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1 福井大学新技術説明会 JST ホール 28/8/22 がん特異的酢酸代謝を 標的としたがんバイオマーカー 診断法 治療法 吉井幸恵藤林靖久古川高子清野泰森哲也吉井裕 福井大学 高エネルギー医学研究センター 助教福井大学 高エネルギー医学研究センター 教授福井大学 高エネルギー医学研究センター 客員教授福井大学 高エネルギー医学研究センター 准教授福井大学 高エネルギー医学研究センター 助教福井大学 医学部医学科生命物質科学 准教授

2 研究背景 [ 18 F]FDG-PET * ワールブルグ効果 (Warburg effect) 癌細胞は 有酸素条件下であっても 酸化的リン酸化活性が低く 解糖系が亢進している 解糖系 Glucose 2ATP Bar-Shalom et al. 23 * 18 F 標識 2-fluoro-2- deoxyglucose(fdg) 陽電子断層撮影 (PET) TCA cycle 電子伝達系 糖代謝の亢進は がん細胞のよいバイオマーカーになってきた

3 従来技術とその問題点 [ 18 F]FDG-PET 糖代謝を指標としたがん細胞の鑑別の問題点 糖代謝の活発な正常細胞や 炎症細胞と見分けがつかない 一部の組織のがんでは鑑別が 困難である Bar-Shalom et al. 23 癌特異的代謝に関する知見を得て 新たな対癌戦略を見出す

4 Amount of acetate released to media (μmol/1 4 cells) 癌における低酸素 : 腫瘍中に見られ癌の悪性化に関わるとされる がん特異的酢酸産生 1.3 * Oxygen LLC 肺癌 1.9 B16 悪性黒色腫 1.7 Colon 大腸癌 Tumor cell 1.6 C127I 乳癌 培養培地中の代謝物の解析 3T3 線維芽細胞 * P <.2 *P <.1 (vs 3T3) Normal cell がん細胞において酢酸産生がみられ 低酸素下で増進していた

5 Relative Quantification of target mrna to Actb Oxygen 細胞質性 acetyl-coenzyme A (CoA) synthetase 2 (Acss2) Acot Aldh LLC 遺伝子発現解析 * 2. * 3.3 * 2.6 B16 Colon C127I 3T3 Tumor cell Normal cell Acss2 の発現は酢酸産生とほぼ一致していた qrt-pcr *P <.2 P <.1 *P <.1 (vs 3T3)

6 Acss2 ノックダウン癌細胞株作成 MISSION shrna lentiviral particle (Sigma) Cell chromosome shrnas sirnas targeting for Acss2 Viral integration RNAi(RNA 干渉 ) Acss2 knock down RISC Acss2 mrna degradation RISC: RNA induced silencing complex shrna transduction puromycin selection Stable shrnaexpressing cells Acetate uptake study Control RNAi: Non-targeting shrna

7 ATP Acetyl CoA Acss2 Acetate RNAi による Acss2 ノックダウン Acss2 expression (%) Acss2 expression (%) * * Acetate production (%) Acetate production (%) 1 LLC B16 Oxygen + - Acss2のノックダウン株において酢酸産生が減少した 5 Oxygen * * * RNAi Control RNAi Acss2 RNAi *P <.1 P <.5 *P <.1 Colon C127I についても同様の結果が得られた

8 RNAi による Acss2 ノックダウン 2 ATP Acetyl CoA Acss2 Acetate Relative fold change in cellular ATP level Relative fold change in cellular ATP level 1.5 LLC Oxygen Colon * * B16 C127I Oxygen + - Oxygen + - Oxygen + - Acss2のノックダウン株においてATPレベルが減少した Control RNAi Acss2 RNAi *P <.1 P <.1

9 通常酸素条件下 癌特異的な酢酸産生過程 乳酸発酵 ( 嫌気的解糖 ) Lactate NAD NADH Glucose Pyruvate 2ATP Acetate ATP Acss2 Acetyl-CoA Acetyl-CoA O 2 H 2 O TCA cycle 電子伝達系 ミトコンドリア

10 癌特異的な酢酸産生過程 低酸素条件下 ATP 産生 Acetyl-CoA の消費 乳酸発酵 ( 嫌気的解糖 ) Lactate NAD NADH Glucose Pyruvate 2ATP Acss2 Acetate ATP Acetyl-CoA Acetyl-CoA O 2 H 2 O TCA cycle 電子伝達系 ミトコンドリア

11 Acss2 RNAi のがん低酸素生存抑制効果 Number of living cells (%) Medium change LLC 1 5 Colon 1 Hypoxia B C127I 蛍光顕微鏡による観察 Control RNAi Acss2 RNAi 5 * Days after hypoxic treatment Acss2 のノックダウン株において 低酸素下での生存が低下した 5

12 細胞生死判定 LLC B16 Control-RNAi Light Living Control-RNAi Living Light Dead Overlay Dead Overlay 2μm 2μm Acss2-RNAi Acss2-RNAi Light Living Light Living Dead Overlay Dead Overlay 2μm 2μm Two-colour fluorescence cell viability assay (Active Motif): Living, stained by calcein AM; Dead, stained by EthD-1 Control RNAi細胞は生存しているが Acss2 RNAi細胞は死んでいる

13 細胞生死判定 Colon C127I Control-RNAi Light Living Control-RNAi Light Living Dead Overlay Dead Overlay 2μm 2μm Acss2-RNAi Acss2-RNAi Light Living Light Living Dead Overlay Dead Overlay 2μm 2μm Two-colour fluorescence cell viability assay (Active Motif): Living, stained by calcein AM; Dead, stained by EthD-1 Acss2は癌細胞の低酸素下での生存において重要な役割を果たす

14 LLC Acss2 RNAi の腫瘍抑制効果 2 1 B16 4 * * 2 Control RNAi Tumor volume (mm 3 ) Colon * C127I Acss2 RNAi Days after injection Acss2 ノックダウン細胞株では 腫瘍増殖が遅い

15 新技術の特徴 我々の研究から Acss2 が関与する新規がん特異的 酢酸代謝経路が発見され 癌生存において重要な役割 をもつことが明らかとなった 本発明では 新規がん特異的代謝経路を標的とし たがんバイオマーカー 診断法 及び治療法について提案する これは 従来技術とは異なるメカニズムを用いてい るため 新しい癌バイオマーカーとなる

16 想定される用途 代謝産物としての酢酸をバイオマーカーとするがん細胞あるいは低酸素がん細胞のスクリーニング法 判定法 Acss2をバイオマーカーとするがん細胞あるいは低酸素がん細胞のスクリーニング法 判定法 腫瘍発現 Acss2を標的とした遺伝子治療法並びに他の治療法との併用による遺伝子治療法

17 想定される業界 医薬系研究機関 医療機関 製薬メーカー他 実用化に向けた課題 様々ながん種での検討 遺伝子治療薬としての Acss2 標的 sirna の検討

18 企業への期待 がん研究試薬 がん診断 治療薬剤を開発中の企業 がん医療分野への展開を考えている企業には 本技術の導入が有効と思われる

19 本技術に関する知的財産権 発明の名称 : 癌特異的酢酸代謝を標的とした癌 バイオマーカー 検査方法 治療剤 出願番号 : 特願 出願人 : 福井大学 発明者 : 吉井幸恵, 藤林康久, 古川高子, 清野泰, 森哲也, 吉井裕

20 お問い合わせ先 1 吉井幸恵 福井大学 高エネルギー医学研究センター TEL FAX yukiey@u-fukui.ac.jp

21 お問い合わせ先 2 福井大学 産学官連携本部 コーディネーター 吉田芳元 TEL FAX yoshida@ccrws1.ccr.fukui-u.ac.jp

22 ご静聴ありがとうございました