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1 応用微生物学 ( 第 2 回 ) アルコール

2 微生物による物質生産のための Driving Force 1. ガス状分子の放出 2. 不可逆的反応あるいはポリマー化反応の存在 3.Futile cycle による ATP の消費あるいは ATP シンターゼの破壊 (ATP 生成が関与している場合 ) 4. 外部 sink への電子授受 5. 相分離による生産物除去 Appl. Environ. Microbiol., 77(9) (2011)

3 講義内容 1. 生産菌とアルコールの種類 2. 具体例 (2-1) エタノール (2-2) イソプロパノール (2-3) ブタノール 3. トピックス

4 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii

5 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii 微生物の世界

6 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum 分裂型酵母 上下は分裂痕 微生物の世界

7 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum Kluyveromyces thermotolerans 微生物の世界

8 エタノールブタノール酵母バクテリア Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii 微生物の世界

9 エタノールブタノール酵母バクテリア Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii 微生物の世界

10 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum Clostridium tetani( 破傷風菌 ) 微生物の世界

11 エタノール酵母 Saccharomyces cerevisiae Schizosacchromyces pombe Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus バクテリア Zymomonas mobilis Zymobacter palmae Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 ) Clostridium thermocellum Clostridium ljungdahlii イソプロパノール酵母 Candida utilis バクテリア Clostridium beijerinckii ブタノールバクテリア Clostridium acetobutylicum Candida albicans( 出芽と仮性菌糸 ) 微生物の世界

12 講義内容 1. 生産菌とアルコールの種類 2. 具体例 (2-1) エタノール (2-2) イソプロパノール (2-3) ブタノール 3. トピックス

13 アミロ法 デンプンを原料とするアルコール製造法で デンプンの糖化とアルコール発酵の両方の性質を持つケカビ属 (Mucor) ないしクモノスカビ属 (Rhizopus) アミロ菌 を使うことが特徴である アミロ菌は高温性で糖化力が強く また嫌気的状態ではアルコール発酵を行う性質を有している しかしながら 実際の発酵力は弱いため アルコール酵母を用いている ( 微生物学辞典 一部改変 ) Mucor 属 Rhizopus 属 2%AB%E3%83%93

14 鳥取大学簗瀬先生ら

15 KEGG

16 ATP 消費 ATP 消費 NADH 生成 ATP 生成 NADH 消費 NADH 消費

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19 Trichoderma reesei 由来エンドグルカナーゼ セロビオハイドロラーゼ Aspegillus aculeatus 由来 β- グルコシダーゼを同一の酵母で発現させている

20 講義内容 1. 生産菌とアルコールの種類 2. 具体例 (2-1) エタノール (2-2) イソプロパノール (2-3) ブタノール 3. トピックス

21 アセチル CoA から IPA に至る 4 工程の反応を触媒する各酵素, チオラーゼ (atob),coa トランスフェラーゼ (atoda), アセト酢酸デカルボキシラーゼ (adc),ipa デヒドロゲナーゼ (idh) の各遺伝子を野生型大腸菌 B 株に組み込み, 大腸菌による IPA 生産に成功した しかし蓄積濃度は 5.0 g/l と低いものであった グルコースからホスホエノールピルビン酸 オキサロ酢酸 リンゴ酸 ピルビン酸 アセチル CoA を経由して IPA に至るルート ( リンゴ酸合成酵素 maeb がキーとなることから maeb ルートと呼ぶ ) を検証 リンゴ酸 ピルビン酸の反応を触媒するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (maeb) 活性を増強すると同時に,IPA 生成に必要な NADPH を補充するため,NADH NADPH の反応を触媒するトランスヒドロゲナーゼ (pnt) 活性を増強した. その結果,IPA 生産性は 48 時間培養で 113 g/l に達した

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23 講義内容 1. 生産菌とアルコールの種類 2. 具体例 (2-1) エタノール (2-2) イソプロパノール (2-3) ブタノール 3. トピックス

24 図 1. アセトン ブタノール菌の代謝経路図. 1 ピルビン酸 - フェレドキシンオキシドレダクターゼ,2NADH- フェレドキシンレダクターゼ,3 フェレドキシ -NAD レダクターゼ,4 ヒドロゲナーゼ,5 チオラーゼ,63- ヒドロキシブチリル -CoA デヒドロゲナーゼ,7 クロトニル CoA ヒドラターゼ,8 ブチリル CoA デヒドロゲナーゼ,9 ホスホトランスアセチラーゼ, 10 酢酸キナーゼ,11 ホスホトランスブチリラーゼ,12 酪酸キナーゼ,13CoA トランスフェラーゼ,14 アセト酢酸デカルボキシラーゼ, 15 アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ,16 エタノールデヒドロゲナーゼ,17 ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ,18 ブタノールデヒドロゲナーゼ. 生物工学第 89 巻

25 アセトン ブタノール発酵 酸生成期 ( 水素が発生する ) ソルベント生成期 ( 水素発生量は酸生成期に比べ減少する ) 何故だろう?

26 最大で 30 g/l 生産 生物工学会誌 2011

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32 逆回転 β 酸化経路による物質生産 Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase fadb Thiolase yqef, fada, atob Enoyl-CoA reductase ydio Enoyl-CoA hydratase fadb Nature 476: (2011)

33 リアクターを用いてのブタノール生産 14 g/l, 0.33 g/g-glucose consumed, 2 g Butanol/g-cell dry weight/h 消費グルコース当たりのモル収率 :84.5% 73.4 mmol Acetyl-CoA/g-cell dry weight/h (12-18h)

34 Non-fermentative pathways for synthesis of branched-higher alcohols as biofuels: Nature 451, 86 (2008) C4 C5 のアルコールはガソリンと同程度のエネルギー密度 吸湿性はない エタノールより揮発性が低い C4 C5 のアルコール生産を目指した

35 開発技術の全体像と特徴 特徴 1: ケト酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼの広い基質特異性を利用 特徴 2: アミノ酸生合成系を利用

36 新たな経路の構築の可能性 グルコース解糖系 2 X ホスホエノールピルビン酸 炭酸固定 2 X オキザロ酢酸 2 X リンゴ酸 2 X フマル酸 2 X コハク酸 2 X スクシニル-CoA 2 X コハク酸セミアルデヒド 2 X 4- ヒドロキシブチリル -CoA 2 X クロトニル -CoA 2 X ブチリル -CoA 2 X ブチリルアルデヒド 2 X ブタノール 1 分子のグルコースと 2 分子の炭酸ガスから 2 分子のブタノールを生成 但し 2 分子の ATP 4 分子の NADPH 8 分子の NADH が必要 2 X 4- ヒドロキシ酪酸

37 講義内容 1. 生産菌とアルコールの種類 2. 具体例 (2-1) エタノール (2-2) イソプロパノール (2-3) ブタノール 3. トピックス

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