条件の設定例 (PDA UV) 時間短縮のためカラム : ODS 粒径 3 μm or 5 μm カラムサイズ : mm 移動相 : アセトニトリル + 緩衝液酸性物質 : mmリン酸塩基性物質 : mmリン酸緩衝液 ph7 流速 : 1 ml/min 試料 : 1 mg/ml 程度の試料を1 μl 注検出 : PDAで nm 粒径 2 μm 3 μm mm mm メソッド開発のポイント ODS カラム移動相試料 5

7 1.1 カラム ODS カラムの選定ブランド分離 (ODSの導量) ピーク形状( エンドキャッピング ) 耐久性サイズ分離 ( さ ) 分析時間( さ ) 溶媒使量( さ内径 ) 粒径分離分離は粒径やさでカバーできるがピーク形状はエンドキャッピングでのみ改善できるより性能なカラムを使する 6

8 ODS のエンドキャッピング ODS カラムの表構造般的な ODS カラム L-column2 ODS オクタデシル基疎性相互作サンプル疎性相互作サンプル次的相互作度エンドキャッピング属不純物シラノール基エンドキャッピングが不分だと保持の変動ピーク形状の悪化耐久性の低下 7

9 カラムブランドの違い塩基性物質 ( 抗アレルギー剤 ) の分析 L-column2 ODS Brand A の ODS カラム Brand B の ODS カラム Analytical conditions Column: C18(ODS), 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN /25 mm Phosphate buffer ph 7 (60/40) Flow rate: 1 ml/min Temp.: 40 Detection: UV 220 nm Sample: 1. フェキソフェナジン 2. クロルフェニラミン 3. トリプロリジン 4. ジフェンヒドラミン 5. ジフェニルピラリン 6. ホモクロルシクリジン 7. ヒドロキジジン 8. アステミゾール 9. プロメタジンカラムの違いによってピーク形状がきく異なるより性能なカラムはメソッド開発時間の短縮になる 8

10 充填剤の粒径充填剤の粒径をさくするとメリット理論段数流速での使分離の向上分析時間の短縮デメリット圧上昇耐久性の低下装置の変更 UHPLCの導カラム保護 9

11 分析時間の短縮粒径 : 5 μm カラムサイズ : mm 3 流速 : 0.4 ml/min 粒径 : 2 μm カラムサイズ : mm 流速 : 1.2 ml/min Analytical conditions Column: L-column2 ODS Mobile phase: CH 3 OH/ 25 mm Phosphate buffer ph 7 (15/85) Temp.: 40 Detection: UV 260 nm Inj.vol.: 1 μl Sample: 1. テルブタリン (60 mg/l) 2. サルブタモール (30 mg/l) 3. プロカテロール (30 mg/l) in mobile phase System: Agilent 1200SL 粒径 5μm 2μm t R(3) N (3) Rs (1,2) t R : 保持時間 ; N: 理論段数 ; Rs: 分離度同等な分離で分析時間を 1/6 まで短縮できる 10

12 ODS カラムで分離しないときは? C8 カラム有機溶媒率がさいときの分離の改善疎性がさいため保持のきい化合物の分析時間の短縮 C6-Phenyl カラム芳族化合物や位置異性体の分離改善疎性がさいため保持のきい化合物の分析時間の短縮 11

13 修飾基の違いオクタデシル基 C8 基 C6-Phenyl 基シリカゲル表 ODS カラム C8 カラム C6-Phenyl カラム ODS 疎性相互作 ( ) C8 疎性相互作 ( 中 ) C6-Phenyl 疎性相互作 ( 中 )+π-π 相互作 ( ) 12

14 C8 カラムによる分離の改善例 1 1 Rs (2,3) =3.75 Rs (2,3) =1.53 Rs: 分離度 L-column2 C8 L-column2 ODS 5 6 Analytical conditions Column: 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN /25 mm Phosphate buffer ph 7 (30/70) Flow rate: 1 ml/min Temp.: 40 Detection: UV 220 nm Inj.vol.: 1 μl Sample: 1. スルピリド 2. デシプラミン 3. パロキセチン 4. マプロキセチン 5. アモキサピン 6. トラゾドン System: LC-10ADvp series (Shimadzu.co.) (min) 分析時間の短縮デシプラミンパロキセチンの分離が改善する 13

15 C6-Phenyl カラムによる分離の改善例 L-column2 C6-Phenyl 3 NO 2 2 O 2 N NO L-column2 ODS Analytical conditions Column: 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 OH/H 2 O (50/50) Flow rate: 1 ml/min Temp.: 40 Detection: UV 210 nm Inj.vol.: 2 μl Sample: 1. ニトロベンゼン 2. m- ジニトロベンゼン 3. 1, 3, 5- トリニトロベンゼン System: LC-10ADvp series (Shimadzu.co.) 1, 3, 5- トリニトロベンゼン (min) ニトロ基の多い化合物の保持が増加し溶出順が逆転する疎性の減少ベンゼン環の電密度の低下 14

16 C6-Phenyl カラムによる分離の改善例レボフロキサシンの不純物分析 L-column2 C6-Phenyl L-column2 ODS Analytical conditions Column: 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 OH/20 mm H 3 PO 4 (10/90) Flow rate: 1 ml/min Temp.: 40 Detection: UV 294 nm Inj.vol.: 2 μl Sample: 1. 不純物 A 2. 不純物 B 3. レボフロキサシン System: LC-10ADvp series (Shimadzu.co.) H H 3 C N O N N CH (min) HO O O F 3. レボフロキサシン ODS カラムと同条件で分離が改善する有機溶媒率が低い移動相では保持が強くなる 15

17 LC-MS/MS による分離パターンの違い道の質管理標設定項別添法 18 ( 農薬 ) L-column2 C8 L-column2 C6-Phenyl L-column2 ODS 特に LC-MS の分析の場合 ODS カラムや C8 カラムとべて C6- Phenyl カラムの分離パターンがきく異なる 16

18 1.2 移動相移動相の設定逆相 HPLC の移動相は有機溶媒系と系の混合したものが良くいられる有機溶媒系アセトニトリルメタノール系緩衝液イオン対試薬緩衝液は解離性物質の移動相として使するイオン対試薬はピーク形状の悪い解離性物質や保持のない解離性物質の移動相に添加して使する 17

19 有機溶媒移動相の有機溶媒アセトニトリル : カラム圧やUV 吸収が低いファーストチョイス 3 μm 以下のカラムに最適メタノール : UV 吸収がありカラム圧がい UV250nm 以上の波テトラヒドロフラン : 溶出はきいが PEEK 樹脂を膨潤させる試料が溶出しないときや分離パターンの変更イソプロパノールエタノール : 溶出はきいがカラム圧がい試料が溶出しないときや分離パターンの変更 HPLC 溶媒を使する溶媒の規格によりノイズや不純物が異なる特級のテトラヒドロフランには安定剤であるBHTが含有されている 18

20 アセトニトリルとメタノールアセトニトリル /20 mm リン酸 (35/65) メタノール /20 mm リン酸 (35/65) 安息酸フェノールフェノール安息酸 Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm; Column size: mm; Flow rate: 1 ml/min; Temp.: 30 アセトニトリル ( プロトン性 ) とメタノール ( プロトン性 ) で溶出順序が変わることがある 19

21 緩衝液溶液に酸は塩基を加えた時や希釈した時に ph の変化を緩和する作をもつ溶液を緩衝液 (buffer solution) という弱酸 + 共役塩基 H 3 PO 4 とH 2 PO - 4 ( 弱塩基 + 共役酸 NH 3 とNH 4+ ) 例 : リン酸緩衝液 (ph=1.83 付近のとき ) H 3 PO 4 H 2 PO 4- +H + 緩衝作が働く条件弱酸と共役塩基が共存 (1:1 のときが最 ) ph が弱酸の pka± 約 1 の範囲 20

22 リン酸の解離解離状態の存在率 ( リン酸の pka ) H 3 PO 4 H 2 PO 4 - HPO 4 2- PO 4 3- OH - HO-P-OH = O 存在率 (%) (ph) リン酸緩衝液は ph 4 と ph9 付近では緩衝能を持たない 21

23 逆相 HPLC で使される代表的緩衝液添加剤 MS pka 有効緩衝範囲推奨使条件トリフルオロ酢酸 < % ギ酸 % 酢酸 % 重炭酸アンモニウム 9.87(HCO 3 ) mm 9.36(NH 4+ ) (CO 3 2- ) アンモニア <10 mm リン酸 mm ホウ酸 ( 液クロの巻及び化学便覧第 5 版より ) *MS のときの緩衝範囲は pka±1 で濃度は 10 mm(0.1%) 以下 22

24 緩衝能の有無の較 ( 注量の影響 ) A) 20 mm KH 2 PO 4 (ph 4.4) アセトニトリル (75/25) 緩衝能なし B) 20 mm 酢酸緩衝液 (ph 4.4) アセトニトリル (75/25) 緩衝能あり O O OH O CH 3 注量 1μL 2μL 5μL メチルパラベン 1. 安息酸 HO Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 5 μm; Column size; mm Sample: 1. 安息酸 (100 mg/l); 2. メチルパラベン (100 mg/l) 緩衝能があると安息酸のピークがひずまない注量によって安息酸の保持時間が変化しない 23

25 緩衝能の有無の較 ( 再現性 ) ロット番号 E4311 E4312 E4313 CV (%) A) 20 mm KH 2 PO 4 ( 緩衝能なし ) 安息酸の保持時間分離度 B)20 mm 酢酸緩衝液 ( 緩衝能あり ) 安息酸の保持時間分離度 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 5 μm; Column size: mm Mobile Phase: A)20 mm KH 2 PO 4 (ph 4.4)/CH 3 CN (75/25) B)20 mm Acetate buffer (ph 4.4)/CH 3 CN (75/25) Inj.vol: 2 μl Sample: 1. 安息酸 (100 mg/l); 2. メチルパラベン (100 mg/l) 緩衝能のない移動相では解離性物質の保持時間や分離度のばらつきがきくなる 24

26 イオン対クロマトグラフィースルホン酸 R SO 3 - Na + C 4 H 9 C 4 H 9 N + C 4 H 9 C 4 H 9 Br テトラブチルアンモニウム (TBA) ブロマイド phを酸性にしても解離を抑えることができない第四級アンモニウムイオン - C 4 H 9 C 4 H 9 - R SO 3 N + C 4 H 9 C 4 H 9 イオン対形成電荷を打ち消しあって疎性が増加する R 2 R 1 N + R 4 R 3 X - R SO 3 - Na + ph で解離を抑えることはできないアルキルスルホン酸ナトリウム R SO 3 - R 2 R 1 N + R 4 R 3 25

27 イオン対試薬添加剤 MS 分式備考アルキルスルホン酸ナトリウム C n H 2n+1 SO 3 Na 3 n 13 炭素鎖がいとに溶けにくい n- ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) C 12 H 25 OSO 3 Na に溶けやすい過塩素酸ナトリウム NaClO 4 溶解度がいパーフルオロ酢酸 C n F 2n+1 COOH 1 n 7 システムに残留しやすいテトラブチルアンモニウムホスファート (TBA-P) (C 4 H 9 ) 4 N,H 2 PO 4 Cl Br などの塩があるジアルキルアミン (C n H 2n+1 ) 2 NH 3 n 6 * 試薬メーカーからイオン対クロマトグラフィーの試薬が発売されている 26

28 酸性物質の分析のための移動相酸性移動相酸性物質を解離の状態で分析するメリット : 保持負荷量の増加デメリット : なし中弱アルカリ性移動相 ( 分離しないとき ) 酸性物質を解離の状態で分析するメリット : 分離の改善デメリット : カラムの劣化保持負荷量の減少イオン対クロマトグラフィー ( 保持の弱いとき ) 解離している酸性物質にイオン対試薬を添加しイオン対を形成させて固定相に保持させるメリット : 保持の増加ピーク形状の向上デメリット : カラムの専化調製が煩雑 27

29 酸性物質の緩衝液の ph 設定緩衝液の ph による安息酸の解離解離状態の存在率 100 COOH COO - 存在率 (%) 50 保持時間 : 保持時間 : 0 ph 4.2 = pka (ph) 酸性物質は ph がさいときは解離状態が多く存在する解離解離状態の存在率は保持時間に影響するので緩衝液の ph は化合物の pka より 2 以上離れたものが望ましい 28

30 緩衝液の ph と保持時間解離平衡が解離側に移動すれば保持時間はくなる ph 6.7 ph 4.4 ph ph Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN /25 mm リン酸緩衝液 (25/75) ( 注 ) Flow rate: 1 ml/min Inj.vol.: 1 μl Sample: 安息酸 ( 注 )ph 4.4 のときは酢酸緩衝液を使緩衝液の ph と保持時間保持時間 6.65 min 3.08 min 1.85 min 解離状態 1.0% 61.3% 99.7% 緩衝液の ph により解離平衡が移動しそれに合わせて保持が変わる酸性移動相では安息酸が解離の状態であるため保持がきい 29

31 酸性物質のイオン対クロマトグラフィー 1 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN/10 mm TBA-PO 4 in H 2 O(45/55) Flow rate: 1 ml/min Detection: VIS 430 nm Inj.vol.: 1 μl 2 3 HO N N SO 3 Na OH N N SO 3 Na 1. α- ナフトールオレンジ 2. アシッドオレンジ N H N 3. アシッドオレンジ 5 N SO 3 Na イオン対試薬により理論段数と保持が向上する 30

32 塩基性物質の分析のための移動相酸性移動相塩基性物質を解離させた状態で分析するメリット : シラノールの影響を受けにくいデメリット : 保持負荷量の減少中弱アルカリ性移動相塩基性物質を解離解離させた状態で分析するメリット : 保持負荷量の増加デメリット : シラノールの影響を受けやすいカラムの劣化イオン対クロマトグラフィー ( 保持の弱いとき ) イオン対試薬を添加し塩基性物質とイオン対を形成させて固定相に保持させるメリット : 保持の増加ピーク形状の向上デメリット : カラムの専化調製が煩雑 31

33 塩基性物質の酸性移動相での分析シラノール解離プロプラノロール解離 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN/20 mm H 3 PO 4 (30/70) 試料濃度 1000 mg/l N=4000 N: 理論段数 Flow rate: 1 ml/min Temp: 40 Inj.vol.: 1 μl Sample: プロプラノロール CH 3 50 mg/l N= O OH N H CH 3 プロプラノロール pka 9.45 酸性移動相ではシラノール基の影響を受けなくなりピークがシャープになるが試料の濃度が濃いとピーク形状が悪くなり保持時間が短くなる負荷量の低下 32

34 塩基性物質の中性移動相での分析シラノール解離プロプラノロール解離試料濃度 1000 mg/l N: 理論段数 N=12200 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph 7 (30/70) Flow rate: 1 ml/min Temp: 40 Inj.vol.: 1 μl Sample: プロプラノロール CH 3 50 mg/l N= O OH N H CH 3 プロプラノロール pka 9.45 中性移動相では試料の濃度によるピーク形状や保持時間の変化がないエンドキャッピングが完璧の場合い理論段数負荷量の増加 33

35 塩基性物質の中性移動相での分析シラノール解離プロプラノロール解離 L-column2 ODS N: 理論段数 N=12000 Analytical conditions Column: ODS(C18), 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph 7 (30/70) Flow rate: 1 ml/min Temp: 40 Inj.vol.: 1 μl Sample: プロプラノロール (50 mg/l) CH 3 ODS カラム N= O OH N H CH 3 プロプラノロール pka 9.45 中性移動相ではシラノール基の影響を受けやすくなりカラムの差がじやすい ( エンドキャッピングの良し悪しがわかる ) 34

36 塩基性物質のイオン対クロマトグラフィー B A N=3136 N=10826 [Analytical conditions] Column:L-column2 ODS mm (C18, 5μm) Mobile phase: ACH 3 CN/20 mm H 3 PO 4 (30/70) BCH 3 CN/20 mm H 3 PO mm C 5 H 11 SO 3 Na(30/70) Flow rate:1 ml/min Temp.:40 Inj.vol.:1 μl Sample: ベルベリン O O N min 第四級アンモニウム塩はイオン対試薬により理論段数と保持が増加する OCH 3 OCH 3 35

37 塩基性物質のテーリング防策 1. テーリングの起こりにくいカラムを使する 2. 残存シラノールと試料が相互作しないようにするアセトニトリルからメタノールに変更するアンチテーリング剤 ( アミン類 ) を使する温度をくするイオン対試薬を使する 36

38 移動相にメタノールを使 S: シンメトリー係数シラノール会合体アミトリプチリン解離 Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm Column size: mm Flow rate: 1 ml/min Temp: 40 Detection: 225 nm Inj.vol.: 1 μl Sample: アミトリプチリン (in CH 3 CN) S=1.174 S=1.972 CH 3 OH /25 mm リン酸緩衝液 ph 7 (80/20) CH 3 CN /25 mm リン酸緩衝液 ph 7 (55/45) min メタノールが残存シラノールと素結合するため塩基性物質は残存シラノールと相互作できないただしカラム圧は上昇する 37

39 アンチテーリング剤の使 S: シンメトリー係数シラノール会合体プロプラノール解離 Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm Column size: mm Flow rate: 1 ml/min Temp: 40 Sample: プロプラノール S=1.092 S=1.212 CH 3 CN/20 mm リン酸 +5 mm トリエチルアミン (30/70) CH 3 CN/20 mm リン酸 (30/70) 添加アミン類が残存シラノールと結合するため塩基性物質は残存シラノールと相互作ができないただしカラムを専化しなくてはならない耐久性が悪くなる 38

40 温度をくする S (3) =1.117 S (3) =1.262 S (3) =1.458 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 3 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 CH /25 mm Phosphate buffer ph 7 (35/65) Flow rate: 1 ml/min Sample: 1. パロキセチン 2. シタロプラム 3. フルオキセチン , S (3) =1.656 S (3) = H 3 C NH O S: シンメトリー係数 CF 3 3. フルオキセチン温度がくなると塩基性物質と残存シラノールの間の吸脱着速度が速くなりテーリングが改善されるただしカラムの耐久性は低下する 39

41 1.3 試料注量注量の増加は感度の上昇とピーク形状の悪化のおそれカラムサイズ内径が細くなるほど注量が減少するオートサンプラーの再現性ばらつきの少ない注量を選ぶ試料溶媒有機溶媒率が増えるとピーク形状が悪化する前処理の最終溶媒は移動相に近い組成をお勧め 40

42 注量とカラムサイズカラムサイズの違いによる注量と理論段数理論段数の変動率 100% 90% 50% 内径 4.6 mm 内径 3.0 mm 内径 2.1 mm 内径 1.5 mm Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm Column size: 150 mm L. Mobile phase: CH 3 CN/H 2 O (60/40) Sample: ナフタレン (1 mg/l in CH 3 CN) 注量 (μl) 内径がさいほど注量によって理論段数へ影響する 41

43 試料溶媒の有機溶媒率メタノール率 50% 60% 70% Analytical conditions Column: L-column ODS, 5 μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 OH/H 2 O (55/45) Inj.vol: 100 μl Sample: 17b- エストラジオール (1 μg/ml) 80% サンプル溶媒組成に対するクロマトグラムの変化 90% 20 試料溶媒のメタノールの割合を変化有機溶媒率がいとピーク形状が悪くなる 42

44 試料溶媒の有機溶媒率有機溶媒 100% 試料溶媒の率の多い試料溶媒バンド幅が最初から広い! カラム部で旦濃縮される試料溶媒の基本は移動相と同じ組成にする注量は精度や感度に問題の無い範囲で少なく設定する 43

45 トラブルシューティング 1. 逆相 HPLC 分析におけるメソッド開発 2. トラブルシューティング 2.1 塩の析出 2.2 カラムの劣化 2.3 カラムの洗浄法 2.4 保持時間の変化 2.5 ピーク積の変化 44

46 2.1 塩の析出緩衝液 ( 塩 ) を使すると有機溶媒率がいと塩が析出する内径 4.6 mm のカラムにアセトニトリル /25 mm リン酸緩衝液 ph 7 (80/20) を 30 ml 送液するとカラム圧が 20% 上昇アセトニトリル /25 mm リン酸緩衝液 ph 7 左 (75/25) 右 (80/20) 次のような時は注意確認が必要有機溶媒と混合グラジエント分析カラム交換ポンプが送液不良のとき 45

47 2.2 カラムの劣化化学的要因酸性移動相による修飾基の脱離シラノール基の成アルカリ移動相による基材の溶解ボイドの発脂溶性成分などの蓄積蓄積成分と試料の相互作物理的要因システム移動相試料由来のごみなど不溶物の体積カラム圧の上昇緩衝液などの塩の析出カラム圧の上昇急激な圧変化や圧上限以上での送液ボイドの発カラムの劣化を防ぐには移動相の条件直しろ過ガードカラムプレカラムフィルター 46

48 カラムの劣化 ph9 での有機溶媒率と温度メタノール率 (50% vs 10%) 温度 (40 vs 25 ) CH 3 OH/ ホウ酸緩衝液 (10/90) CH 3 OH/ ホウ酸緩衝液 (50/50) N の維持率 (%) [Durability test conditions] Column: L-column2 ODS, 5μm Column size: mm Flow rate: 1 ml/min Temp.: 40 N の維持率 (%) [Durability test conditions] Column: L-column2 ODS, 5μm Column size: mm Mobile phase: CH 3 OH/ 20 mm ホウ酸緩衝液 ph 9.0 (10/90) Flow rate: 1 ml/min 時間 (h) 時間 (h) 有機溶媒率が低い温度がい劣化しやすい 47

49 カラムの圧上昇症状 : カラム圧が上昇しピーク割れが発カラム : L-column2 ODS,3 μm カラムサイズ : mm 使期間 : 2 3 週間 (300 時間以内 ) 移動相 : アセトニトリル / リン酸緩衝液 (ph 6.5) のグラジエント試料 : 医薬品など注量 : 5 10 μl 48

50 圧上昇の原因は? 洗浄前 N (4) =7000 P=17.5 MPa 洗浄後 N (4) = 8500 P=17.0 MPa フィルター交換後 N (4) = P=13.0 MPa N: 理論段数カラム側のエンドフィット内のフィルターを交換するとカラム性能が回復した原因 : カラムの付近に不溶物が蓄積しカラムが劣化した試料由来? 移動相由来? 49

51 移動相の劣化有機溶媒分析時にノイズがきくなる毎調製リン酸 ( 緩衝液 ) 微物が発しカラムを詰まらせる毎調製有機酸酸が揮発し濃度が変わる毎調製 50

カラムの保護 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 2 μm; Column size: 2.

52 カラムの保護 Analytical conditions Column: L-column2 ODS, 2 μm; Column size: mm Mobile Phase: CH 3 CN/H 2 O (60/40); Flow rate: 0.4 ml/min; Temp. 40 ; Detection: UV 254 nm; Inj.vol: 0.5 μl; Sample: ナフタレンプレカラムフィルターの装着によりカラムの寿命が向上する 51

53 L-column プレカラムフィルターの構造分析カラムに直結死容積がさい分離に影響なしフィルターのみ交換可能低コストで経済的接続タイプの変換 UPLC 接続からウォーターズ接続へ 52

54 カラムを持ちさせるためには充填剤の劣化を抑える ( 化学的要因 ) 移動相の ph は弱アルカリ性よりも酸性が良い移動相の有機溶媒率をくする緩衝液の濃度を薄く無機系より有機系が良いカラム温度を低くするカラムに不溶物をれない ( 物理的要因 ) 移動相や試料をろ過する注量を少量に抑える移動相はこまめに再調整する ( 特にリン酸緩衝液 ) ガードカラムやプレカラムフィルターを使する定期的にカラムを洗浄する 53

55 2.3 カラムの洗浄法実施例 : 使した移動相メタノール / リン酸緩衝液 (20/80) カラム L-column2 ODS, mm 1. 塩等を取り除いた移動相 : メタノール / 20/80 2. 有機溶媒の濃度を上げた移動相 : メタノール / 60/40 3. 有機溶媒 100% の移動相 : メタノール / 100/0 カラム容量の 20 倍程度の量で洗浄する (1 ml/min なら約 30 分 ) 塩を析出させない脂溶性の夾雑物を多く含む試料の場合 THF で洗浄する L-column シリーズの場合カラムを逆向きで洗浄することも有効 ( ミクロカラム以外 ) 54

56 2.4 保持時間の変化対処法 : 1 液漏れ確認 : 接続タイプのチェック増し締めシール交換 2 設定条件の確認 : 流量移動相組成温度 3 圧の変動 : エア抜きチェックバルブ洗浄 4 移動相が置き換わるまで待つ 7 カラム交換検出器カラム送液ポンプ恒温槽移動相 6 移動相 : 再調整 ph の確認脱気 8 サクションフィルター洗浄交換 5 クーラーなしの恒温槽の設定温度は室温 +10 以上廃液 55

57 2.5 ピーク積の変化対処法 : サンプルの保管の直し分に攪拌する試料溶媒の変更吸着しないカラムへ変更試料カラム検出器送液ポンプ恒温槽移動相適切な容量のシリンジシリンジ内の気泡洗浄液容量の変更波形処理の直し S/Nがさい廃液 56

58 カスタマーサービスのご案内デモカラム L-column2 及び G-column を対象に購前に最 2 か間分析条件や分離を試すことができますホームページのご案内アプリケーションや技術資料など最新の情報を掲載していますホームページアドレス分析相談承ります L-column シリーズ G-column を使しているこれから L-column シリーズ G-column を使おうと考えている連絡先 : メール chromato@ceri.jp 電話代表

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JASIS 2014_Web 逆相 HPLC の分析法開発に役つノウハウとトラブルシューティングの解説般財団法化学物質評価研究機構クロマト技術部 0 発表内容 1. 移動相有機溶媒緩衝液イオン対クロマトグラフィー 2. 分離の改善と分析時間の短縮カラムの変更分離度粒径 3. ダウンサイジング 4. トラブルシューティング 5. お知らせ 1 1. 移動相 1. 移動相移動相の設定逆相 HPLC の移動相は有機溶媒系と