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いおりおとじま
5 years ago
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1 エピジェノミクス解析編 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 株式会社キアゲンアプライドアドバンストゲノミクス宮本真理, PhD 1

2 アジェンダ ChIP-seq 解析 Transcription Factor ChIP-seq Histone ChIP-seq Bisulfite-seq 解析 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 2

3 NGS Applications ゲノミクス Genome assembly (Gx only) Resequence トランスクリプトミクス RNA-seq, Expression analysis Small RNA エピジェノミクス ChIP-seq Bisulfite seq 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 3

4 様々なプラグインによるエピジェノミクス強化 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 4

5 ChIP-seq 101 サンプル準備 Mardis, E. R., & Mardis, E. R. (2007). ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods, 4(8), 613. doi: /nmeth /08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 5

ChIP-seq Basic method Park, P., ChIP--seq: advantages and challenges of a maturing technology Nature Reviews Genetics, 2009, 10, 669-680 Pepke, S.; Wold, B.

6 ChIP-seq Basic method Park, P., ChIP--seq: advantages and challenges of a maturing technology Nature Reviews Genetics, 2009, 10, Pepke, S.; Wold, B. & Mortazavi, A., Computation for ChIP-seq and RNA-seq studies Nature methods, 2009, 6, S22-S /08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 6

7 Transcription Factor ChIP-seq ChIP インポート Control インポートクオリティチェッククオリティチェックマッピングマッピングピークコールアノテーション 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 7

8 Transcription Factor ChIP-seq 解析フローインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーション 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 8

ゲノムやアノテーション情報もインターフェースからインポート 2016/08/10 Filgen

9 ChIP-seq 解析パイプラインインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーションシーケンサーごとのインポーターゲノムやアノテーション情報もインターフェースからインポート 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 9

10 ChIP-seq 解析パイプラインインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーション様々なクオリティレポートクオリティでのトリミングやアダプターのトリミングが可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 10

11 ChIP-seq 解析パイプラインインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーションリードの Forward Reverse のカバレッジ分布非常に軽いブラウザマッピングのカバレッジに関するレポート 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 11

12 ChIP-seq 解析パイプラインインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーションピークの山の表示テーブルにはピークの位置情報や長さ p-value などテーブルに含まれる情報はフィルタリングに利用可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 12

13 ChIP-seq ピークコール詳細 Quality check and create report Peak Shape Filter 作成 Peak Shape Score 計算 p-value 計算ピークコール 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 13

ChIP-seq クオリティチェック (Enrichment check) Cross-correlation ( 相互相関関数 ):2 つのベクトルの類似度を計算するもの ChIP-seq では免疫沈降による濃縮がうまく行われていれば (-) 鎖側にマップされるリードを k 塩基シフトさせたときある k においてピークが見られると考えられそれを濃縮のクオリティの目安とする Landt, S.

14 ChIP-seq クオリティチェック (Enrichment check) Cross-correlation ( 相互相関関数 ):2 つのベクトルの類似度を計算するもの ChIP-seq では免疫沈降による濃縮がうまく行われていれば (-) 鎖側にマップされるリードを k 塩基シフトさせたときある k においてピークが見られると考えられそれを濃縮のクオリティの目安とする Landt, S. G., Marinov, G. K., Kundaje, A., & Frazer, K. A. (2012). ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modencode consortia the genome, doi: /gr /08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 14

15 ChIP-seq クオリティチェック (Enrichment check) Cross-correlation で見た濃縮がうまく行っている例うまく行ってない例 Landt, S. G., Marinov, G. K., Kundaje, A., & Frazer, K. A. (2012). ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modencode consortia the genome, doi: /gr /08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 15

16 アルゴリズム詳説と比較アルゴリズム比較のホワイトペーパー Three data sets are used for validation, MAX, NRSF and SRF. CisGenome, HOMER and MACS are used for comparison. 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 16

17 ChIP-seq 解析パイプラインインポート QC トリミングマッピングピークコールピーク近傍のアノテーションピーク領域のアノテーションピークの 5 末側 3 末側に一番近い遺伝子の名前とその距離をテーブルに付加距離の情報でフィルタリングすることでたとえば 3 末端側上流 1000bp に遺伝子を持つピークといった選択が可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 17

18 実行方法ウィザードから各ステップごとの実行 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 18

19 Transcription Factor ChIP-seq 実行方法 Transcription Factor ChIP-Seq を選択 Mapping 結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 19

20 Transcription Factor ChIP-seq 実行方法 Control data がある場合 Control を選択なくても実行できる Control data もマッピング済である必要がある Peak Shape Filter との乖離を示す Peak Shape Score の p-value の閾値を設定検定の p-value のようなものアウトプットを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 20

21 Transcription Factor ChIP-seq 結果 QC Report Peak shape filter 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 21

22 Transcription Factor ChIP-seq 結果 Peaks にピークの詳細情報が出ている表示をテーブルビューに切り替えている 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 22

23 Transcription Factor ChIP-seq 結果 Peaks と Peak shape score はトラックリストに組み込んで利用できる 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 23

24 実行方法解析パイプラインを作成し実行 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 24

25 遺伝子名のアノテーション付け Annotate with Nearby Gene Information を選択 Peaks のデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 25

26 遺伝子名のアノテーション付けアノテーションを付けたい遺伝子のトラックを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 26

27 遺伝子名のアノテーション付け結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 27

28 Advanced Peak Shape tools Learn Peak Shape Filter Learn Peak Shape Filter を選択マッピングデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 28

29 Advanced Peak Shape tools Positive, Negative の領域を選択 Peak Shape Filter 作成に使う Bin の数やサイズも指定可能 Bin の数を大きくし過ぎると Filter がスムーズな形状にならない場合があるので注意が必要データ保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 29

30 Advanced Peak Shape tools 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 30

31 Advanced Peak Shape tools Apply Peak Shape Filter Apply Peak Shape Filter を選択 Mapping データを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 31

32 Advanced Peak Shape tools 作成した Peak Shape Filter を選択ピークコールの p-value の閾値を指定アウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 32

33 Advanced Peak Shape tools 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 33

34 Histone ChIP-seq Histone ChIP インポート Control インポートクオリティチェッククオリティチェックマッピングマッピング Histone ピークコール Histone のピークは Transcription Factor に比べてなだらかで広い領域のピークとなります基本的なアルゴリズムは同じですが Histone ピークを想定した調整がされています Gene のアノテーションが付いているものを対象としているため事前にアノテーションを準備ください 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 34

35 Histone ChIP-seq Histone ChIP-seq を選択マッピングデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 35

36 Histone ChIP-seq Gene のアノテーショントラックを選択コントロールがあればコントロールのマッピングを選択アウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 36

37 Histone ChIP-seq 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 37

38 Bisulfite seq Bisulfite インポート Control インポートクオリティチェッククオリティチェック Bisulfite マッピング Bisulfite マッピングメチレーションレベル計算統計検定 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 38

39 Bisulfite Mapping Read データを選択 Map Bisulfite Reads to Reference を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 39

40 Bisulfite Mapping 選択したデータが選ばれていることを確認 Reference を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 40

41 Bisulfite Mapping Mapping のパラメータアウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 41

42 Bisulfite Mapping 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 42

43 Bisulfite Mapping コントロールのデータがある場合同様に Bisulfite Mapping を行っておく 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 43

44 Call Methylation Level Call Methylation Levels を選択マッピング結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 44

検出したいメチレーションのタイプや指定する領域を選択 (RRBS の場合ここで指定 ) マッピング結果を選択

45 Call Methylation Level Read Filter:Non-specific や Duplicate を取り除いたりリードの末端部分を塩基数を指定して無視するような設定を行う Methylation detection: 検出したいメチレーションのタイプや指定する領域を選択 (RRBS の場合ここで指定 ) マッピング結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 45

46 Call Methylation Level 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 46

47 ご清聴ありがとうございました Question? 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 47

ChIP-seq

ChIP-seq 1 ChIP-seq 解析原理 ChIP サンプルのフラグメントではタンパク質結合部位付近にそれぞれ Forward と Reverse のリードがマップされることが予想される ChIP のサンプルでは Forward と Reverse のリードを 3 側へシフトさせ ChIP のピークを算出するコントロールサンプルでは ChIP のサンプルとは異なり特定の場所に多くマップされないため