Microsoft PowerPoint - 多核NMRへの応用_提出版.pptx

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1 多核 NMR の応用 ~ 19 F NMRを用いた定量分析 ~ 第 1 回定量 NMRクラブ (2012/12/4) 産業技術総合研究所計測標準研究部門有機分析科バイオディカル標準研究室山﨑太一 1

2 定量 19 FNMR 法の開発目的フッ素化合物は生化学におけるスクリーニングや材料科学におけるポリマー分析等幅広く用いられている分子構造解析や酵素活性等の速度論解析に使用 19 FNMR を用いた高精度な定量法開発は重要! 1 H NMRと同等の検出感度目的以外の成分にフッ素が含まれないことが多くスペクトル上で他の成分の影響を受けにくい 2

3 発表内容 F NMR の特性 2. 定量分析法の検討 3. 標準物質を用いた分析法の評価 4. 解析法の最適化 5. まとめ 3

4 使用装置測定装置 :Varian Inc. 製 VNS 600A 磁石 :14.1 T 1 H 共鳴周波数 :600 MHz 検出器 ( プローブ ):Dual broadband probe 測定核種 : 1 H- 19 F/ 15 N- 31 P 温度可変 :-5~80 4

5 1 H NMR と 19 F NMRの比較 1 H 19 F 共鳴周波数 600 MHz MHz 核スピン 1/2 1/2 天然存在比 % % 測定範囲 20 ppm 以下 200 ppm 以上 19 F NMR に 1 H NMR と類似かつ感度も良好定量 NMR として有効 19 F を用いるメリット天然存在比 100 % で同位体の影響がない溶媒の影響を受けにくい測定範囲が広いためシグナル分離が良好多成分の一斉分析の可能性 5

6 オフレゾナンス効果とは? 励起中心から遠い位置のシグナルほどシグナル強度が減衰する ~ オフレゾナンス効果 ~ パルスは励起中心周波数付近ではほとんど励起できるが励起中心から遠い位置 ( オフレゾナンス ) では 100 % 励起されないオフレゾナンス効果は NMR 活性な全ての核種で確認できるが 19 F NMR のように測定範囲が広い核種では影響が顕著に現れる 6

7 測定解析条件測定条件測定核 : 19 F 測定温度 :25 測定スペクトル幅 : Hz (233.1 ppm) 取り込み時間 :1 s 遅延時間 :60 s パルス幅 :14.4 s パルス角度 :90 積算回数 :32 7

8 測定対象 19 FNMR 測定における分子内積分比を比較し測定法の確立を目指す測定法の確立を目指す物質名 : ペルフルオロオクタンスルホン酸カリウム (PFOS-K) 分子式 :C 8 F 17 SO 3 K 分子量 : 構造式 : F F F F F F F F F F F F F F F F F 試料は NMIJ CRM 4220-a の原料 ( 高純度品 ) に用いられたものを使用分子内に類似した複数の F を有するため 19 F NMR 測定のシグナル分離や積分比比較に適している O S O OK 2010 度から特化物の対象に指定 8

9 19 FNMR スペクトル (PFOS-K) 1 F F F F F F F FF F F 6 4 F F F F F F 2 O S OK O シグナル 4 には 3 つのシグナルが重なっている ( 40 ppm 超 9

10 オフレゾナンス効果 (PFOS-K) F 数で規格化 00(%) (A/Am max)/f 数測定中心周波数 / ppm シグナルが測定中心周波数に近いときに対象シグナルの極大を持つ -200 シグナルごとに最大値を与える測定条件が異なる 10

11 19 FNMR スペクトル (PFOS-K) (A/Am max)/f 数 100(%) (A/Am max)/f 数 100(%) 測定中心周波数 /pp ppm 測定中心周波数 / ppm ( ( 測定中心測定中心 11

12 シグナル強度と再現性へのオフレゾナンス効果の影響測定中心 40 ppm 面積値 /F 数 90 o シグナル No. 平均値 RSD / % シグナル1とシグナル6の比較約 10 % の差結果パルス角 90 の場合は面積値再現性分子内シグナル間差面積強度再現性は十分だが分子内シグナル間差があるため 90 1 <0.2 % <10 % 定量には工夫が必要 12

13 発表内容 F NMR の特性 2. 定量分析法の検討 3. 標準物質を用いた分析法の評価 4. 解析法の最適化 5. まとめ 13

14 定量法案シグナル A シグナル B 測定中心周波数 (2 つのシグナルの中心 ) // // シグナル A の信号強度とシグナル B の信号強度を比較中心周波数の設定に問題が無いことが条件となる 14

15 測定結果 PFOS-K 比較シグナル 90 o 30 o A B シグナル A シグナル B (A-B)/A 100 シグナル A シグナル B (A-B)/A 100 の面積値の面積値 (%) の面積値の面積値 (%) シグナル間の面積強度比を比較 90 : 約 1 % 30 : 約 2 % 程度で測定することが出来た 15

16 結果測定条件を適切に設定することでオフレゾナンス効果を低減することができた 90 パルス照射のほうが30 パルスと比較するとより再現性が高い結果が得られた S/Nの影響と考えられ高精度かつ短い測定時間で分析するためには90 パルスのほうが有効と考えられる 16

17 発表内容 F NMR の特性 2. 定量分析法の検討 3. 標準物質を用いた分析法評価 4. 解析法の最適化 5. まとめ 17

18 分子間純度測定 ( 内標準法 ) 19 F NMR の特性を考慮し提案した定量法を分子間測定へと応用し測定法の有効性を検証 ~ 検討方法 ~ 標準物質間で比較 ( 一方を基準物質他方を測定対象 ) することで定量法の妥当性評価を行った観測されるケミカルシフトの近い物質遠い物質でそれぞれ検討し幅広い環境に適応できる定量法解析法を検討 18

19 基準物質物質名 : クロルフェナピル CAS No. : 純度 :0.996 ± g/g gg( (k = 2) Cl N O CF 3 N Br 19 FNMR スペクトル ( アセトン溶媒 ) = ppm 19

20 測定対象 1 F 3 C O 物質名 : フルスルファミド CAS No. : 純度 :0.995 ± g/g (k = 2) Cl S HN O Cl 19 FNMR スペクトル ( アセトン溶媒 ) NO 2 = ppm 20

21 19 FNMR スペクトルクロルフェナピル = ppm) フルスルファミド = ppm) 21

22 定量結果中心値で約 0.4 % 程度の差純度 (mg/mg) TRM 標準物質の純度範囲 (k = 2) 標準物質の不確かさの範囲内で定量値が一致 22

23 測定対象 2 物質名 : ジフルベンズロン CAS No. : 純度 :0.998 ± g/g gg( (k = 2) F F N O N O Cl 19 FNMR スペクトル ( アセトン溶媒 ) = ppm 23

24 19 FNMR スペクトルクロルフェナピル = ppm) 面積値は同程度だがシグナルの形状が異なるために S/Nに大きな差があるジフルベンズロン = ppm) 24

25 定量結果中心値で約 2 % 程度の差 TRM 標準物質の純度範囲 (k = 2) 標準物質の認証純度と比較して大きな差が確認 S/N ベースライン ( 補正 ) 半値幅積分区間などいくつかの要因が懸念 25

26 発表内容 F NMR の特性 2. 定量分析法の検討 3. 標準物質を用いた分析法の評価 4. 解析法の最適化 5. まとめ 26

27 解析法の最適化 19 F NMRでは 1 H NMRと比較して半値幅の大きなシグナルが観測されることがある 19 FNMR では測定のスペクトル幅は広く広い積分範囲ではベースラインの影響を受ける 1 H NMRにおける定量分析は十分広い積分範囲を設定し精確に定量できるが 19 F NMRではシグナルごとの最適化が必要固定範囲ではなく半値幅を基準? 27

28 測定対象物質 Cl N O CF 3 Br Cl F 3 C O S O F HN Cl N O F N O Cl N NO 2 クロルフェナピル (IS) フルスルファミドジフルベンズロン IS :Chlorfenapyl (0.996 kg/kg±0.005 kg/kg, 半値幅 :2 Hz) Analyte A:Flusulfamide (0.995kg/kg±0.006 kg/kg, 半値幅 : 2 Hz) Analyte B:Diflubenzurone (0.998 kg/kg±0.008 kg/kg, 半値幅 : 27 Hz) 28

29 フルスルファミドクロルフェナピル ( )/ フルスルファミド ( ) 1 1 Norm malized area Norm malized area Integral range (Hz) Integral range ( FWHM (Hz)) 積分範囲の拡大とともに規格化面積値も増加内標準と測定試料の面積変動が同等! 測定結果 ( 純度値 ) は変わらない 29

30 ジフルベンズロンクロルフェナピル )/ ジフルベンズロン ( ) 1 1 Norm malized area Norm malized area Integral range (Hz) Integral range ( FWHM (Hz)) 積分範囲の拡大とともに規格化面積値も増加内標準と測定試料の面積変動が異なる! 測定結果 ( 純度値 ) に影響 30

31 最適化後の定量結果 flusulfamide diflubenzurone integral range purity SD purity SD reference value Hz Hz Hz Hz Hz times to FWHM times to FWHM times to FWHM times to FWHM times to FWHM 半値幅に差がない場合積分方法の影響は小さい半値幅に差がある場合積分方法の影響は大きい半値幅の 30~40 倍で積分すると妥当な値が得られた 31

32 まとめ 19 F NMRでは測定周波数範囲が広くオフレゾナンス効果の影響を大きく受けるために影響を低減可能な測定法が必要 1 H NMRと比較してブロードなシグナルもあり半値幅に対応した解析方法が有効測定法及び解析法を最適化することで 0.5 % 程度の精度で測定が可能 32

33 今後の課題ふっ素含有の様々な化合物の定量を試み本法の妥当性を検証する 19 FNMR 用の内標準物質の開発溶液中の成分定量への応用の応用オフレゾナンス効果を低減させる工夫 33

34 ご静聴ありがとうございました 34

Chap. 1 NMR

Chap. 1 NMR β α β α ν γ π ν γ ν 23,500 47,000 ν = 100 Mz ν = 200 Mz ν δ δ 10 8 6 4 2 0 δ ppm) Br C C Br C C Cl Br C C Cl Br C C Br C 2 2 C C3 3 C 2 C C3 C C C C C δ δ 10 8 6 4 δ ppm) 2 0 ν 10 8 6 4 δ ppm) 2 0 (4)