井上先生　報告書　清水

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せとかたみや
5 years ago
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1 派遣研究室 : ボン大学 Life and Medical Sciences(LIMES) Institute, Prof.Michael Hoch 研究室研究交流概要近年 TAL effector nuclease (TALEN) や CRISPR/Cas9 システムが効率的で簡便なゲノム編集技術として注目されている派遣者は TALEN を用いてゼブラフィッシュに遺伝子変異を導入する実験を行った初めに体細胞変異の変異率を測定して TALEN プローブセットの変異導入効率を検討した次に導入された変異箇所の塩基配列の解析を行い得られた変異のタイプを同定しこの TALEN プローブが機能していることを確かめた最後に得られたデータから最適の組み合わせと実用上の至適濃度について考察した研究交流概要 8/3 フランクフルト到着 ICE に乗り2 時間程度でボンに到着しホテルにチェックイン 8/4 午前中 LIMES Institute Prof. Hoch lab. で研究を行っている田中英臣先生とディスカッションし滞在中の実験計画を立てる TALEN プローブは Trim71 遺伝子の翻訳開始コドン近傍に変異を導入出来るように設計されたものが複数準備されているのでそれを用いた ( ライトアーム2 種類 (4R 6R) レフトアーム 3 種類 (4L 5L 6L)) マイクロインジェクションは正確な技術が必要なので田中先生が行い派遣者は体細胞変異確認手法の原理と必要な手技の習得に務めた変異の有無はターゲット部位近傍を PCR で増幅し増幅産物の制限酵素での切断パターンから判定する初めに予め準備されたプライマーでゲノム DNA を鋳型にして PCR を行い予想される長さのバンドが増えることを確認した 8/5 前日に PCR のプライマーが機能することが確かめられたので TALEN プロー

2 ブ (4L/4R 75μg/μl) をインジェクションしたサンプルのゲノム DNA を鋳型として PCR を行った電気泳動を行い増幅産物を泳動ゲルから精製し TA クローニングのため pcrⅡ TOPO vector へのライゲーション反応を 16 オーバーナイトで行った ( サンプル1) 8/6 前日のライゲーションミックスを大腸菌にトランスフォームし LB 培地にプレーティング後 37 オーバーナイトで培養した平行して異なる濃度の TALEN プローブ (4L/4R 150μg/μl) をインジェクションしたサンプルのゲノム DNA を鋳型として PCR を行った前日同様に PCR と増幅産物の精製を行い pcrⅡ TOPO vector へのライゲーション反応を行った ( サンプル2) 8/7 午前中ゼブラフィッシュの 1 細胞期の受精卵に異なる濃度の TALEN プローブをインジェクションした ( サンプル3 サンプル4 4L/4R 150μg/μl 4L/4R 200μg/μl) それぞれの TALEN プローブにはマーカーとして YFP mrna を加えてあり後日蛍光顕微鏡下でプローブ導入の有無をチェック出来る午後にサンプル1について前日プレーティングした培地にコロニーが形成されていることを確認した blue/white selection を行い 5 6 個の white コロニーを選んでコロニー PCR を行った得られた増幅産物に制限酵素処理後電気泳動を行い切断パターンの違いから体細胞変異の導入効率を評価したサンプル 2 について ligation mix を大腸菌に transform し 37 オーバーナイトで培養した夕方 Hoch 研究室のメンバーにより企画された BBQ に参加した 8/8

3 サンプル 2 についてサンプル 1 と同様に 56 個の white コロニーを選んでコロニー PCR を行い増幅産物の制限酵素による切断パターンから体細胞変異の導入効率を評価した前日新たにインジェクションしたサンプル 3 4 についてそれぞれから YFP 陽性で形態が正常な embryo を 12 個体選びゲノム DNA を抽出した 8/9 土日は休日で自由行動ライン川中流域のコブレンツに観光モーゼル川とライン川の合流地点であるドイチェスエックと対岸の丘にあるエーレンブライトシュタイン城跡にのぼり丘からドイチェスエックを一望川沿いの広場でドイツの休日の雰囲気を味わうことができ日本と違ってとても開放的な休日を過ごした 8/10 ボンの市街地を観光ベートーベンハウスや市庁舎ライン川のほとりを散策 8/11 サンプル1 2について変異部位の塩基配列を調べるために前日の電気泳動パターンから陽性と思われるコロニーを選び大腸菌を液体培地中で 37 オーバーナイトで培養してプラスミドを増幅したサンプル3 4のゲノム DNA について PCR を行ったが成功しなかった Positive control で PCR が出来たことからゲノム DNA 抽出に失敗したことが判明したゲノム抽出時の ProteinaseK の濃度を間違っていたことが原因であった田中先生と残りの1 週間で出来ることについてディスカッションし実験計画の修正を行った 8/12 午前中サンプル3 4とは異なる種類と濃度の TALEN プローブを 1 細胞期の受精卵にインジェクションした ( サンプル L/4R 75μg/μl 5L/4R 150μg/μl 4L/4R 75μg/μl)

4 午後にサンプル 1 2 について前日液体培地で培養した大腸菌からプラスミドを精製しシークエンス解析に出した 8/13 シークエンス解析の結果からサンプル1の 3 個のクローンで標的部位に変異が認められたこの内 1 クローンは 12 塩基の挿入 2 クローンは 80 塩基と 13 塩基の欠失であったアミノ酸に変換すると 3 残基の挿入では下流の配列は正常であったが欠失の 2 クローンではフレームシフトが起こり標的部位近傍に異所性に終止コドンが形成される事が確認出来た新たにインジェクションしたサンプル5 6 7ついてゲノム DNA を抽出した今回はゲノム抽出時の ProteinaseK 濃度を修正し正しく作業出来たサンプル1 2の場合と同様に PCR 産物の精製し pcrⅡ TOPO vector へのライゲーション反応を行った 8/14 サンプルのライゲーションミックスを大腸菌に transform し 37 オーバーナイトで培養した 8/15 サンプル5 6 7のコロニー PCR を行い体細胞変異の導入効率を評価したこれまで得られたサンプル1 2のデータと合わせて TALEN プローブセットの組み合わせと最適濃度について検討したその結果 4L/4R75μg/μl で 5.3% の効率でゲノムに変異を導入出来る事が判った 5L/5R の組み合わせにおいても 75μg/μl で 4.1% 150μg/μl で 16.6% の効率で変異を導入出来ることが判ったしかし高濃度 (150μg/μl) のインジェクションは生存率も悪くなる生殖系列で変異を導入し次世代で変異体を得る事が目的なので 75μg/μl 程度の濃度が実用上至適であると考えられた 8/16 休日で自由行動ブリュールの宮殿やケルン大聖堂アーヘン大聖堂などの世界文化遺産を観光した宮殿や教会など歴史的な建築物を見ることができ日

5 本には無い文化に触れることが出来た 8/17 ボン中央駅から電車でフランクフルト空港へ空港で最後のドイツビールを飲んで日本へ帰国交流総括 TALEN や CRISPER/Cas9 システム等の技術が開発され ENU や EMS 等化学物質でゲノムに変異をランダムに導入していた時代に較べ任意の遺伝子に対して高確率で変異を導入することが可能となったこれらの技術は遺伝子操作における基礎技術となりつつある今回の滞在で TALEN を用いたゼブラフィッシュにおける Mutagenesis の一連の技術を習得でき時代の最先端に遅れを取らないことが重要であると感じた体細胞変異効率の測定は TALEN や CRSPR/ Cas9 システムが正しく働いている事を調べるために必須の技術なので今回の派遣で得られた知見を基にして自身の研究にも応用出来るようにしたい Hoch 研究室ではモデル生物としてマウスゼブラフィッシュショウジョウバエなど多様なモデル生物を用いて研究を進めておりどのモデル生物が研究に適しているか? など改めてモデル生物実験系の重要性について考えるよい機会になった Hoch 研究室のメンバーと実験後に BBQ をする機会があり夏の日照時間が長いドイツならではの光景を楽しむことが出来た

手順 ) 1) プライマーの設計発注変異導入部位がプライマーのほぼ中央になるようにする可能であれば制限酵素サイトができるようにすると確認が容易になるプライマーは 25-45mer で TM 値が 78 以上になるようにする Tm= (%GC)-675/N-%mismatch

手順 ) 1) プライマーの設計発注変異導入部位がプライマーのほぼ中央になるようにする可能であれば制限酵素サイトができるようにすると確認が容易になるプライマーは 25-45mer で TM 値が 78 以上になるようにする Tm= (%GC)-675/N-%mismatch Mutagenesis 目的 ) 既存の遺伝子に PCR を利用して変異を導入する 1 点変異導入方法 ) Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) のプロトコールを流用 http://www.stratagene.com/products/showproduct.aspx?pid=131 Kit 中では DNA polymerase

井上先生 報告書 清水

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