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1 はじめてでも出来る キット内容 Agilent RNA6000 ナノキット RNA ナノ用ラボチップ 25 枚 電極洗浄用チップ 2 枚 シリンジ (1) Safe-Lock Eppendorf Tubes PCR clean (DNase/RNase free) (30) RNA6000 ナノ用試薬 (4 保存 ) Gel (1.2ml x 2vials) Dye (35μl x 1 vial) Marker( 内部標準 )(1.2ml x 2 vials) Ladder( 分子量標準ラダ )(35μl x 1vial) (-20, 熱変性後は -80 ) スピンフィルタ (4) ご用意いただくもの RNA サンプル及びラダ調製 分注には下記チューブを推奨します Safe-Lock Eppendorf Tubes PCR clean 0.5ml (DNase/RNase free) Eppendorf 社型番 または DNA LoBind チューブ 0.5 ml PCR clean Eppendorf 社型番 遠心機 1500 xg 及び x g(rpm 表示のみの場合 適宜計算してください ) 室温で使用 ヒートブロックまたはウォーターバス (70 ) サンプル保冷用アイスボックス RNase-ZAP (Ambion) * 他社製類似品の使用は推奨いたしません Nuclease-free water 2016 年 8 月作成 ver バイオアナライザ簡単マニュアル ご注意 ) 本マニュアルに記載した内容は予告なしに変更することがあります 最新版は巻末のサポートページからダウンロードしてください RIN(RNA Integrity Number) は 2100 Expert ver 以上でご覧いただけます それ以前のソフトウェアで取得したデータを別 PC で解析することが可能です 本資料掲載の製品は全て研究用です その他の用途にご利用いただくことはできません -1-

2 準備に入る前に 試薬キットの箱は室温 (23-25 前後 ) で 30 分以上放置してから 使用します チップ調製は室温 (23-25 前後 ) で行ってください * 保存条件 (4 ) で Dye は凝固しています 完全に融解させたのち ボルテックスミキサーでよく撹拌し均一にしましょう *1 時間以上使用しない場合 試薬は 4 保管に戻してください バイオアナライザと PC の電源をいれ 2100 Expert を立上げ本体と PC が接続されていることを確認してください ソフトウェアが装置を認識しています ソフトウェアが装置を認識していません 手順 電極を洗浄しますサンプルとラダを調製します Gelを調製します Gel-Dye Mix を調製しますチップ調製スタンドを準備しますチップにGel-Dye Mixを注入しますチップにマーカーを入れますチップにラダを入れますチップにサンプルを入れますマーカーとサンプルを混ぜますバイオアナライザで分析します電極を洗浄します -2- COM Port セッティング接続ケーブル電源ケーブル本体スイッチをチェックしてください は 場合によっては省略できます

3 フローチャート 1 10 電極を洗浄します 1 日の分析の最初に行ってください 電極クリーナーチップ 1 枚に RNase-ZAP * を 350μl 入れます ( どのウェルから入れても構いません ) RNase-ZAP * 350μl 電極クリーナーチップで電極を洗浄します (RNase-ZAP) 電極クリーナーチップ RNase に汚染されたり 汚れのひどい電極を洗浄する方法については別冊の簡易取扱い説明書を参考にしてください 電極クリーナーチップを軽く揺らしてチップの全てのウェルに RNase-ZAP 及び Nuclease-free water が満たされるようにします 蓋を閉めた時にスクリーンの装置のアイコンがチップに変わることをご確認ください 電極クリーナーをバイオアナライザ にセットし蓋を閉めます 1 分後チップを取り出します 電極クリーナーチップで電極を洗浄します (Nuclease-free water) *RNase-ZAP は米国 Ambion 社の登録商標です 他社製類似品の使用は推奨いたしません 続いてもう 1 枚のクリーナーチップに Nuclease-free water を 350μl 入れます ( どのウェルから入れても構いません ) Nucleasefree water 350μl 洗浄が終わったら電極クリーナーに入れた RNase-ZAP 及び Nuclease-free water はピペットで吸い出しておきましょう 電極クリーナーチップ 電極クリーナーをバイオアナライザ にセットし蓋を閉めます 10 秒後チップを取り出し 10 秒間蓋を開けて電極を乾燥させます -3-

4 フローチャート 2 サンプルとラダを調製します RNA 低吸着のチューブの使用を推奨します ( ご用意いただくもの 参照 ) 必ず手袋をしましょう サンプルの総量を調製します総量の目安定量範囲 total RNA ng/μl mrna ng/μl 濃度の濃いサンプルは Nuclease-free water 等で希釈します 濃度が非常に濃いサンプルはよい分析結果が得られないことがあります サンプルを熱処理します 70 2 分間 氷上で急冷 5 分間 * 氷上に保存しておいたサンプルは処理した当日中に使用しましょう ラダ * を熱処理します * ラダは別途ご購入いただけます キットに含まれているラダ ( 冷凍保存品 ) を融解して均一にし熱処理を行い その後分注して -80 で保存します ラダの熱処理が不十分な場合バンドがブロードになったりピークが 2 つに分かれることがあります RNA 6000 ナノラダ (35μl) ( 黄色のキャップのチューブ ) * 容器が過熱装置に合わない際は別チューブに移して熱処理してください 融解 RNase-free チューブ 70 2 分間処理 氷上で急冷 5 分間 分注後 -80 保存 ラダの凍結融解の繰り返しは 5 回までにしましょう 午前に融解し氷上に保存しておいたものは午後にも使用できます -4-

5 フローチャート 3 赤いキャップのチューブ Gel Gel を調製します Gel ( )550μlをスピンフィルターで遠心濾過します ( 室温 ) 550μl * スピンフィルター 遠心 1500 x g±20% 10 分 スピンフィルターは捨てます * Gel1vail にはフィルター 2 回分の容量が入っています残ったGelはそのまま4 で保存してください 遠心濾過した Gel を RNase-free の 0.5ml チューブに 65μl ずつ分注します 試薬キットの箱は室温で30 分以上放置してから使用します * 試薬の劣化をできるだけ防ぐために 30 分の室温放置後はなるべく早く実験を行い 試薬を4 保管してください * 保存条件 (4 ) でDyeは凝固しています完全に融解させたのち ボルテックスでよく攪拌し均一にしましょう * スピンフィルターはキット付属のものを使用します * 遠心分離の温度は室温で行います Gel は粘性が高いのでゆっくり吸い上げます また Gel を出す時もゆっくり行いピペットチップに Gel が残らないようにしましょう 65μl ずつ 分注せずに保存することも可能です 8 本 必ずキット添付の 0.5ml チューブを使用してください フィルター濾過した Gel は 1 ヶ月使用できます (4 保存 ) そのまま 4 保存 フィルタ遠心後のチューブ 0.5ml チューブ 使用前に 65μl 分注 -5-

6 フローチャート 4 Gel-Dye Mix を調製します 分注した Gel 65μl に Dye( )1μl を入れボルテックスでよく混合します 青いキャップのチューブ Dye 1μl ボルテックスで良く混合します 室温にて 13,000 x g で 10 分間遠心します Dye は通常 4 遮光保存します * 保存条件 (4 ) で Dye は凝固しています Dye や分注した Gel は必ず 30 分以上室温に置いた後 ボルテックスでよく撹拌し均一化しましょう 1μl Dye を加えた後 Dye バイアルは 4 へ戻してください 同日 複数枚のチップを泳動する際は一度に Gel-Dye Mix を調製し なるべく Dye バイアルを室温に放置しないようにしましょう また 調製した Gel-Dye Mix も長時間の室温放置は避けてください 調製した Gel-Dye Mix は遮光してください 遠心 13,000 x g 10 分間 遠心作業終了後は静かに取り出し振動を与えないように注意して直ちに使用してください 遮光します 調製した Gel-Dye Mix は調製当日限り有効です 余った Gel-Dye Mix は廃棄してください ( 分注したゲル 65μl で調製した Gel-Dye Mix は 1 チップ分です 残った Gel-Dye Mix は使用できません ) -6-

7 フローチャート 5 チップ調製スタンドを準備します * メタルクリップとシリンジに隙間がないようにしっかりと押し入れてください シリンジ クリップ 底面プレート * シリンジを台座に取り付ける際 時計回りの方向でゆるみがない様にしっかりまわして入れてください 底面プレートの位置を C に合わせます * プレートの位置をかえる場合 チップ調製スタンドの底面裏側にあるネジをプラスドライバーではずしてプレートを移動させた後 再びネジで固定します クリップのストッパーの位置を合わせます 上段 中段下段 ストッパー シリンジのプランジャーを 1ml の所まで引き上げておきます * 蓋の裏のシリコンガスケットにゲルやほこりなどが付着していたり亀裂が入っていると ゲルが充填できません ゲルやほこりなどを取り除いてください 亀裂が入っている場合 新しいものと交換してください シリコンガスケット プランジャー 1ml の目盛り * シリンジはキットを新しくした際 または 3 ヶ月に 1 度新品に交換してください -7-

8 フローチャート 6 チップに Gel-Dye Mix を注入します LabChip : G ウェル Gel-Dye Mix を入れる穴 : 白抜き G ウェル 一番はじめに Gel-Dye Mix を入れる穴ここからゲルを充填します : ラダウェル ラダ ( 分子量標準ラダ ) とマーカーを入れる穴 サンプルウェル サンプルとマーカーを入れる穴 ( ヶ所あります ) LabChip は室温保存します Gel-Dye Mix 9μl を ( 白抜き G) ウェルに入れます Gel-Dye Mix 9μl チップ調製スタンドの蓋を閉めます 銀色部分を強く押します Gel-Dye Mixは底の方や液表面ではなく 真ん中を吸うよう極力気をつけてください Gelは粘性が高いのでピペッティング作業はゆっくり行いましょう インバースピペッティングでアプライすることをお勧めします インバースピペッティングとは 第 1 ストップから少し押した状態で液を吸い上げ 液を出す際には第 1 ストップで止める方法です ウェルに Gel-DyeMix を入れる時はピペットチップの先をウェルの底につけるようにします ( 底につけても問題ありません ) * ウェルに大きな泡がないことを確認し 泡がある場合はピペットチップの先でつぶしましょう -8- * 正しく閉まると カチッ と音がします

9 プランジャーを押しクリップにひっかけます クリップ そのまま 30 秒放置します 30 秒はタイマーできちんとはかりましょう クリップのストッパーをはずして 5 秒待ちます ストッパーをはずす時はプランジャーに触らないでください 5 秒間 プランジャーを元の位置 (1ml) へゆっくり引き上げます 1ml の目盛り プランジャーを元の位置 (1ml) へもどさずに蓋を開けると Gel-Dye Mix が逆流し飛び散ることがあります 蓋を開けます -9-

10 チップの確認をします ゲル充填前ゲル充填後裏残りのウェル2ヶ所にGel-Dye Mix を9μlずつ入れます チップを裏返して流路が見えなくなっていたら OK 流路に泡が入っていないことも確認しましょう ( 流路の形と異なる不定形の大きな泡は無視して下さい ) 流路に泡が入っている悪い例 泡 Gel-Dye Mix 9μl フローチャート 7 チップにマーカーを入れます マーカー 5μlをラダウェルとサンプルウェル (1-) に入れます 緑のキャップのチューブ サンプル数が 個以下でも必ず全てのサンプルウェルにマーカーをいれましょう 分析が正常に行われなくなります Marker 5μl -10-

11 フローチャート 8 チップにラダを入れます サンプル調製方法 ( 2 を参照 ) にしたがって調製したラダ1μlをラダウェルに入れます 調製したラダ 1μl フローチャート 9 チップにサンプルを入れます サンプル調製方法 ( 2 を参照 ) にしたがって調製したサンプル1μlを各サンプルウェルに入れます 調製したサンプル 1μl フローチャート 10 マーカーとサンプルを混ぜます 専用ミキサーで 1 分間サンプルをよく攪拌します タイマーセット チップホルダーにチップを水平にセットしましょう 上から見た図 横から見た図 1 分間 2400/min の目盛りに合わす -11- チップホルダー チップが水平に入っていない悪い例 * 専用ミキサーは 2400/min で使用します

12 フローチャート 11 バイオアナライザで分析します 調製したチップをバイオアナライザにセットして分析を開始します Assay の選択 total RNA (RIN が計算されます ) サンプルの生物種により適宜選択してください真核生物 * Eukaryote totalrna Nano 原核生物 Prokaryote totalrna Nano 植物 Plant totalrna Nano (ver 以上 ) * 酵母の場合 植物用 Assay を選択することをおすすめします mrna (RIN は計算されません ) mrna や crna の場合 mrna Nano 調製したチップは 5 分以内に分析を開始します 放置時間が長すぎると試料が乾燥して分析が正常に行われなくなります バイオアナライザの操作と解析については別冊の簡易取り扱い説明書を参考にしてください フローチャート 10 電極を洗浄します バイオアナライザでの分析終了後速やかにチップを取り出します 分析の終了したチップはなるべく早く取り出しましょう 放置時間が長すぎると試料が電極にこびりつき 以降の分析が正常に行われないことがあります 電極クリーナーチップで電極を洗浄します (RNase-ZAP) 電極クリーナーチップ 1 枚に RNase-ZAP * を 350μl 入れます ( どのウェルから入れても構いません ) RNase-ZAP * 350μl RNase に汚染されたり 汚れのひどい電極を洗浄する方法については別冊の簡易取扱い説明書を参考にしてください 電極クリーナーチップを軽く揺らしてチップの全てのウェルに RNase-ZAP が満たされるようにします 蓋を閉めた時にスクリーンの装置のアイコンがチップに変わることをご確認ください 電極クリーナーチップ 電極クリーナーをバイオアナライザ にセットし蓋を閉めます 10 秒後チップを取り出します -- *RNase-ZAP は米国 Ambion 社の登録商標です 他社製類似品の使用は推奨いたしません

13 電極クリーナーチップで電極を洗浄します (Nuclease-free water) 続いてもう 1 枚のクリーナーチップに Nuclease-free water を 350μl 入れます ( どのウェルから入れても構いません ) 電極クリーナーチップを軽く揺らしてチップの全てのウェルに Nucleasefree water が満たされるようにします 蓋を閉めた時にスクリーンの装置のアイコンがチップに変わることをご確認ください Nucleasefree water 350μl 電極クリーナーチップ 電極クリーナーをバイオアナライザ にセットし蓋を閉めます 10 秒後チップを取り出し 10 秒間蓋を開けて電極を乾燥させます 洗浄が終わったら電極クリーナーに入れた RNase-ZAP 及び Nuclease-free water はピペットで吸い出しておきましょう よく精製された RNA の分析を 2 チップ以上連続して行う場合のみ RNase-ZAP による洗浄作業を (-2) 省略できます -13-

14 Gel-Dye Mix RNA6000 ナノ RNA6000 ピコ Small RNA 分子量範囲 nt サンプルの調製 フィルター遠心 Gel-Dye Mix 再遠心 Gel total RNA 25~500ng/μl Poly(A)+RNA 25~250ng/μl total RNA 0.2~5ng/μl Poly(A)+RNA 0.5~5ng/μl ( 事前に要フィルター遠心 ) 65μl Total RNA 1~100ng/μl mirna 画分抽出物 1~20ng/μl Oligonucleotide 10~2000ng/μl 40μl Dye 1μl 2μl 遠心力 Gelのみ 550μl 1,500 x g ± 20% (65μl 分注 ) Gel のみ 650μl 10,000 x g ±20% ( 分注なし ) 時間 10 分 15 分 遠心力 時間 底面プレートの位置 Gel-Dye Mix 13,000 x g 10 分 C クリップの位置 上段 下段 Gel-Dye Mix のアプライ量 9μl Gel-Dye Mix の圧縮時間 30 秒 60 秒 Gel-Dye Mix のアプライ量 脱色液のアプライ量 Conditioning Solution( ) のアプライ量 ラダ ( Marker( ) のアプライ量 ) のアプライ量 サンプルのアプライ量 専用ミキサー撹拌時間 なし 9μl なし とサンプルウェル 5μl 9μl ナノ ラダピコ ラダ Small RNA ラダ 1μl サンプルウェル 1μl 60 秒 専用ミキサー撹拌速度 2400/min 2000/min 2400/min -14- CS

15 ladder : ラダ ( 分子量標準ラダ ) ソフトウェア上でラダレーンのピークの位置 (Migration Time) を基に Standard Curve をかきます それをもとにサンプルの各ピークのサイズを計算します 黄色キャップのチューブ Ladder Marker : マーカー ( 内部標準 ) ラダと全てのサンプルに加え データを補正します Lower Marker 緑のキャップのチューブ Marker 補正 Lower Marker -15-

16 RNA ナノ Kit マーカー及びラダの各ピークの分子量 (nt) RNA6000 ナノ LM バイオアナライザのプロトコルなどのダウンロードサイト ( ログイン名 パスワードはお問い合わせください ) バイオアナライザのシリアルナンバー確認方法 本資料掲載の製品は全て研究用です その他の用途にご利用いただくことはできません -16-