Peroxisome Proliferator-Activated Receptor a (PPARa)アゴニストの薬理作用メカニズムの解明

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ああすはにうだ
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1 インスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構の解明 Clarification of Regulatory Mechanisms for Determining Number and Size of Adipocytes by Insulin 平成 25 年度論文博士申請者指導教員伊藤実 (Ito, Minoru) 本島清人肥満は糖尿病脂質異常症高血圧動脈硬化症などの生活習慣病の基盤となるリスクファクターである脂肪容量は脂肪細胞のサイズと数によって規定されている過食や運動不足による肥満は主に脂肪細胞のサイズアップ ( 以下肥大化 ) である近年脂肪細胞の肥大化が慢性炎症を惹起することから脂肪細胞の肥大化を抑制することで種々の肥満関連疾患の予防治療に役立つ可能性が示唆されているしかし脂肪細胞の数の増加や肥大化に関わる分子やシグナル伝達経路は十分には解明されておらずまた肥大化を特異的に抑制する創薬ターゲットも同定されてはいない本研究ではヒト白色脂肪細胞でのインスリンによる脂肪細胞数の増加と脂肪細胞の肥大化にcell death-inducing DNA fragmentation factor- -like effector (CIDE) ファミリータンパクが深く関与しその発現制御メカニズムが細胞数の増加と細胞の肥大化で異なることが見出された 1. ヒト白色脂肪細胞でのインスリン作用におけるCIDEファミリーの役割脂肪組織は単なるエネルギー貯蔵庫として働くばかりでなく生理状況に応じて種々の内分泌因子 ( アディポサイトカイン ) を産生分泌し糖脂質代謝動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たしているその一方で過栄養や遺伝子背景による肥満脂肪蓄積は糖尿病脂質異常症高血圧動脈硬化症を引き起こす要因の一つとして考えられている 1) 脂肪容量は脂肪細胞の数の増加と肥大

2 化により規定される近年脂肪細胞は肥大化することで悪性化しアディポサイトカインの産生異常をきたして慢性炎症やインスリン抵抗性糖脂質代謝異常の惹起に関わることが明らかとなっている 2) 脂肪容量を増大させる強力な生体内ホルモンとしてインスリンが知られるインスリンは脂肪細胞において数に影響するアポトーシスを抑制することサイズに影響する脂質合成を亢進させることが知られているが 3-4) 作用メカニズムは未だ不明な点が多い一方脂肪容量を制御する分子としてCIDEファミリータンパクがある CIDE ファミリータンパクとしてCIDEA CIDEB CIDECが知られておりアポトーシス誘導脂肪滴形成などに関わることが報告されている 5) しかし脂肪細胞でのインスリン作用との関連については不明であるそこで CIDEファミリーがインスリン作用に寄与するかどうかを調べるためはじめにヒト白色脂肪前駆細胞から分化させた脂肪細胞 ( 以下ヒト白色脂肪細胞 ) でインスリンによるCIDEA CIDEB 及びCIDECの発現変動が認められるかリアルタイム定量 PCR 法で調べたインスリンはCIDEA mrnaの発現を低下させその一方で CIDEC mrnaの発現を亢進していた ( 図 1A) これらの現象は濃度依存的かつ時間依存的であり 100 nmのインスリン添加後 24 時間でピークに達していた 6) またインスリンはCIDEB mrnaの発現には影響を及ぼさなかったインスリンによるmRNAの発現変動が認められたCIDEA 及びCIDECについてはタ

ンパクの発現レベルをウエスタンブロット法により確認し同様の結果が得られた ( 図 1B) 以上の結果からヒト白色脂肪細胞ではインスリンにより CIDEAが発現低下し CIDECが発現亢進することが明らかとなった次にインスリンによる発現変動が認められたCIDEA 及びCIDECについてインスリンのアポトーシス抑制作用及び脂肪滴形成作用に関与するかどうか

3 ンパクの発現レベルをウエスタンブロット法により確認し同様の結果が得られた ( 図 1B) 以上の結果からヒト白色脂肪細胞ではインスリンにより CIDEAが発現低下し CIDECが発現亢進することが明らかとなった次にインスリンによる発現変動が認められたCIDEA 及びCIDECについてインスリンのアポトーシス抑制作用及び脂肪滴形成作用に関与するかどうか sirnaを用いた遺伝子ノックダウン法で調べた CIDEAのsiRNA (sicidea) を添加したヒト白色脂肪細胞ではインスリンと同程度に無血清状態によるアポトーシスを抑制していたが CIDEC sirna (sicidec) 添加では無影響であった ( 図 2A) また sicideaを添加したヒト白色脂肪細胞ではインスリンによる相加的なアポトーシス抑制作用が認められなかった 6) 一方インスリンによる脂肪滴形成作

4 用はsiCIDECにより抑制され sicideaは無影響であった ( 図 2B) 以上の結果からインスリンによるアポトーシス抑制作用にはCIDEAの発現低下が寄与し脂肪滴形成作用にはCIDECの発現亢進が重要であることが示唆された 2. インスリンによるCIDEA 及びCIDECの発現制御に関わる経路の探索次にインスリンの主要なシグナル伝達経路に関わるキナーゼの阻害剤又は sirnaを用いてヒト白色脂肪細胞でのインスリンによるCIDEA 及びCIDECの発現制御に関わる経路を探索した 7) Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) の阻害剤であるWortmannin 及びPI-103はインスリンによるCIDEAの発現低下及びCIDECの発現亢進の双方を抑制した ( 図 3A) 一方 PI3Kの下流に位置するAkt1/2のsiRNA (siakt1/2) はインスリンによるCIDEAの発現低下を抑制し ( 図 3B) c-jun N-terminal kinase 2 (JNK2) のsiRNA () はインスリンによるCIDECの発現亢進を抑制した ( 図 3C) また siakt1/2はインスリンによるアポトーシス抑制を解除し ( 図 4A) は脂肪滴形成を抑制した ( 図 4B) 以上の結果からインスリンのアポトーシス抑制に関わるCIDEAの発現制御はPI3K 及びAkt1/2を介し脂肪滴形成に関わるCIDECの発現制御はPI3K 及びJNK2を介することが明らかとなった 3. インスリン /JNK2による脂肪滴サイズの増大に関与する新規遺伝子の探索さらに脂肪滴サイズの増大メカニズムを明らかにするため CIDEC 以外にも他の脂肪滴形成に関わる遺伝子がインスリン /JNK2 経路により制御されるかどうかをヒト全ゲノムマイクロアレイ解析及びパスウェイ解析により探索した 8) インスリン /JNK2 経路は脂質代謝に関わる遺伝子の発現を主に制御することが判明

5 Relative protein levels Relative protein levels Relative mrna levels Relative mrna levels Relative mrna levels A SREBP-1c mrna B JNK1 mrna JNK2 mrna 8 6 ** ## sicontrol sijnk1 0.0 sicontrol sijnk1 0.0 sicontrol sijnk1 C Cytoplasmic extracts pre-srebp-1 JNK2 β-actin sicontrol Insulin Nuclear extracts n-srebp-1 pre-srebp-1 protein ** sicontrol ## n-srebp-1 protein ** sicontrol # 図 5 インスリンによる SREBP-1c の発現制御に対する JNK2 の関与 ** P < 0.01 ( インスリン非処置コントロール群と比較 ), # P < 0.05, ## P < 0.01 ( インスリン処置コントロール群と比較 ) したさらにパスウェイ解析により脂肪合成の調節に関わる重要な転写因子である sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) がこれら遺伝子の主要な制御因子であることが予測されたそこで次に脂肪組織で発現量の多いアイソフォームである SREBP-1c の発現がインスリン /JNK2 経路により制御されるかどうかをリアルタイム定量 PCR 法で調べたはインスリンによる SREBP-1c mrna の発現亢進を抑制し ( 図 5A) JNK2 mrna の発現を特異的に減少させた ( 図 5B) またはインスリンによる前駆体 SREBP-1 蛋白質 (pre-srebp-1) 及び活性型である核型 SREBP-1 蛋白質 (n-srebp-1) の発現亢進をいずれも抑制した ( 図 5C) 以上の結果から SREBP-1c はインスリン /JNK2 経路により制御されることが明らかとなった本研究ではインスリンによるヒト白色脂肪細胞の数の増加 ( アポトーシスの抑制 ) と脂肪細胞の肥大化 ( 脂肪滴形成サイズの増大 ) に CIDEA と CIDEC が選択的に関与しその発現制御は PI3K 以降のシグナルで分岐しそれぞれ Akt1/2 JNK2 を介することが明らかとなった ( 図 6) また本研究でヒト白色脂肪細胞においてインスリンによる肥大化 ( サイズの増大 ) に関わる特異的な経路として JNK2/CIDEC 並びに JNK2/SREBP-1c が見出された肥満及びその後の関連疾患の

予防治療においては言うまでもなく食事運動療法がベースとなり余剰エネルギーを作らないことが重要であるしかし一方で数のシグナルとは分岐した肥大化特異的シグナルのみを選択的に阻害するという手法ができれば慢性炎症を惹起する悪性脂肪細胞を良性脂肪細胞へと質的に変化させ肥満関連疾患の発症抑制に役立てることができるかもしれないインスリン PI3K 治療標的 Akt1/2 JNK2 CIDEA

, Puri V., Czech MP., Nat Rev Mol Cell Biol., 9, 367-377 (2008). 3) Ursø B., Niesler CU., O'Rahilly S., Siddle K., Cell Signal., 13, 279-85 (2001). 4) Kersten S., EMBO Rep., 2, 282-6 (2001).

6 予防治療においては言うまでもなく食事運動療法がベースとなり余剰エネルギーを作らないことが重要であるしかし一方で数のシグナルとは分岐した肥大化特異的シグナルのみを選択的に阻害するという手法ができれば慢性炎症を惹起する悪性脂肪細胞を良性脂肪細胞へと質的に変化させ肥満関連疾患の発症抑制に役立てることができるかもしれないインスリン PI3K 治療標的 Akt1/2 JNK2 CIDEA CIDEC SREBP-1c アポトーシス脂肪滴形成脂肪細胞の数脂肪細胞のサイズ脂肪組織容量良性脂肪細胞悪性脂肪細胞慢性炎症参考文献図 6 インスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構の仮説 1) Haslam DW., James WP., Lancet., 366, (2005). 2) Guilherme A., Virbasius JV., Puri V., Czech MP., Nat Rev Mol Cell Biol., 9, (2008). 3) Ursø B., Niesler CU., O'Rahilly S., Siddle K., Cell Signal., 13, (2001). 4) Kersten S., EMBO Rep., 2, (2001). 5) Gong J., Sun Z., Li P., Curr Opin Lipidol., 20, (2009). 6) Ito M., Nagasawa M., Hara T., Ide T., Murakami K., J Lipid Res., 51, (2010). 7) Ito M., Nagasawa M., Omae N., Ide T., Akasaka Y., Murakami K., J Lipid Res., 52, (2011). 8) Ito M., Nagasawa M., Omae N., Tsunoda M., Ishiyama J., Ide T., Akasaka Y., Murakami K., J Lipid Res., 54, (2013).

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規論文の内容の要旨論文題目アンジオテンシン受容体拮抗薬テルミサルタンのメタボリックシンドロームに対する効果の検討指導教員門脇孝教授東京大学大学院医学系研究科平成 19 年 4 月入学医学博士課程内科学専攻氏名廣瀬理沙要旨背景目的わが国の死因の第二位と第三位を占める心筋梗塞や脳梗塞などの心血管疾患を引き起こす基盤となる病態として過剰なエネルギー摂取と運動不足などの生活習慣により内臓脂肪が蓄積する内臓脂肪型肥満を中心に