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1 2013 年 11 月 20 日 ( 水 ) バイオ情報解析演習 ウェブツールを活用した生物情報解析 (4) 遺伝子のクローニング設計

2 有用物質生産菌を合理的に作ろう! 設計 試作 ベンチテスト 完成 プラスミド 効率的な代謝経路を設計する 文献調査代謝パスウェイの探索代謝シミュレーション 実際に微生物に組み込む データベースから有用遺伝子を探索する遺伝子組換え技術 培養をして問題点を突き止める 培養代謝物量 フラックスのデータを解析し 問題点を突き止める

3 今日の授業のモチベーション 大腸菌でブタノールを生産したい ブタノールを生産する他の生物の遺伝子を大腸菌に組み込む そのためには 1. ブタノールを生産する生物種を探す 2. ブタノール合成経路の遺伝子を探す KEGG を用いた解析 (10/30) 相同性検索 (11/13) 3. 遺伝子をクローニングするために塩基配列を獲得する 4. 遺伝子およびその酵素の情報を収集する 5. 遺伝子を大腸菌に導入する NCBI や KEGG から獲得 (10/30) NCBI や KEGG から獲得 (10/30) アライメント解析 相同性検索 (11/6, 11/13) 2

4 遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ 1. 生物 X のゲノム DNA を抽出する 生物 X ゲノム DNA 2. ゲノム DNA から目的の遺伝子領域を PCR により増幅する PCR により目的に領域だけを増幅する 遺伝子 PCR 3. 制限酵素処理し ベクターに組み込む PCR 増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む 遺伝子 クローニング 4. 大腸菌に導入する 大腸菌 3

5 遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ 1. 生物 X のゲノム DNA を抽出する プライマーの設計 生物 X ゲノム DNA 2. ゲノム DNA から目的の遺伝子領域を PCR により増幅する PCR により目的に領域だけを増幅する 遺伝子 PCR 制限酵素サイトの選択 3. 制限酵素処理し ベクターに組み込む PCR 増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む 遺伝子 クローニング 4. 大腸菌に導入する 大腸菌 4

6 目的の遺伝子を PCR により増幅する PCR (Polymerase Chain Reaction) 目的の遺伝子の上流と下流に結合するプライマー (DNA 断片 ) を用いることで 目的の遺伝子領域のみを増幅することが可能 ゲノム 遺伝子 遺伝子 Denature 94 1 cycle 遺伝子 遺伝子 プライマー 遺伝子 Annealing 60 繰り返す 2 cycle 遺伝子遺伝子 遺伝子 遺伝子 DNAポリ メラーゼ Extension 72 遺伝子

7 プライマー プライマー 20 bp 程度の短い DNA 断片 DNA ポリメラーゼが DNA を合成する (dntp を付加する ) 開始点となる DNA ポリメラーゼ 一本鎖 DNAを鋳型に相補的な塩基配列を合成する酵素 DNA 合成の開始点が必要 から 方向にDNAを合成する プライマー無し プライマー有り DNA ポリメラーゼ 一本鎖 DNA プライマー 6

8 遺伝子を含む領域を増幅するプライマーを設計する (1) 1. データベースから遺伝子の上流と下流領域を含む塩基配列を獲得 KEGG や NCBI を使用 ATG TAA 遺伝子 2. 遺伝子の上流と下流領域にそれぞれプライマーを設計 ATG TAA 遺伝子 DNA ポリメラーゼは から 方向に DNA を合成することを考慮する 上流側のプライマー遺伝子と相補鎖の配列と結合する配列 遺伝子と同じ鎖を合成する足場となる 下流側のプライマー遺伝子と同じ鎖の配列と結合する配列 遺伝子と相補鎖を合成する足場となる ATG TAA 遺伝子

9 遺伝子を含む領域を増幅するプライマーを設計する (2) 1. 遺伝子の上流と下流領域を含む塩基配列を獲得 上流領域下流領域遺伝子 CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT ACACATTAACAATAGGCGAGTGT 2. 遺伝子の上流と下流領域にそれぞれプライマーを設計 遺伝子と相補鎖の配列と結合する配列 CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GCGAGTGT プライマー上側プライマー下側 CTAAATAG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT ACACATTAACAATAGGCGAGTGT 3. PCR によりプライマーを足場に各相補鎖が合成される 遺伝子と同じ鎖の配列と結合する配列 CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA TAGTACCAGT ACACATTAACAATAGGCGAGTGT CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TGTGTAATTG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT ACACATTAACAATAGGCGAGTGT 8

10 プライマー配列の記述方法 左側を として書く ( 塩基配列の記述方法と同じ ) プライマー上側 - CTAAATAG - プライマー下側 - TGTGAGCG 配列の向きに注意 (-CGCTCACA- ではない ) CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GCGAGTGT プライマー上側プライマー下側 CTAAATAG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT ACACATTAACAATAGGCGAGTGT 9

11 プライマーの設計指針 長さ 20 bp 前後 (18~25 bp 程度 ) 短すぎると相補鎖と結合効率が下がる 長すぎると非特異的な結合 ( 他の領域への結合 ) が生じる GC 含量 ( プライマー全長に占める GC の割合 ) 40~60% かつ GC AT の偏りがない 範囲外になると非特異的結合の増加 Tm ( 二本の DNA が解離する温度 ) 55 以上かつ二本のプライマーで同じ程度 その他 長さと GC 含量を満たしていれば 基準を満たす ゲノム上の他の領域と相同性が低い プライマーダイマー ( プライマー同士での増幅 ) が生じない 10

12 例題 (1) Synechocystis sp. PCC 6803 の sll0823 遺伝子の上流 下流それぞれ 100bp 以内に結合するプライマーを設計せよ 1. KEGG データベースで sll01823 を検索 2. 遺伝子とその上流 下流を含む配列を獲得 3. プライマー配列を考える 11

13 解説 (1) : 遺伝子の上流 下流を含む配列を取得 (1) KEGG で目的の遺伝子を検索 (2) 数字を入力することで ORF 領域に加え その上流と下流の配列を得ることが可能 例 )ORF 上流 下流 100 bp の配列が欲しい時 + upstream 100 nt + downstream 100 nt (3) NT seq をクリック 12

14 解説 (2) : 遺伝子の上流 下流を含む配列を取得 1. 遺伝子の上流 100bp と下流 100bp を探す 2. その領域からプライマーを考える 13

15 解説 (3) : プライマーの配列例 プライマー上側 CCGTAATAGGAAGGTCGAGC (20 bp, GC 55%) プライマー下側 TTTGTGCTCCACAGTGAAGG (20 bp, GC 50%) 青字 : 遺伝子領域赤字 : 設計したプライマー領域 TCTATGGAATTTTGCCGGGACCAGGAATAAAAATTATTGCCCCCGGCCCTTCCGTAATAGGAAGGTC GAGCCTTTTTTGCCCTGTTGATTTCCTCATACCATGGAAATTGTTTGCAAAATACAACGACAACTAACT GATGGCGATCGCCATTGGCAGAATTATTATTTGGATGTTGATCCCCAAACCAGCATCCTAAATTGTTTA AATCAGATCAAATGGCAACAGGATGGCAGCTTGGCCTTCCGCAAGAATTGCCGTAATGCCATCTGTG GTAGCTGCGCCGTGAGGGTGAACGATCGCCCGGTGTTGGCCTGCAAAGAAAGTATTAAAAGCTTGG GCCAGTGGTTAGCCGAAAGTAACCAGGAAAATACCGGAGTTTTCACCATCAGTCCCCTGGGGAATT TACCCGTTATTAAAGACTTGGTGGTGGATATGGAGAAATTTTTTGCCGGGTTAGATGCGGTTTATCCC TATTTGATTAATAAGCACCAAGGGGAAAAAGGAGCAGAATTTTCCCAATCCCCAGAGCAGCGGGCT GCCCTCAACGATGTGAGCAATTGTGTTCTTTGTGGAGTTTGTTATTCCGACTGCGACGCCAAAAAGA AAAACGAAAATTTTGTCGGGCCCCATGCCCTAGCCAAAGCTAACCGTTTGATTTTAGATAATCGGGAT ATGGCCACTAAGGCCCGCCTCGAAGCCCTGGGCAAAGATAAACAGGGGGTGTGGGGATGCAACAA CTGCCGCATGTGTAGTGATTCTTGCCCCACTGGGGTGGCTCCTCTGTCCCAGATTGAAGCCTTAAAA ATTCGTTTATTTGACTTGATGGATCCCCTTTAAATTCCTAAATTTAAGTTTACTTAAACCATTATTCAGA AATTAGTTCTAGGGTTTCCGCCATTGTTAAATTGCCTTCACTGTGGAGCACAAAGGGCAACCC 14

16 遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ 1. 生物 X のゲノム DNA を抽出する プライマーの設計 2. ゲノム DNA から目的の遺伝子領域を PCR により増幅する 目的に領域だけを獲得することが可能したい 増幅しないと実験で扱えない ( 扱いにくい ) 制限酵素サイトの選択 3. 制限酵素処理し ベクターに組み込む PCR 増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む 生物 X 遺伝子 遺伝子 PCR ゲノム DNA クローニング 4. 大腸菌に導入する 大腸菌 15

17 PCR 増幅した遺伝子 (DNA 断片 ) をベクターに組み込む ベクターに遺伝子を組み込む 遺伝子 遺伝子はあくまで ATGC からなる化学物質 (DNA) であるので PCR 増幅した遺伝子を他の生物に導入しても 細胞内で保持されない 目的の生物 ( 細胞 ) で複製可能なベクターに遺伝子をクローニングした後に目的の細胞に導入する ベクター : 遺伝子のクローニングなどに用いる環状 DNA ベクター 目的の遺伝子をベクターにクローニング 大腸菌 大腸菌 16

18 DNA の切り貼り 切る : 制限酵素 特定の配列を認識し 二本鎖の DNA を切断する EcoRI 認識配列 5 -CAGAATTCAT- 3 -GTCTTAAGTA- EcoRI 5 -CAG AATTCAT- 3 -GTCTTAA GTA- ある制限酵素で切断した DNA は 同じ制限酵素で切断した DNA と切断面 ( 配列 ) が相補する 貼る : DNA ligase DNA の 末端の水酸基 と 末端のリン酸基 を結合する P O O 塩基 P O 塩基 DNAligase が末端を結合 OH AATTCAT- 5 -CAG GTA- 3 -GTCTTAA DNA ligase 5 -CAGAATTCAT- 3 -GTCTTAAGTA- 相補的な配列は 水素結合により結合 17

19 様々な制限酵素 突出末端 EcoRI ( 由来 : 大腸菌 Escherichia coli) 末端 5 -GAATTC- 3 -CTTAAG- 5 -G AATTC- 3 -CTTAA G- 突出末端 KpnI ( 由来 : 肺炎桿菌 Klebsiella pneumoniae) 末端 5 -GGTACC- 3 -CCATGG- 5 -GGTAC C- 3 -C CATGG- 平滑末端 EcoRV ( 由来 : 大腸菌 Escherichia coli) 5 -GATATC- 3 -CTATAG- 5 -GAT ATC- 3 -CTA TAG- 18

20 制限酵素を用いたクローニング ベクターに遺伝子を組み込む 遺伝子 両方サンプルと 同じ制限酵素で処理することで 両者を結合することが可能 PCR 増幅した遺伝子を含む DNA 5 -GAATTC GAATTC- 3 -CTTAAG CTTAAG- 5 -AATTC G- 3 -G CTTAA- 両末端に EcoRI 認識配列があれば 制限酵素処理 (EcoRI) Ligation (DNA ligase) ベクター 5 -GAATTC- 3 -CTTAAG- 5 -G AATTC- 3 -CTTAA G- EcoRI 認識配列 5 -GAATTG GAATTC- 3 -CTTAAG CTTAAG- 19

21 制限酵素を用いたクローニングの実験計画 1. 遺伝子とベクターの配列に含まれる制限酵素サイトを検索 XbaI HindIII CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCG GAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAACCGC 2. ベクターには存在 し 遺伝子には存在 しない制限酵素サイトを選択 遺伝子配列内に存在する制限酵素を用いると 遺伝子自体が切断されてしまう 遺伝子 3. 遺伝子を増幅する際のプライマーに選択した制限酵素サイトを付加 20

22 (1) 制限酵素サイトの検索 -1 Takara Cut-Site Navigator (1) 配列を貼り付け (2) Setting Detail を クリック 21

23 (1) 制限酵素サイトの検索 -2 (3) 検索対象の制限酵素を認 識配列の長さが 6 塩基以上 のものに指定 (4) 入力配列内に含まれる制限酵素サイトの出現頻度で検索条件を設定例 ) Not Zero 1 回以上出現する制限酵素を検索 (5) 結果の表示形式それぞれ試してみる (6) Submit で実行 22

24 (1) 制限酵素サイトの検索 -3 検索結果 (Enzyme list) Enzyme Name : 制限酵素の名前 Frequency : 配列内に存在する数 Cutting position : 配列内の存在位置 Recognition Sequence : 認識配列 検索結果 (Sequence) 入力した配列 ここに PvuI 認識配列が存在することを意味する 23

25 (2) クローニングに用いる制限酵素サイトの選択 ベクターと 遺伝子 DNA 断片の両末端を同じ制限酵素で処理し DNA ligase により結合することでクローニングする すべて同じ制限酵素で処理したい Ligation (DNA ligase) 遺伝子 ベクターには存在し 遺伝子には存在しない制限酵素サイトを抽出 遺伝子配列内に存在する制限酵素サイトを用いると 遺伝子自体が切断される ベクター : 切断したい 遺伝子 : 遺伝子の内部では切断したくない全長をクローニングしないとそのタンパク質が機能しない 遺伝子 24

26 (3) 遺伝子 DNA 断片に制限酵素サイトを付加する PCR のプライマーに 制限酵素サイトを付加したプライマーを用いる 目的の領域を増やすだけの場合 遺伝子 プライマー 制限酵素サイトを付加する場合 プライマーの 側に制限酵素サイトを付加する 制限酵素サイト PCR:1 cycle 2 cycle PCR の過程でプライマーに含めた制限酵素サイトに対しても相補鎖が合成される 遺伝子 制限酵素サイトは ゲノム配列と 相補する配列ではないので結合しないが 先に設計したプライマーである 側は相補する配列であるので結合する 25

27 例題 puc19 というベクターに Synechocystis sp. PCC 6803 の sll0823 遺伝子をクローニングするためのプライマーを設計せよ 遺伝子は puc19 のマルチクローニングサイト (MCS) にクローニングすること MCS に含まれる 6 塩基以上からなる制限酵素サイトを使用すること 制限酵素サイト MCS EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII MCS とはクローニングを容易に行うため 複数の制限酵素サイトが配置された領域 26

28 解説 (1) 1. プライマーを設計 ( 解説済み ) 2. sll0823をpcr 増幅した断片に含まれる制限酵素サイトをTakara Cut-Site Navigatorで検索する 解析には プライマーで挟まれた配列 ( プライマー領域を含む ) を用いる ( 下線部 ) 青字 :ORF 赤字 : 設計したプライマー領域 TCTATGGAATTTTGCCGGGACCAGGAATAAAAATTATTGCCCCCGGCCCTTCCGTAATAGGAAGGTCGAGCCTTTT TTGCCCTGTTGATTTCCTCATACCATGGAAATTGTTTGCAAAATACAACGACAACTAACTGATGGCGATCGCCATTG GCAGAATTATTATTTGGATGTTGATCCCCAAACCAGCATCCTAAATTGTTTAAATCAGATCAAATGGCAACAGGATG GCAGCTTGGCCTTCCGCAAGAATTGCCGTAATGCCATCTGTGGTAGCTGCGCCGTGAGGGTGAACGATCGCCCGG TGTTGGCCTGCAAAGAAAGTATTAAAAGCTTGGGCCAGTGGTTAGCCGAAAGTAACCAGGAAAATACCGGAGTT TTCACCATCAGTCCCCTGGGGAATTTACCCGTTATTAAAGACTTGGTGGTGGATATGGAGAAATTTTTTGCCGGGT TAGATGCGGTTTATCCCTATTTGATTAATAAGCACCAAGGGGAAAAAGGAGCAGAATTTTCCCAATCCCCAGAGCA GCGGGCTGCCCTCAACGATGTGAGCAATTGTGTTCTTTGTGGAGTTTGTTATTCCGACTGCGACGCCAAAAAGAA AAACGAAAATTTTGTCGGGCCCCATGCCCTAGCCAAAGCTAACCGTTTGATTTTAGATAATCGGGATATGGCCACT AAGGCCCGCCTCGAAGCCCTGGGCAAAGATAAACAGGGGGTGTGGGGATGCAACAACTGCCGCATGTGTAGTG ATTCTTGCCCCACTGGGGTGGCTCCTCTGTCCCAGATTGAAGCCTTAAAAATTCGTTTATTTGACTTGATGGATCCC CTTTAAATTCCTAAATTTAAGTTTACTTAAACCATTATTCAGAAATTAGTTCTAGGGTTTCCGCCATTGTTAAATTGCC TTCACTGTGGAGCACAAAGGGCAACCC 27

29 解説 (2) 制限酵素サイトの検索結果 MCS に含まれる制限酵素サイト EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, HindIII sll01823 と MCS の両方に含まれる制限酵素サイト BamHI, HindIII クローニングには EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, XbaI, SalI, PstI, SphI の制限酵素を選択すればよい 28

30 解説 (3) 最初に設計した 遺伝子領域を増幅するためのプライマー プライマー上側 CCGTAATAGGAAGGTCGAGC (20 bp, GC 55%) プライマー下側 TTTGTGCTCCACAGTGAAGG (20 bp, GC 50%) EcoRI でクローニングする場合 認識配列を付加 (GAATTC) をプライマーの 側に付加する プライマー上側 GAATTCCCGTAATAGGAAGGTCGAGC プライマー下側 GAATTCTTTGTGCTCCACAGTGAAGG 制限酵素サイトの付加による GC 含有量の変化は考慮しなくて良い 鋳型 (DNA) に結合する領域だけについて考えれば良い 29

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