自然免疫と獲得免疫 免疫 自然免疫 獲得免疫 病原体 異物の貪食 消化と炎症反応 ( 非特異的免疫応答 ) 抗体 ( 液性免疫 ) キラー T 細胞 ( 細胞性免疫 )

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1 ワクチンフォーラム東京 自然免疫の最近の進歩 大阪大学 WPI 免疫学フロンティア研究センター 審良静男

2 自然免疫と獲得免疫 免疫 自然免疫 獲得免疫 病原体 異物の貪食 消化と炎症反応 ( 非特異的免疫応答 ) 抗体 ( 液性免疫 ) キラー T 細胞 ( 細胞性免疫 )

3 獲得免疫を担当する主な細胞群 T 細胞 B 細胞 細胞性免疫 抗体産生 ワクチンの効果発揮には これらの細胞に免疫記憶を与えることがキーとなる

4 獲得免疫における遺伝子再構成と多様性 T 細胞受容体 1.2 x 10 7 通り H 鎖 L 鎖 T 細胞 抗体 ( 免疫グロブリン ) B 細胞 H 鎖 L 鎖 可変部定常部可変部定常部 V D J C V J C 1.2 x 10 4 通り 1x 10 3 通り V (250 種 ) D (12 種 ) J(4 種 ) C V (250 種 ) J(4 種 ) C

5 自己に反応する免疫細胞の除去 胸腺 T 細胞 B 細胞 骨髄 自己に反応する細胞が除去される 非自己に反応する細胞のみが体内に存在する

6 抗体 免疫の二次応答 ( 日 ) 抗原 A を 0 及び 28 日目に投与した際の A に対する抗体産生 抗原 B を 28 日目に投与した際の B に対する抗体産生

7 免疫記憶の原理 B 細胞 メモリー B 細胞 抗体産生 予防接種やワクチンの原理

8 免疫応答の基本 メモリー B 細胞 B 細胞 骨髄 未分化 B 細胞 免疫グロブリン遺伝子再構成 自己に反応する細胞が除去される 抗体産生

9 自然免疫に関わる細胞群 マクロファージ 好中球 Phagocytosed Salmonella 病原体の貪食 消化サイトカイン産生 ( 炎症 ) 樹状細胞 食細胞 病原体の貪食 消化サイトカイン産生 抗原提示

10 病原体 自然免疫と獲得免疫 病原体の発見と初期攻撃 樹状細胞 ( 抗原提示細胞 ) 攻撃 NK 細胞 好中球 マクロファージ自然免疫抗原ペプチド リンパ節へ移動 病原体への集中攻撃と防御 キラー T 細胞 ( 細胞性免疫 ) 抗体 ( 液性免疫 ) B 細胞 B 細胞 T 細胞情報交換 獲得免疫

11 アジュバント受容体としての Toll-like receptors 抗原だけを投与しても免疫反応は誘導されない アジュバント : 免疫補助剤抗原とともに生体に投与されたとき その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質 フロイント完全アジュバント (BCG 菌や結核菌の死菌 + フロイント不完全アジュバント ) 皮下で water in oil エマルジョンとして堆積し 少しずつ漏出するため体内滞在時間を延ばす効果 アジュバントは TLR を刺激することにより 自然免疫系の細胞の活性化に関わる

12 自然免疫も特異的に病原体を認識する 従来の考え方 上皮 新しい概念 上皮 病原体 非特異的貪食 病原体 TLR を介した特異的認識 マクロファージ樹状細胞など マクロファージ樹状細胞など

13 自然免疫系による病原体の貪食 ( 非特異的免疫 ) ( 従来の免疫応答の考え方 ) 樹状細胞による病原体特異抗原の提示 特異的受容体をもった T 細胞の活性化 病原体 感染組織 樹状細胞 輸入リンパ管 T 細胞 所属リンパ節 輸出リンパ管 末梢循環系

14 自然免疫系による病原体の認識 病原体認識による樹状細胞の活性化 特異的受容体をもった T 細胞の活性化 病原体 感染組織 樹状細胞 輸入リンパ管 T 細胞 所属リンパ節 輸出リンパ管 末梢循環系

15 病原体関連分子パターン LPS, CpG DNA, リポタンパク質など ) 認識 抗体産生 TLRs 樹状細胞 抗原提示 ヘルパー T 細胞補助機能分子 (CD40, CD80, CD86) 炎症性サイトカイン (IL-12, TNF-a) B 細胞 キラー T 細胞

16 細菌ウィルス寄生虫 体内 病原体 or 自己 ( 病原体のみに白血球存在する分子 ) マクロファージ樹状細胞 自然免疫 獲得免疫 T 細胞 B 細胞 病原体に対する特異的反応 ( ペプチド ) 免疫反応

17 癌ワクチン William B. Coley, MD (New York, Sloan Kettering Cancer Center, from 1893 until 1936) Coley 療法 (Coley toxins) 過去 100 例の肉腫患者を調べ 肉腫の手術の後 細菌感染を併発したものは予後が良好であることを発見 streptococcus や serratia の生菌や死菌を投与して癌免疫療法を開始 BCG(bacillus Calmette-Guerin): 初期の膀胱癌治療 BCG-CWS, ピシバニール, 丸山ワクチンなど 非特異的癌免疫療法

18 ウィリアム コーリー (William Coley) ( ) ガン免疫療法の祖 最初に投与されたのは巨大な腹部腫瘍の 16 歳の少年であった コーリーは数日おきに腫瘍に直接ワクチンを投与した 投与後 強い発熱と悪寒が襲ったが 腫瘍は徐々に縮小した 治療開始 4 ヶ月後 腫瘍は当初の 1/5 に縮小した この患者は治療 26 年後 心臓発作により死亡した

19 樹状細胞 ナイーブ CD4 + ヘルパー T 細胞 細胞傷害性 T 細胞 貪食 腫瘍細胞 腫瘍細胞 腫瘍細胞

20 TLRs の活性化 TLRs 静止状態の樹状細胞 活性化樹状細胞 IL-12 細胞傷害性 T 細胞の活性化 増殖 ナイーブ CD4 + ヘルパー T 細胞 貪食 腫瘍細胞 腫瘍細胞 抗腫瘍活性の誘導 腫瘍細胞 癌ワクチン 1. 非特異的癌免疫療法 不活性化病原微生物や部分精製物質 2. 癌抗原特異的免疫療法 癌特異ペプチド抗原

21 担当細胞 受容体 認識機構 自然免疫 Innate immunity マクロファージ樹状細胞 再構成を行わない (Toll-like receptors) 微生物間で保存された共通の分子パターン (LPS リポプロテイン ペプチドグリカンなど ) 獲得免疫 Adaptive immunity T B 細胞 ( リンパ球 ) 再構成を行う 詳細な分子構造 ( タンパク質 ペプチドなど )

22 IL-1R / TLR family IL-1a, b IL-18 IL-1R IL-18R (IL-1Rrp) TLR1 TLR3 TLR5 TLR2 TLR4 TLR7 TLR6 TLR8 TLR9 TLR11 TLR10 TLR12

23 TLR2 TLR4 は細菌表層を認識する 細菌表層構造 リポ多糖 (LPS) TLR2 リポ蛋白 ペプチドグリカン TLR4 細菌 細胞壁

24 Structure of lipopeptides derived from pathogens Bacterial lipopeptide (Pam 3 CSK 4 ) O O O O O S H N CH 2 C C H O TLR2/1 SerLysLysLysLys Mycoplasmal lipopeptide (MALP-2) O O O O S TLR2/6 H H N CH 2 C C H O GlyAsnAsnAspGlu-

25 TLR5 は鞭毛構成成分 flagellin を認識する Bacteria with Flagella Flagellin monotrichous Hook lophotrichous Flagellin amphitrichous Basal Body peritrichous Flagellum

26 TLR7, TLR9 によるウイルス核酸の認識 RNA ウイルス DNA ウイルス 細胞膜 ウイルス由来 一本鎖 RNA TLR7 ウイルス由来 DNA CpG TLR9 取り込み 食胞 インターフェロンサイトカイン

27 イミダゾキノリン (The imidazoquinolines) イミダゾキノリンは 様々な細胞から IFNa など各種サイトカインの産生を誘導する化学合成物質であり 生体への投与により抗ウイルス反応 抗腫瘍反応を誘導する N NH 2 N N N NH 2 N N O イミダゾキノリンとして 特にイミキモド (imiquimod) やその誘導体である R-848 (resiquimod) が知られている Imiquimod R-848 OH イミキモドは 免疫反応調整剤 Aldala として世界 42 カ国で ヒトパピローマウイルスの感染により発症する尖圭コンジロームの治療薬として臨床応用されている R-848 は イミキモドの約 100 倍の活性を示し 現在 性器ヘルペスへの第 Ⅲ 相試験が行われている これら免疫反応調整剤は ヒトの免疫システムに刺激を与えそれを活性化させることによりウイルス感染と戦う新しい治療法として注目されている

28 NH 2 TLR7 ligands N N N Imiquimod NH 2 NH 2 N O N N N O N O Br N N O HO O NH 2 N N R-848 OH Imidazoquinolines IFN production Anti-viral immunity Imiquimod is clinically used against genital warts. OH OH Loxoribine IFN production Th1 response NK activity Bropirimine IFN production phase 3 trial (against bladder cancer )

29 TLR ファミリーによる病原体 ( 細菌 ウィルス ) の認識 グラム陽性菌 ペプチドグリカンリポタイコ酸リポ蛋白 細菌感染 腸内細菌 フラジェリン グラム陰性菌 LPS ウイルス膜蛋白 細菌 DNA ウイルス DNA ウィルス感染 imidazoquinolines 一本鎖 RNA 二本鎖 RNA TLR2 TLR5 TLR9 TLR4 TLR7 TLR3

30 病原体の TLRs による認識からのエスケープ ある種のアデノウイルスはゲノム上の CpG 配列を減らしているー TLR9 による認識からエスケープ ある種の病原体 ( ウイルス 細菌 原虫など ) は TLR シグナル伝達をブロックする蛋白質を産生する Prophyromonas gingivalis( 歯周菌 ) や Leprospira の LPS は構造を変え TLR4 に対する応答性が低い Helicobacter pylori の Flagellin は TLR5 によって認識されない

31 One TLR recognizes structurally different ligands LPS Taxol MD-2 HSP60 G T C C G T A G C T T C CpG-DNA Hemozoine TLR4 TLR9

32 Bacterial Lipopeptide TLR family member の細胞内局在 Mycoplasmal Lipopeptide LPS Flagellin MD-2 TLR1 TLR2 TLR2 TLR6 TLR4 TLR 3 TLR5 dsrna Viral ssrna, TLR7 CpG DNA CpG TLR9

33 Toll-like receptors: ligands and signaling pathways Imidazoquinolines (anti-viral compounds) ssrna dsrna LPS lipoprotein NH flagellin CpG DNA 2 N N N TLR3 MD-2 TLR4 TLR1 or TLR6 TLR2 TLR5 TLR7 TLR9 IKK-i TBK1 TRIF TRAM TRIF IRF3 TIRAP TIRAP MyD88 MyD88 NF-kB MyD88 MyD88 MyD88 IRF7 Plasmacytoid DC specific TIR domain Type I interferons Inflammatory cytokines Type I interferons

34 自然免疫と獲得免疫の橋渡しとしての TLR 病原体に特徴的な構造 ( 細胞壁構成成分 鞭毛など ) Toll-like receptors( 病原体センサー ) 自然免疫応答 ( 炎症反応 ) 自然免疫担当細胞 サイトカイン ケモカイン 局所炎症反応 ( 白血球遊走など ) 抗菌ペプチド 抗細菌作用 インターフェロン 抗ウイルス反応 獲得免疫の活性化 ( 樹状細胞による抗原提示 ) 獲得免疫 : 病原体特異的蛋白 ( 抗原 ) に対する受容体 (T 細胞受体 抗体による病原体への特異的攻撃 )

35 細胞質内病原体認識受容体

36 細胞質内二本鎖 RNA センサー 二本鎖 RNA RIG-I CARD CARD RNA helicase 領域 1,025 a.a. Mda5 925 a.a.

37 Viral Recognition in the cytoplasm 多くの RNA ウイルス ピコルナ属 RNA ウイルス DNA virus RIG-I TBK1 IKKi CARD CARD Triphosphate ssrna dsrna IPS-1 CARD CARD CARD IKK Mda5 IKKa b long dsrna (>3kb) TBK1 IKKi? dsdna DNA sensor? IKK IKKa b IRF3 NF-kB IkBs IRF3 NF-kB IkBs Type I IFN Inflammatory cytokines Type I IFN Inflammatory cytokines

38 TLR-dependent and -independent recognition of bacterial components PGN TLR2 MyD88 NOD1 NOD2 ie-dap MDP CARD NOD LRR CARD CARD NOD LRR NF-kB

39 TLRs and NLRs LRR TLR1, 2, 4, 5, 6 TIR cytoplasm Cytoplasmic receptors NOD1 CARD NOD LRR TLR3, 7, 8, 9 NOD2 NALP1 &3 NAIP5 CARD CARD NOD LRR PYD NOD LRR BIR NOD LRR LRR TIR Endosome IPAF CARD NOD LRR

40 IL-1, IL-18 activation pathways Inflammatory Stimuli IL-1b gene IL-18 gene Pro-IL-1b Pro-IL-18 Caspase-1 Mature-IL-1b Mature-IL-18 IL-33

41 P. aeruginosa S. typhimurium Caspase-1 activation by Inflammasomes Urate crystals, silica, asbestos, amyloid-b DNA Viruses cytoplasm P2X7R Pannexin1 Phagocytosis Flagellin NAIP5 BIR IPAF PYD CARD BIR CARD BIR NOD NOD LRR ASC CARD Caspase-1 Casp1 LRR K + efflux PYD NOD PYD CARD CARD NALP3 Caspase-1 ROS Cathepsin B? LRR ASC Casp1 PYD PYD CARD CARD HIN200 ASC Caspase-1 dsdna RNA, imidazoquinolines Casp1 AIM2 Pro-IL-1b cleavage IL-1b

42 病原体センサー 細菌ウイルス真菌原虫 センサー TLRs シグナル分子反応 NF-kB MAPKs IRFs サイトカインケモカイン抗ウイルス蛋白 細菌 NLRs Caspase-1 IL-1b 及び IL-18 Flagellin: Ipaf Anthrax: Nalp1b 細菌 RNA, Uric acid: NALP3 ペプチドグリカン : Nod1, Nod2 NF-kB MAPKs IL-8 及び COX-2 ウイルス RLRs Picornavirus: MDA5 NDV, VSV, SV, Influenza, Paramyxoviruses: RIG-I IRFs NF-kB MAPKs 抗ウイルス蛋白

43 C-type lectin receptors (CLR) and their signaling pathway Pneumocystis carinii b-glucan Candida albicans a-mannan Dectin-1 Dectin-2 Mincle Malassezia Mycobacteria Trehalose dimycolate (TDM) P P Syk FcR P P Syk FcR P P Syk cytosol CARD9 CARD CC PYD Casp-L CARD BCL10 MALT1 MAPK NF-kB Proinflammatory cytokines

44 Pathogen recognition to development of acquired immunity Pathogens TLR NLR RLR LRL Ab Acquired immunity Reg T cells NK cells Helper T cells Killer T cells

45 自然免疫からみたワクチン開発

46 ワクチンアジュバントの作用 抗原を長時間局所に留まらせ 抗原刺激を持続させる ( 例 ; 水酸化アルミニウム ) 抗原を細胞内に導入し クロスプレゼンテーションを起こさせる ( 例 ; リポソーム ) 自然免疫細胞を活性化させ 共刺激因子やサイトカイン産生を促す ( 例 ; CpG-DNAなどTLRリガンド ) 獲得免疫細胞を活性化させ抗原特異的反応を助ける ( 例 ;IL-12などのサイトカイン)

47 生ワクチンと不活化ワクチン 生ワクチンと不活化ワクチンの adjuvant 作用は異なる 不活化ワクチンは 死んだ病原体がファゴサイトーシスにより取り込まれ ファゴゾーム内で TLR を活性化して樹状細胞を刺激するのに対して 生ワクチンは それ以外に細胞質内の病原体認識受容体によって認識される このことが 生ワクチンのほうがワクチン作用が強力であることを説明している

48 生ワクチンとサブユニットワクチン 生ワクチンは 病原体由来の抗原以外に免疫刺激作用のある成分を含む 免疫効果は高いが 危険性も高い 生ワクチンはウイルスを人工培養する必要がある 新興感染症にはワクチン開発に時間がかかる 現在 subunit vaccine に移行しつつある サブユニットワクチンは抗原性のある部分の純度が高く 安全性も優れているが 免疫原性が弱く 免疫の効果が弱くなる傾向にある 効果的な adjuvant の開発の必要性

49 インフルエンザウイルスの自然免疫認識機構は細胞によって異なる Influenza virus RIG-I TLR7 IPS-1 エンドゾーム TIR MyD88 線維芽細胞 マクロファージ 上皮細胞 Conventional DC(cDC) など多くの細胞細胞に感染する必要あり Plasmacytoid 樹状細胞 (pdc) 感染の必要がない Type I interferons

50 インフルエンザウイルス 不活化全粒子ワクチン スプリット HA ワクチン ( 現在日本で使用されているワクチン ) インフルエンザワクチンの種類 化学的な不活化 ウイルス表面抗原 (HA 抗原 ) の精製 インフルエンザに罹ったことがない人 感染性をなくした ウイルス RNA を除去した インフルエンザに暴露されたことがある人 自然免疫反応 mdcs RIG-I NLR pdcs TLR7 上皮細胞マクロファージ pdcs TLR7 RNA 自然免疫反応なし 自然免疫反応は必ずしも必要ではない I 型インターフェロン 炎症性サイトカイン I 型インターフェロン 免疫が成立しない 獲得免疫反応 CD8+Tcell CD4+Tcell Bcell メモリー CD4+Tcell 細胞障害活性 メモリー CD4+Tcell IFNγ の産生 Th1 タイプ抗体の産生 IFNγ の産生

51 アジュバント : 水酸化アルミゲル 臨床で最も良く用いられるアジュバント 70 年以上前から使用され 米国では最近まで唯一の承認されたアジュバントであった 局所に抗原を留め DC との接触間を長くする NLRP3 を含む Inflammasome 形成を介して caspase 1 を活性化し IL-1, IL-18 を産生させる しかしながら この経路は 獲得免疫誘導にはかかわらないと思われる 作用機序の詳細は不明 液性免疫 (Th2 反応 ) を誘導する傾向がある

52 アラムと他のアジュバントの併用 Alum プラス MPL(monophosphoryl lipid A) (GlaxoSmithKline) Alum プラス CpG DNA Alum プラス MF59( スクワレンを含むオイルエマルジョン ) Alum プラス QS21 ワクチンの回数と抗原量を下げることができる

53 lipid A (LPS 活性中心 ) とその誘導体 大腸菌由来 lipid A Monophosphoryl lipid A (RC528)

54 Monophosphoryl lipid A(MPL):TLR4 アゴニスト B 型肝炎ワクチン Fendrix( 商品名 ) でアジュバントとして使われている パピローマウイルスや性器ヘルペスに対するワクチンに添加されている マラリアや結核の予防や癌の治療ワクチンとしても臨床治験に入っている

55 フラジェリンは 唯一蛋白性リガンドである 融合蛋白 DNA ワクチン フラジェリン 抗原蛋白 DNA-encoded flaggellin+antigen

56 細菌鞭毛蛋白質フラジェリンの細胞外 細胞内受容体による認識 細菌 フラジェリン TLR5 NF-kB IPAF PYD NOD LRR Inflammasome

57 TLR9 Cytoplasmic DNA sensor

58 Innate immune sensors for dsdna Endosome dsdna Pol III dsdna MyD88 TLR9 ppp-dsrna IPS-1 RIG-I DAI? AIM2 inflammasome AIM2 ASC Caspase-1 NF-kB IRFs Type I IFN Inflammatory cytokines Cell death Pro-IL-1b Pro-IL-18 IL-1b IL-18

59 Production of interferon and cytokines in response to poly I:C intravenous inoculation with 200 ug poly I:C Blood for sera ELISA IFN-a IL-6 IL-12 ng ml IFN-a IL-6 IL-12p WT ng ml -1 ng ml -1 MDA5 -/ TRIF -/- MDA5 -/- 3 TRIF -/ (h) (h) (h) time: polyi:c post injection

60 Role of TLR3 and MDA5 in the response against poly I:C Poly I:C Poly I:C cytosol TLR3 endosome MDA5 CARD Helicase TRIF IL-12p40 IL-6 Type I Interferons

61 液性免疫と細胞性免疫誘導生ワクチンと異なり 成分ワクチンは液性免疫 (Th2 反 応 ) は誘導できるが細胞性免疫は誘導されにくい ウイ ルス 結核菌 サルモネラ クラミジア リケッチア 原虫などの細胞内寄生体に対する感染防御には細胞 性免疫 (Th1 反応 ) が必要となる 細胞性免疫を誘導できる adjuvant の開発の必要性 TLR2,TLR5 刺激は Th2 反応を誘導する TLR7, 9 刺激は Th1 反応を誘導しやすい

62 今後のワクチン開発の問題点 各 TLR 刺激剤の機能の差 ( 活性の違いや分解の違いなど ) TLR 発現細胞の差 異なる TLR 刺激剤の組み合わせ TLR 以外の病原体認識受容体の存在 Delivery system や抗原と adjuvant の結合など 投与ルートの問題 ( 皮下 筋 経口 経粘膜 ) 細胞性免疫か抗体産生か