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1 東京都品川区東品川 天王洲セントラルタワー 4F Tel: (03) Fax: (03) FLAG M Purification Kit 哺乳動物発現系用 製品番号 CELLMM2 保存温度 -20 C TECHNICAL BULLETIN ( 使用説明書 ) 製品概要エピトープタグが付いたタンパク質は そのエピトープに対して特異性の高い抗体を用いてアフィニティー精製が行えます これは組換えタンパク質やタンパク質複合体の単離に有力な技術です このような抗体を用いると その後の生化学的 免疫学的分析が容易になります FLAG エピトープシステムは 8 個のアミノ酸からなる小さな FLAG ペプチド (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C) を利用しており 融合タンパク質は元の構造や機能を維持することができます FLAG は親水性の特性を持っているので 融合タンパク質の表面に位置する可能性が高く 抗体が近づきやすくなります Sigma の FLAG M Purification Kit には CelLytic M Cell Lysis Reagent が含まれています CelLytic M Cell Lysis Reagent CelLytic M 溶解バッファーは 浮遊細胞と接着細胞の両方について高効率かつ迅速な細胞溶解とタンパク質の可溶化を実現します 接着細胞を培養皿からかき集める必要はありません 本キットにより 活性のある FLAG 融合タンパク質の迅速かつ高効率のアフィニティー精製が可能です 免疫沈降にも使用可能です アフィニティー精製は アガロースレジンに特異性の高いモノクローナル抗体を共有結合させた ANTI-FLAG M2 アフィニティーゲルを用いて行います アフィニティーレジンを用いることで 前処理やキャリブレーションをしなくても FLAG 融合タンパク質が効率よく結合します アフィニティー結合した FLAG 融合タンパク質は 酸性条件や 3X FLAG ペプチドを用いた競合により効率よくレジンから溶出できます 溶出されたタンパク質は 活性 サイズ 翻訳後修飾 相互作用などの分析を行うことができます 試薬 1 ml のアフィニティー精製カラムを用いたアフィニティー精製 3~5 回分の試薬が含まれています CelLytic M 製品番号 C ml 10 Wash Buffer 製品番号 W ml 0.5 M Tris HCl (ph 7.4), 1.5 M NaCl Elution Buffer 製品番号 E M グリシン (ph 3.5) 3X FLAG Peptide 製品番号 F4799 ANTI-FLAG M2-Agarose Affinity Gel 製品番号 A ml 4 mg 1 ml Amino-terminal FLAG-BAP Fusion 40 µg タンパク質 製品番号 P7582 ポリプロピレン製クロマトグラフィーカラム 製品番号 C 本 本製品以外にごにご用意用意いただくいただく試薬試薬およびおよび器具 試験管 Hamilton シリンジ 製品番号 Z またはパスツールピペット 製品番号 S6268 シェーカー 遠心機 マイクロ遠心機 Eppendorf 5417R または同等品 Dulbecco リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 製品番号 D8537 プロテアーゼインヒビターカクテル 製品番号 P8340 SIGMAFAST pnpp substrate tablets set 製品番号 N1891 または pnpp liquid substrate system 製品番号 N7653

2 2 注意事項と免責事項本製品は試験研究用のみを目的として販売されています 医薬品 家庭用その他試験研究以外の用途には使用できません 危険性と安全な取り扱いについては安全性データーシート (MSDS) をご覧ください 使用前の準備 溶液の解凍 - キットの溶液が全て解凍され 均一に混和されていることを確認して下さい 5 µg/µl 3X FLAG ペプチド溶液 - 3X FLAG ペプチド (N-Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys- Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys-C) は酸性です 適切に溶解させるために 4 mg の 3X FLAG ペプチドに 160 µl の 10 Wash Buffer を添加します ぺプチドが完全に溶解したら 640 µl の蒸留水をサンプルに加えます よく混和後 分注して 20 C で保存します FLAG-BAP 融合タンパク質の希釈 -コントロール反応として FLAG-BAP 融合タンパク質溶液の一部を 1 Wash Buffer で 50 ng/µl の濃度に希釈します 希釈した溶液は 20 C で約 2 カ月間安定です 保存 / 安定性本キットは保冷剤とともに配送され 20 C 保存されています 最初の解凍後は バッファーを 2 8 C で保存できます 3X FLAG ペプチド ( 製品番号 F4799) Aminoterminal FLAG-BAP fusion protein ( 製品番号 P7582) の推奨保存条件については 使用前の準備を参照して下さい CelLytic M Cell Lysis Reagent ( 製品番号 C2978) は長期保存すると濁ったように見える場合があります 製品の性能に影響はないので さらに濾過したり清澄化することなくそのままお使いいただけます 手順一般注意事項 : 1. 抗 FLAG M2 アフィニティーレジンのロット特異的な結合能については A2220 の試験成績書 (Certificate of Analysis) を参照して下さい 2. ANTI-FLAG M2 affinity resin は 50% グリセロールバッファー中で保存されています 使用直前にグリセロールを取り除き レジンを 1 Wash Buffer で平衡化する必要があります 平衡化は室温または 2 8 C で行うことができます 3. 抗 FLAG M2 アフィニティーゲルの試薬適合性の確認には 試薬適合性チャートを参照して下さい 4. 免疫沈降の手順については ウェブサイトの FLAG Immunoprecipitation Kit ( 製品番号 FLAGIPT1) の使 用説明書を参照して下さい 本キットの CelLytic M 試薬を溶解バッファーとして使用します A. 細胞溶解細胞溶解についての注意事項 : 細胞に加える CelLytic M 試薬の量は 細胞の量および必要なタンパク質濃度によって異なります 通常 : 細胞に加える CelLytic M の推奨量は 125 µl です 接着細胞の場合 培養プレートの大きさによってプレート表面を覆うバッファーの必要量が決まります 推奨使用量 : 10 cm プレートで µl です 3.5 cm プレートで µl です 通常 タンパク質分解を避けるために CelLytic M 試薬にプロテアーゼインヒビターカクテルを加えることをお勧めします ライセートの保存は低温で行う必要があります よって ライセートの長期保存には 70 C で保存して下さい 1. 細胞を洗浄し 細胞溶解バッファー処理します a. 接着細胞の場合 : アッセイ対象の細胞から培地を除去します 細胞が剥がれないよう注意しながら PBS バッファーで細胞を 1 回洗います PBS を捨てます CelLytic M 試薬を加えます b. 浮遊細胞の場合 : 適切なコニカル遠心チューブに細胞を回収します 450 g で 5 分間遠心します 上清をデカントして捨てます 細胞ペレットを PBS に再懸濁することにより細胞を 1 回洗浄し 450 g で 5 分間遠心します 上清をデカントして捨てます CelLytic M 試薬で細胞ペレットを再懸濁します 2. シェーカーで 15 分間振盪します 3. 細胞ライセートを回収します a. 接着細胞の場合 : 細胞を回収します b. 浮遊細胞の場合 : ステップ 4 に進みます 4. 溶解した細胞を 12,000 20,000 g で 10 分間遠心分離し 細胞破片を沈殿させます 5. タンパク質を含む上清を冷却したチューブに移します すぐに使用する場合は氷上に置きます すぐに使用しない場合はタンパク質溶液を凍結して保存します

3 3 B. アフィニティー精製 ( カラム ) タンパク質精製 FLAG 融合タンパク質はカラムまたはバッチ形式でアフィニティー精製できます カラムにロードするサンプル量と使用するレジン量に大きな差がない場合はカラム形式が上手くいきます それ以上の量の場合 目的タンパク質を多量の抽出物から迅速に精製するためにバッチ形式をお勧めします ライセート量が約 6 ml までで 流速制御下でのバッファーロード用の器具のない場合 最良の結果を得るには 両端を閉じたカラムを用いてバッチ形式に従って行うことができます カラムとバッファーを再平衡化して 室温で精製を行います プロテアーゼによる問題がある場合は カラムクロマトグラフィーを 2 8 C で行うか プロテアーゼインヒビターカクテルを溶出液に加えて下さい 菌体破片や粒子状物質はカラムを詰まらせるので 特にサンプルを解凍した場合は精製前に除去するようにして下さい 大量の不溶性物質を除くのには 遠心分離 (10,000 20,000 g で 15 分間 ) が必要です タンパク質抽出物は 残存する細胞や粒子を除去するために 0.45 µm フィルターで濾過することも必要です 染色体 DNA や RNA を含む粘性の高いサンプルもカラムを詰まらせます 粘性の高いサンプルは粘度を下げるために超音波処理またはヌクレアーゼ処理をする必要があります ゲルの機能を確認するために FLAG-BAP ポジティブコントロールタンパク質を使用できます レジンの調製 1. クロマトグラフィーカラムを安定な支持台に設置します 2. 空のカラムを 0.5 ml の 1 Wash Buffer ですすぎます カラムからバッファーを排水させ カラムに残った Wash Buffer はレジンを充填しやすいように そのままにしておきます 3. ゆっくりと転倒混和してレジンを完全に懸濁させます 抗 FLAG M2 アフィニティーゲルのゲルビーズが均一に懸濁していることを確認してください 必要量のレジンを取り出します 4. 懸濁液を直ちにカラムに移します 5. ゲルベッドを排水させ レジン取るのに用いたピペットを 1 Wash Buffer ですすぎます 50% グリセロール バッファーはゆっくり流れるので 平衡化中に流速が速くなります 6. すすぎ液をカラム上部に加え 再び排水させます 通常条件下では 過剰に溶液を排水してもゲルがひび割れることはありませんが ゲルベッドは乾燥させないようにして下さい 7. カラム容量の 3 倍の Elution Buffer をロードします カラムからバッファーを完全に排水します ローディング中にゲルベッドを乱さないようにして下さい カラム内にローディングバッファーを 20 分以上留まらせないようにして下さい これはカラムから残存する不純物を除去するための疑似の溶出ステップです 8. レジンの平衡化のため カラム容量の 5 倍の 1 Wash Buffer で洗浄するか 溶出液の ph が中性になるまでレジンを洗浄します ゲルベッドを乾燥させないようにしてください カラム上部に少量のバッファーを残すようにしてください バッファーに抗菌剤 ( アジ化ナトリウムなど ) を添加していない場合は カラム内に 1 Wash Buffer を長時間 (>24 時間 ) 留まらせないようにして下さい カラムクロマトグラフィー 1. 自然落下によりサンプルをカラムにロードします サンプル量が多い時は 数回に分けてロードするか カラムリザーバーを取り付けます FLAG 融合タンパク質が完全に結合していない場合には ( 特定のタンパク質やローディングの流速による ) カラムにサンプルを複数回通すことにより 結合効率が向上します 通常サンプルのローディングステップでは 融合タンパク質がアフィニティーレジンに結合するように低い流速が必要です サンプル量が 6 ml までの場合 レジンとサンプル溶液をカラム中で穏やかに回転させながらインキュベートするバッチ形式も可能です 2. カラム容量の 倍の 1 Wash Buffer でカラムを洗浄します この操作により M2 抗体に結合していないタンパク質は全て除去されます カラムから完全に排水させます 溶出次の 2 つの溶出手順から 1 つを選択して下さい 1. グリシンを用いた酸溶出による FLAG 融合タンパク質の溶出 - カラムに結合した FLAG 融合タンパク質を µl の 10 Wash Buffer または µl の 1 M Tris (ph 8) を入れたバイアル (1 ml の溶出液あたり ) に 1 ml の Elution Buffer で 6 回溶出させます カラム内に Elution Buffer を 20 分以上留まらせないよ

4 4 うにして下さい 溶出後直ちにカラムを中性 ph に再平衡化します 2. 3X FLAG ペプチドを用いた競合による FLAG 融合タンパク質の溶出 - 結合した FLAG 融合タンパク質を ng/µl の 3X FLAG ペプチド ( 製品番号 F4799) (1 Wash Buffer に溶解 ) を含む溶液をカラム容量の 5 倍用いて競合溶出させます メモ : 決められた量の Elution Buffer を順次添加 回収することにより段階的に溶出ができます 溶出ステップでレジンと Elution Buffer または 3X FLAG ペプチドを長時間インキュベートする必要がある場合は 穏やかに回転させながら行って下さい カラム内に Elution Buffer を 20 分以上留まらせないようにして下さい 溶出効率が低い場合は 3X FLAG ペプチドの濃度を高くするか または Elution Buffer に塩を加えることができます C. FLAG 融合タンパク質の抗 FLAG M2 アフィニティーゲルへのバッチ形式による吸着本法は FLAG 融合タンパク質を希釈溶液から精製する迅速で効率の良い方法です 量の多いサンプルを少量のレジンに通すという時間のかかるカラムクロマトグラフィーの操作を省けます 1. 1 Wash Buffer に平衡化したレジンを再懸濁して タンパク質抽出物を加えます 2. FLAG 融合タンパク質が結合するように穏やかに混和しながらタンパク質抽出物を抗 FLAG M2 アフィニティーゲルと 1 時間インキュベートします 混和はオーバーヘッドミキサーか振とう機で行って下さい 磁気磁気スターラーシステムは レジンビーズレジンビーズが破損破損するのでするので使用しないで下さいさい このステップは 2 8 C または室温で行えます インキュベーション時間は 30 分から数時間まで可能です インキュベーション時間が 3 時間以上の場合は 細菌の増殖および / またはタンパク質分解を抑えるためにプロテアーゼインヒビターと抗菌剤を添加する必要があります 3. 結合ステップの終了後 直ちに容器からレジンを回収します レジンは遠心分離 (1,000 g で 5 分間 ) または濾過で回収できます 4. 非特異的に結合したタンパク質を全て除くために 1 Wash Buffer でレジンを洗浄します このステップは タンパク質の溶出が終わるまでカラムに新鮮なバッファーを通すカラム形式でも行えます レジンから溶出するタンパク質は 溶出液の 280 nm の吸光度を測定することによりモニタリングできます カラムから出てきた洗浄液の吸光度が 洗浄液のブランクに対して 0.05 以下になるまでレジンの洗浄を続けます 5. FLAG 融合タンパク質は低い ph (Elution Buffer) または 3X FLAG ペプチドとの競合によりレジンから溶出されます 溶出の項にある溶出ステップに従って下さい 6. カラムのリサイクルまたは保存の項に記載されているように レジンはリサイクル 保存ができます D. カラムのリサイクルカラムは使用後すぐにカラム容量の 3 倍の Elution Buffer で洗浄することにより再生することをお勧めします カラムは溶出液の ph が中性になるまで 1 Wash Buffer ですぐに再平衡化する必要があります E. カラムの保存 50% グリセロール 0.02% アジ化ナトリウム含有の 1 Wash Buffer をカラム容量の 10 倍使用してカラムを洗浄した後 5 ml の 0.02% アジ化ナトリウム含有のグリセロールバッファーを加え 排水せずに 2 8 C または 20 C で保存します 再利用の回数は サンプル条件 プロテアーゼなどにより異なります F. アルカリホスファターゼ分析 FLAG-BAP タンパク質は抗 FLAG M2 アフィニティーゲルを用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降のコントロールになります コントロールタンパク質を用いる場合は 小さいスケールの検出をお勧めします サンプルとコントロールを SDS-PAGE ゲルで泳動します FLAG- BAP 融合タンパク質の分子量は 49.3 kda です SDS- PAGE では泳動条件により 45~55 kda のバンドとして現れます ゲルを抗 FLAG または抗バクテリア由来アルカリホスファターゼ (BAP) 抗体を用いてイムノブロットするか または染色法の 1 つを用いて ( 銀染色または Coomassie ブルー ) ゲルを染色して下さい ( オプション ) あるいは 酵素活性により BAP を検出します BAP 活性の検出には SIGMAFAST pnpp substrate tablets set ( 製品番号 N1891 または N2770) または pnpp liquid substrate system ( 製品番号 N7653) をお勧めします

5 5 試薬適合性チャート 試薬カオトロピック剤 ( 尿素 グアニジン HClなど ) 還元剤 (DTT DTE 2-メルカプトエタノールなど ) TWEEN 20 5% 以下 TRITON X-100 5% 以下 Igepal CA % 以下 CHAPS 0.1% 以下 ジギトニン 0.2% 以下 塩化ナトリウム 1.0 M 以下 ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 0.1 M グリシン HCl (ph 3.5) デオキシコレート 作用固定化された M2 抗体を変性させます M2 抗体の鎖を結ぶジスルフィド結合を還元します レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます イオンの相互作用を低下させることによって レジンへの非特異的なタンパク質結合を低下させます 固定化された M2 抗体を変性させます レジンから FLAG 融合タンパク質を溶出します FLAG 融合タンパク質への M2 の結合を阻害します コメントレジン上の M2 抗体を変性させ FLAG 融合タンパク質を結合する能力を損ねますので これらのタイプの成分を含む試薬は使用しないで下さいさい 低濃度 (1 M 以下 ) の尿素が使用できます レジン上の M2 抗体のジスルフィド結合を還元して FLAG 融合タンパク質を結合する能力を壊すので これらのタイプの成分を含む試薬は使用しないでしないで下さいさい 推奨濃度から 5% までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください 推奨濃度から 5% までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください 推奨濃度から 0.1% までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください 推奨濃度から 0.1% までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください 推奨濃度から 0.2% までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください 推奨濃度から 1.0 M までなら使用できますが それを超えるものはご使用にならないでください レジン上の M2 抗体を変性させ FLAG 融合タンパク質を結合する能力を損ねますので ローディングおよび洗浄バッファーにこの界面活性剤を含む試薬は使用使用しないでしないで下さいさい 免疫沈降時のタンパク質の溶出用としてサンプルバッファー中に含まれていますが レジンは再利用できません カラム内にグリシン HClを 20 分以上留まらせないようにして下さい インキュベーション時間が長くなると M2 抗体の変性が始まります M2 抗体の FLAG 融合タンパク質への結合を阻害するので この界面活性剤を含む試薬は使用使用しないでしないで下さいさい

6 6 関連製品 Mammalian FLAG expression kit ( 哺乳動物用 FLAG 発現キット ) 製品番号 FLMA FLMAS FLMC 哺乳動物用発現ベクター 製品番号 E7398 E8770 E1775 E3762 E2275 E2400 哺乳動物用シークエンスプライマー 製品番号 P5350 P5475 モノクローナル抗 FLAG M1 精製免疫グロブリン 製品番号 F3040 抗 FLAG M1 アガロースアフィニティーゲル 製品番号 A4596 モノクローナル抗 FLAG M2 精製免疫グロブリン 製品番号 F3165 モノクローナル抗 FLAG M2 アフィニティー精製抗体 製品番号 F1804 モノクローナル抗 FLAG M5 精製免疫グロブリン 製品番号 F4042 FLAG ペプチド 製品番号 F3290 FLAG-BAP コントロール融合タンパク質 製品番号 P7582 P7457 P5975 グリセロール 製品番号 G5516 デオキシリボヌクレアーゼ (DNase I) 製品番号 D4527 アジ化ナトリウム 製品番号 S8032 Flag Immunoprecipitation Kit (FLAG 免疫沈降キット ) 製品番号 FLAGIPT1 抗 FLAG-M2 ペルオキシダーゼ結合 製品番号 A8592 抗 FLAG-M2 アルカリホスファターゼ結合 製品番号 A9469 プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル 製品番号 P8215 P2714 P8465 P8340 P9599 P2850 P5726 p-nitrophenyl Phosphate (pnpp) liquid substrate system 製品番号 N7653 SIGMAFASTp-Nitrophenyl Phosphate tablets set 製品番号 N1891 および N2770 参考文献 1. Brizzard, B.L., et al., Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution. BioTechniques, 16, 730 (1994). 2. Knappik, A., and Pluckthun A., An improved affinity tag based on the FLAG peptide for the detection and purification of recombinant antibody fragments. BioTechniques, 17, 754 (1994). 3. Chiang, C.M., and Roeder, R.G., Expression and purification of general transcription factors by FLAG epitope-tagging and peptide elution. Pept. Res., 6, 62 (1993). 4. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M., et al., John Wiley and Sons Inc., (New York, NY: 1998), pp Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow E., and Lane D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY: 1988), pp , , FLAG 及び ANTI-FLAG Sigma-Aldrich R Biotechnology LP 及び Sigma-Aldrich Co. の登録商標です CelLytic SIGMAFAST FLAG BAP は Sigma-Aldrich R Biotechnology LP および Sigma-Aldrich Co. の登録商標です IGEPAL は Rhone-Poulenc, Inc. の登録商標です TRITON は Union Carbide Corporation の商標です TWEEN は ICI Group の登録商標です Hamilton は Hamilton Co. の登録商標です Coomassie は Imperial Chemical Industries, LTD. の登録商標です Eppendorf は Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH の登録商標です BD,CMH,KTA,MAM 06/07-1 Sigma ブランド製品は Sigma-Aldrich, Inc. を通じて販売されています Sigma-Aldrich, Inc. は同社製品がこの文書およびその他の Sigma-Aldrich 発行文書に含まれる情報に合致していることを保証します お客様の個別の用途と製品の適合性についてはお客様にてご判断ください 収載の品目 製品情報 価格などは予告なく変更される場合がございます 納品伝票または同梱の内容明細書の裏面をご覧ください

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