う報告26)がみられるが Barrett 食道癌における FAK する必要がある本研究における我々の目的は１の発現とその機能についての報告はみられない FAK の Barrett 食道癌における役割を検討すること Barrett 食道は胃食道逆流症により正常扁平上皮が

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ゆみかこうい
5 years ago
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プロフィール平成 2 年度岡山医学会賞 ( 林原賞 ) 受賞論文 Focal Adhesion Kinase (FAK) と Insulin-like growth factor-i receptor (IGF-IR) に対するデュアルチロシンキナーゼ阻害剤の食道腺癌における抗腫瘍効果 Dual Tyrosine

1 プロフィール平成 2 年度岡山医学会賞 ( 林原賞 ) 受賞論文 Focal Adhesion Kinase (FAK) と Insulin-like growth factor-i receptor (IGF-IR) に対するデュアルチロシンキナーゼ阻害剤の食道腺癌における抗腫瘍効果 Dual Tyrosine Kinase Inhibitor for Focal Adhesion Kinase and Insulin-like Growth Factor-I Receptor Exhibits an Anticancer Effect in Esophageal Adenocarcinoma in Vitro and in Vivo 17

う報告26)がみられるが Barrett 食道癌における FAK する必要がある本研究における我々の目的は１の発現とその機能についての報告はみられない FAK の Barrett 食道癌における役割を検討すること Barrett 食道は胃食道逆流症により正常扁平上皮が化２ TAE226が消化器癌に対する新規治療戦略となる生円柱上皮に置換された状態であるまた

2 う報告26)がみられるが Barrett 食道癌における FAK する必要がある本研究における我々の目的は１の発現とその機能についての報告はみられない FAK の Barrett 食道癌における役割を検討すること Barrett 食道は胃食道逆流症により正常扁平上皮が化２ TAE226が消化器癌に対する新規治療戦略となる生円柱上皮に置換された状態であるまたかを検討３ TAE226による抗腫瘍効果とメカニズ Barrett 食道は食道腺癌の前癌病変であり通常の3 ムを特にアポトーシス経路に着目して解明すること 125倍のリスクで発症する Barrett 食道癌は西欧である 27,28) 27) 諸国において増加傾向にあり５年生存率25%以下 28) Small molecule inhibitor, TAE226 の未だ極めて予後不良な疾患である27) 治療は手術以外に有効なものがなく新規治療戦略の開発が望まれ従来の抗癌剤が DNA 合成や修復細胞の分裂増ている殖過程に作用し殺細胞作用を示し癌細胞への特異性我々のグループにおける FAK に関する先行研究でが低いのに対し分子標的薬では癌細胞の増殖転移は大腸癌と食道扁平上皮癌の癌化過程において FAK などに関わる分子を選択的に阻害することで癌の増殖の発現と活性化の増強がみられることを報告してき抑制進展阻害を示すため癌細胞への特異性が高いたそれゆえに我々は FAK が他の癌腫と同様にとされている癌の分子標的薬剤には大きく小分子化 Barrett 食道癌における細胞増殖や生存にとって非常合物とモノクローナル抗体がある FAK阻害剤はまに重要であると考えた Barrett 食道癌の癌化におけだ臨床応用の段階ではないが複数のFAK阻害剤のる FAK の役割を調べるために我々は Barrett 食道開発報告があり FAK を分子標的とした臨床応用が癌と Barrett 正常上皮の臨床サンプルにおける FAK 期待されている 29) の発現状態を検討したそして FAK に対する特異的 TAE226はノバルティスファーマ社により開発さ small molecule inhibitor (TAE226 を用いて FAK シれた分子量541.87の FAK をターゲットとした分子標グナルを阻害することが細胞増殖細胞接着細胞遊的薬である FAK に特異的な阻害剤として開発され走にどのように影響するかを検討した TAE226はたが IGF-IR に対してもある一定の阻害作用を有する FAK を標的分子としてデザインされたチロシンキナとされている TAE226は FAK 活性化のトリガーにーゼ阻害剤であり IGF-IR に対する追加的な抑制効相当するチロシン397の自己リン酸化を阻害すること果もある IGF-IR は細胞増殖や生存にとって重要なによって下流へのシグナル伝達を抑制する薬剤であ分子を活性化する主要なレセプター型チロシンキナーる 3) 31) ゼの一つであり Barrett 食道癌を含め悪性腫瘍に Barrett 食道癌における FAK の役割おいて発現上昇が確認されている32) TAE226は脳腫瘍における抗腫瘍効果を示した報告 3,31)がみられるまず Barrett 食道癌における FAK の発現状態を免が他の種類の悪性腫瘍に対する効果についての報告疫染色にて検討した Barrett 食道癌患者から外科的はなくまた効果の詳細なメカニズムについても解明に切除した42サンプルを用いて FAK 抗体で染色し A B 図１ＡＢ Barrett 食道上皮と食道腺癌における FAK の発現 18

Barrett 食道癌に対する新規治療戦略渡辺信之他14名た観察部位は Barrett 上皮 38視野 Barrett 食道平上皮という組織学的な違いがあるのではないかと推癌 168視野食道扁平上皮 93視野胃上皮 56視測される図１Ｃ野であった FAK の発現は非癌部と比較し癌部で増における TAE226の抗腫瘍効果強していた図１ＡＢ 5%以上の発現部

3 Barrett 食道癌に対する新規治療戦略渡辺信之他14名た観察部位は Barrett 上皮 38視野 Barrett 食道平上皮という組織学的な違いがあるのではないかと推癌 168視野食道扁平上皮 93視野胃上皮 56視測される図１Ｃ野であった FAK の発現は非癌部と比較し癌部で増における TAE226の抗腫瘍効果強していた図１ＡＢ 5%以上の発現部接着系の細胞は接着依存性に成長するためインテ食道癌では94.%であった図１Ｃ癌部における過グリンを介した細胞接着やその下流のシグナルに対し剰発現傾向は明白であり他の癌腫と同様に Barrett て重要な役割を行っている FAK が阻害されると細胞食道癌においても FAK が過剰発現し癌の進展に重増殖に悪影響をうけるということは容易に考えられる要な役割を果たしていることが示唆されたまた興まず TAE226による細胞増殖抑制効果を検討し味深いのは食道扁平上皮では胃上皮と比較して FAK その後の実験に対する至適濃度を検討するためにの発現が高い傾向がみられたことである陽性が Barrett 食道癌細胞における TAE226の IC5 を測定し 43.% 強陽性が47.3% Barrett 上皮と胃上皮とた SEG-１ FLO-１ BIC-１細胞を TAE226で48時もに円柱上皮における FAK の発現レベルは同程度間処理して測定した IC5は SEG-１で.47ｻM FLO- であり扁平上皮で強発現を示したのは円柱上皮と扁１で1.3ｻM BIC-１で1.29ｻMであった図２Ａ- 図１Ｃ 6 4 図２ＡＢＣ SEG-１細胞 FLO-１細胞 BIC-１細胞における TAE226の細胞増殖抑制効果 1.ｻM TAE226 hour Number of migrating cells E 48 hours < 図２ＤＥ BIC-1 IC5: 1.29ｻM.37 Percentage of live cells (%) Percentage of live cells (%) 4 C FLO-1 IC5: 1.3ｻM TAE226 concentration (ｻM) 食道扁平上皮胃上皮 Barrett 上皮 Barrett 食道癌における FAK の発現レベル D 6 1. Barrettｾs EA 8.33 Barrettｾs epithelium 1.11 Gastric epithelium 12 Squamous epithelium B SEG-1 IC5:.47ｻM.37 A Percentage of live cells (%) Percentage of cases (%) 位はBarrett 上皮で17.9%であったのに対し Barrett TAE226の細胞遊走能抑制効果 19 1.ｻM TAE226

SEG-１細胞にスクラッチを加細胞数も著明に減少していたいくつかの細胞はプラえ 1.

4 Ｃ SEG-１細胞は３種類の細胞株のなかで最も感受 FLO-１細胞では３ｻM TAE226処理により遊走能が性が高いと思われたすべての細胞株で 3. ｻM 抑制された 73±26個 vs 41±11個 TAE226の48時間の処理で9%以上の抑制効果が認め次に TAE226の細胞形態に与える影響を検討したられた(図２Ａ-Ｃ) 位相差顕微鏡で観察すると細胞の単層配列構造が乱次に TAE226による細胞遊走能抑制効果を検討しれ細胞は円形化内部構造も破壊された状態でありた confluent 状態の SEG-１細胞にスクラッチを加細胞数も著明に減少していたいくつかの細胞はプラえ 1.ｻM TAE226およびで48時間処理したスチックプレートから剥がれて縮まっており FAK 図２Ｄは Scratch assay の顕微鏡写真を示すの阻害によって接着が弱まったものと考えられた図で処理したものは遊走した細胞が332±７個であった３Ａ FAK の阻害による細胞形態の変化をさらに検のに対し TAE226で処理したものは59±１個であっ討するためにアクチン Red pfak Green 核た図２ＥこのことからTAE226による FAK の阻 Blue を３重染色し共焦点レーザー顕微鏡にて観察害により細胞遊走能を抑制されることが示唆されたした FAK 活性がある細胞はアクチンファイバーの A 1.ｻM TAE226 3.ｻM TAE226 hour 24 hours 48 hours 図３Ａ B C TAE226の細胞形態に対する効果位相差顕微鏡観察 Top Bottom Top Bottom 図３ＢＣ TAE226の細胞形態に対する効果共焦点レーザー顕微鏡観察 2

Barrett 食道癌に対する新規治療戦略渡辺信之他14名構造が正常に保たれており FAK のリン酸化はアク FAK 阻害による効果は主に AKT-BAD-Caspase を経チンファイバーの両端に局在しておりこのことから由したアポトーシス誘導であった活性化 FAK は細胞構造を維持するために接着点に局在していることがわかる図３Ｂ TAE226処理によ FAK

5 Barrett 食道癌に対する新規治療戦略渡辺信之他14名構造が正常に保たれており FAK のリン酸化はアク FAK 阻害による効果は主に AKT-BAD-Caspase を経チンファイバーの両端に局在しておりこのことから由したアポトーシス誘導であった活性化 FAK は細胞構造を維持するために接着点に局在していることがわかる図３Ｂ TAE226処理によ FAK 阻害が細胞死を誘導するかどうかを検討するりアクチン構造の消失接着阻害 FAK の活性化阻ために細胞周期の分布をフローサイトメトリーにて検害が認められた図３Ｃ討した図４ＡＢに示すように TAE226処理により sub-g０相の増加が認められた G１相やG２/Ｍ相の分布においては明らかな変化を認めなかったこの結果から sub-g０相細胞が増加するということは FAK 阻害剤により細胞死が増加するということを表 A しているのではないかと推測する次の疑問として TAE226処理によりアポトーシスをきたすかどうかということであるこの疑問に対し TUNEL 染色を行 1.ｻM TAE226 った図４Ｃ TAE226により24時間以内に TUNEL hour 図４ＡＢ 6 hours 陽性細胞の増加を認め TAE226による FAK の活性 24 hours 阻害によって Barrett 食道癌細胞はアポトーシスに誘導された図４Ｄ G2-M TAE226誘導性のアポトーシスがどのようなシグナ S G-G1 ル経路でおこるのかということを検討するためにウ sub-g 1 6 Time (hour) エスタンブロットによって FAK の下流のシグナル分 24 子を解析した TAE226は濃度時間依存性に FAK のリン酸化を阻害した図５ＡＢ AKTの活性化も同様に抑制されたが ERK 活性の抑制は軽度であっ TAE226の細胞周期に与える影響 C 1.ｻM TAE226 hour 1 hour 6 hours 24 hours D Percentage of apoptotic cells (%) Cell number (% of total) B 1 hour ｻM TAE <.5 24 Time (hour) 図４ＣＤ TAE226によるアポトーシス誘導効果 21

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1. Caov-3 細胞株 A2780 細胞株においてシスプラチン単剤シスプラチンとトポテカン併用添加での殺細胞効果を MTS assay を用い検討した 2. Caov-3 細胞株においてシスプラチンによって誘導される Akt の活性化に対しトポテカンが影響するか否かを調べるためにシスプラチ

1. Caov-3 細胞株 A2780 細胞株においてシスプラチン単剤シスプラチンとトポテカン併用添加での殺細胞効果を MTS assay を用い検討した 2. Caov-3 細胞株においてシスプラチンによって誘導される Akt の活性化に対しトポテカンが影響するか否かを調べるためにシスプラチ ( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査朝日通雄恒遠啓示副査副査瀧内比呂也谷川允彦副査勝岡洋治主論文題名 Topotecan as a molecular targeting agent which blocks the Akt and VEGF cascade in platinum-resistant ovarian cancers ( 白金製剤耐性卵巣癌における