Mincle は死細胞由来の内因性リガンドを認識し炎症応答を誘導することが報告されているが非感染性炎症における Mincle の意義は全く不明である最近肥満の脂肪組織で生じる線維化により脂肪組織の脂肪蓄積量が制限され肝臓などの非脂肪組織に脂肪が沈着し ( 異所性脂肪蓄積 ) 全身のインス

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しょうこかりこめ
5 years ago
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1 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名池田賢司論文審査担当者主査下門顕太郎副査鍔田武志竹田秀論文題目 Macrophage-inducible C-type lectin underlies obesity-induced adipose tissue fibrosis ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > 肥満では脂肪細胞とマクロファージの持続的な相互作用による悪循環が形成され慢性炎症性の変化を生じており全身性のインスリン抵抗性や異所性脂肪蓄積が誘導される肥満の脂肪組織では細胞死に陥った脂肪細胞を炎症促進性 M1 マクロファージが取り囲む特徴的な組織像である王冠様構造 (crown-like structure : CLS) が認められる本論文では結核菌の病原体センサーである C 型レクチン (macrophage-inducible C-type lectin : Mincle) が CLS を構成する M1 マクロファージに選択的に発現しマクロファージの線維化関連遺伝子の誘導脂肪組織の線維芽細胞の活性化間質の線維化を促進することを明らかとした Mincle は肥満に伴う脂肪組織の線維化を誘導し肝臓の異所性脂肪蓄積やインスリン抵抗性を導くことを見出した本研究により Mincle が脂肪組織線維化を介して異所性脂肪蓄積を促進するという新たな分子機構が明らかになった < 緒言 > 肥満脂肪組織では軽度な炎症が慢性的に生じメタボリックシンドロームの基盤病態に関与することが明らかになっているその分子機構として当研究室では飽和脂肪酸と腫瘍壊死因子 (tumor necrosis factor-α : TNF-α) による脂肪細胞とマクロファージの相互作用が悪循環を形成し脂肪組織炎症を増悪させることを明らかにした肥満脂肪組織では脂肪細胞の肥大血管新生免疫担当細胞の浸潤細胞外マトリックスの過剰産生等の脂肪組織のリモデリングが認められるまた肥満脂肪組織では細胞死に陥った脂肪細胞をマクロファージが取り囲み貪食する特徴的な構造物である CLS が認められるしかしながら CLS がどのように形成され脂肪組織リモデリングにどのように関与するか明らかになっていない当研究室では肥満脂肪組織における新たな炎症制御分子を探索しマクロファージに特異的な遺伝子として結核菌や真菌に対する病原体センサー Mincle を同定し肥満症例や肥満マウスの脂肪組織に Mincle が高発現すること特に炎症促進性 M1 マクロファージに選択的に発現することを見出した - 1 -

2 Mincle は死細胞由来の内因性リガンドを認識し炎症応答を誘導することが報告されているが非感染性炎症における Mincle の意義は全く不明である最近肥満の脂肪組織で生じる線維化により脂肪組織の脂肪蓄積量が制限され肝臓などの非脂肪組織に脂肪が沈着し ( 異所性脂肪蓄積 ) 全身のインスリン抵抗性を惹起する可能性が指摘されているしかしながら脂肪組織線維化が脂肪組織の脂肪蓄積量をどのように制御しているか明らかになっていない本論文では肥満に伴って増加する Mincle が脂肪組織の CLS を構成するマクロファージに局在することを見出した Mincle の活性化は脂肪組織線維化を促進することを明らかにしたまた Mincle による脂肪組織線維化が肝臓の異所性脂肪蓄積に繋がることが示唆された < 方法 > Mincle 欠損 (KO) マウス野生型 (WT) マウスに高脂肪食を負荷し肥満を誘導し肥満における Mincle の役割を検討した脂肪組織の評価として HE 染色免疫染色を実施した脂肪組織における Mincle の発現評価として RT-PCR Mincle 発現細胞の評価として脂肪組織の間質細胞 (stromal vascular fraction : SVF) のフローサイトメトリー解析 in situ hybridization を実施した脂肪組織線維化の評価としてマッソントリクローム染色シリウスレッド染色組織中のコラーゲンの定量を実施した肝臓の評価として HE 染色組織中の中性脂肪含量の測定を実施したまた糖代謝の評価としてインスリン負荷試験ブドウ糖負荷試験を実施したインスリンシグナル評価はインスリン刺激時の脂肪組織肝臓筋肉の Akt リン酸化をウエスタンブロッティング法により検討した Mincle による線維化の分子機構を検討するため既知の Mincle リガンドとして知られる結核菌の構成成分であるトレハロースジミコール酸 (trehalose dimycolate : TDM) を用いて腹腔マクロファージを刺激し RT-PCR にて遺伝子発現を検討した TDM を用いて刺激した腹腔マクロファージの cdna を用いてマイクロアレイ解析を行ったまた組織の活性化線維芽細胞の評価としてαSMA 染色 SVF を用いた培養実験を実施し線維化の分子機構について検討した TDM 又は vehicle を Mincle KO WT マウスの脂肪組織に直接投与し個体レベルで Mincle を活性化させ組織評価と RT-PCR を実施した同様の実験を Col/EGFP マウス (Col1a2 エンハンサー領域に EGFP が発現するマウス ) に実施しコラーゲン産生細胞について検討した < 結果 > 高脂肪食負荷において Mincle KO マウスと WT マウスの間に体重差を認めなかったが Mincle KO マウスは WT マウスと比較して脂肪組織重量が増加する一方で肝重量中性脂肪含量増加は抑制された WT マウスと比較して Mincle KO マウスの脂肪組織では脂肪組織炎症の特徴的な所見である CLS 数の減少を認め間質線維化の抑制脂肪細胞径の増加が認められた脂肪組織 SVF のフローサイトメトリー解析の結果 Mincle はマクロファー - 2 -

3 ジに選択的に発現を認めた in situ hybridization の結果 Mincle は CLS を構成するマクロファージに選択的に発現が認められた Mincle KO マウスは糖負荷試験インスリン負荷試験において WT マウスと比較して良好な糖代謝を示しインスリン刺激時の Akt リン酸化は肝臓で亢進が認められた通常食飼育時は Mincle KO マウスと WT マウスの間に体重糖代謝脂肪組織重量肝重量の差は認められなかった次に Mincle による脂肪組織線維化の分子機構について検討した TDM を用いて WT マウスと Mincle KO マウスの腹腔マクロファージを刺激し遺伝子発現を検討した結果 WT マウスでのみ組織リモデリングに関与する遺伝子 Tgfb1 Pdgfb Timp1 等の発現上昇が認められた TDM 刺激を行った WT マウスと Mincle KO マウスの腹腔マクロファージの cdna を用いたマイクロアレイ解析では WT マウスの腹腔マクロファージで TDM 刺激により上昇する 179 の遺伝子が同定されたパスウェイ解析の結果 TDM 刺激によって上昇した遺伝子群は組織リモデリングに関するクラスターを形成した次に Mincle の活性化による脂肪組織 SVF への影響を検討した SVF はマクロファージ以外にも他の免疫担当細胞線維芽細胞内皮細胞など様々な細胞が存在することが知られている TDM を用いて SVF を刺激すると Mincle Tnfa Pdgfb Timp1 の遺伝子発現が上昇し組織線維化に重要である活性化線維芽細胞のマーカーである Acta2 の発現上昇も認められた次にマクロファージと脂肪組織線維芽細胞との関連を検討するため腹腔マクロファージと SVF の CD45 - CD31 - 細胞分画との共培養を実施した TDM を用いて共培養系を刺激すると経時的に Acta2 の発現上昇を認め遅れて Col1a1 の発現上昇が認められた以上からマクロファージの Mincle の活性化により活性化線維芽細胞が増加しコラーゲンが増加したと考えられた実際高脂肪食を負荷した脂肪組織のαSMA 染色の結果 Mincle KO マウスはαSMA 陽性の活性化線維芽細胞の減少が認められた TDM 又は vehicle を Mincle KO WT マウスの脂肪組織に直接投与し個体レベルで Mincle を活性化させ脂肪組織線維化への影響を検討した結果間質の線維化が WT マウスの TDM 投与群で生じ Mincle KO マウスでは抑制された免疫蛍光染色により TDM 投与群では CLS 形成が確認され周囲にコラーゲンの増加が認められた更に Col/EGFP マウスに同様な検討を行うと TDM 投与によって形成される CLS 周囲に EGFP 陽性細胞の増加が認められた Mincle の活性化により CLS 形成とコラーゲン産生細胞が増加し線維化が誘導されたと考えられた < 考察 > 本論文において非感染性炎症である脂肪組織炎症における Mincle の意義を明らかにしたまた Mincle が脂肪組織線維化を介して異所性脂肪蓄積を促進するという新たな分子機構を見出した CLS は肥満の過程において細胞死に陥った脂肪細胞をマクロファージが貪食処理する像であり脂肪組織炎症の起点となる Mincle は死細胞を認識することが報告されており Mincle の発現局在は CLS を構成するマクロファージに限局して認められたことから肥満 - 3 -

4 脂肪組織において内因性 Mincle リガンドは細胞死に陥った脂肪細胞に由来すると推測される次に Mincle 陽性マクロファージが脂肪組織の線維化にどのように関与するかが重要な問題である既知の Mincle リガンド TDM を用いて腹腔マクロファージを刺激すると既に知られている炎症性サイトカインに加えて線維化関連遺伝子の発現も誘導された様々な組織線維化病態においてマクロファージの重要性が知られているが脂肪組織線維化における役割は不明であった CLS において脂肪細胞とマクロファージは近接していることから相互のクロストークが考えられ CLS は脂肪組織の炎症のみならず線維化の起点であることが示唆される本研究において様々な臓器線維化において主要なコラーゲン産生細胞である活性化線維芽細胞 (αsma 陽性細胞 ) が肥満脂肪組織においても増加していることを見出した即ちマクロファージにおける Mincle の活性化により SVF に含まれる活性化線維芽細胞が増加した従って活性化線維芽細胞は脂肪組織の SVF に由来すると示唆される最近肥満に伴う脂肪組織の線維化により脂肪組織の脂肪蓄積量が制限され異所性脂肪蓄積が増加し全身のインスリン抵抗性や脂肪肝に至ると考えられているがその分子機構は不明であった Mincle KO マウスは高脂肪食負荷により WT マウスと同程度の体重増加を示したが脂肪組織重量がより増加する一方肝重量の増加は抑制されたこれは Mincle が脂肪蓄積の体内バランスを制御していることを示唆する実際 Mincle KO マウスは血清遊離脂肪酸濃度が低下しており脂肪組織から肝臓への脂肪の流れが減少していると想定される Mincle KO マウスでは主に肝臓においてインスリンシグナルが改善しており全身の糖代謝の改善は脂肪肝の軽減によるものと考えられた即ち肥満脂肪組織において Mincle は脂肪蓄積能の新たな制御分子であり肝臓の異所性脂肪蓄積やインスリン感受性も調節していることが明らかになった < 結論 > Mincle は肥満脂肪組織で誘導される CLS を構成するマクロファージに選択的に発現し脂肪組織の線維化を介して脂肪組織の脂肪蓄積能を抑制し肝臓の異所性脂肪蓄積やインスリン抵抗性の誘導に働くことを見出した - 4 -

5 論文審査の要旨および担当者報告番号甲第 4740 号池田賢司論文審査担当者主査下門顕太郎副査鍔田武志竹田秀 ( 論文審査の要旨 ) 1. 論文内容本論文は炎症制御分子 Mincle の脂肪組織線維化における役割を Mincle 欠損マウスを用いて明らかにしたものである 2. 論文審査 1) 研究目的の先駆性独創性脂肪組織の炎症や線維化は脂肪細胞の脂肪蓄積能を低下させ脂肪肝や動脈硬化等の異所性脂肪蓄積による病態を発生させるが線維化のメカニズムは明ではない本研究は申請者の所属するグループが発見した脂肪組織に発現する炎症制御分子 macrophage-inducible C-type lectin (Mincle) の役割を Mincle 欠損マウスを利用した研究で解明しようとしたもので先駆的かつ独創的な研究と言える 2) 社会的意義本研究の主たる所見は以下の通りである 1 脂肪食を負荷した欠損マウスの体重は野生型マウスとは同じであったが脂肪重量は増加し脂肪肝の形成は抑制されインスリン感受性は野生型に比して高かった 2 欠損マウスでは脂肪組織の crown-like structure (CLS) 形成や線維化が抑制されていた 3 野生型では Mincle は CLS を形成するマクロファージに一致して発現していることから腹腔マクロファージを Mincle を誘導する TDM で腹腔マクロファージや脂肪組織のマクロファージを刺激して調べた結果活性化されたマクロファージは Mincle を発現するとともに組織リモデリングにかかわる一群の遺伝子を発現し脂肪組織間質の線維芽細胞の増殖を刺激し線維化を誘導することが明らかになった肥満はインスリン抵抗性糖尿病脂肪肝高血圧動脈硬化の原因となるがその機序については不明な点も多い本研究は脂肪組織の線維化のメカニズムの一端を明らかにし肥満に伴う異所性脂肪蓄積という新しい概念の確立や新規の治療法開発に寄与する意義のある研究である 3) 研究方法倫理観マウスをもちいた動物実験であり慎重に計画実施されている動物の倫理に関する委員会の許可を得て動物実験のガイドインに従い実施されており倫理的にも問題は無い ( 1 )

6 4) 考察今後の発展性脂肪組織の線維化は脂肪組織における脂肪蓄積量を抑制し肝臓等の異所性脂肪蓄積を促進するが Mincle はこの過程に重要な役割をはたしていていると考察している脂肪組織の炎症や線維化の機序解明は肥満に伴う諸疾患の予防治療法の開発に繫がる 3. その他申請者は多施設の複数の研究者による共同研究の結果である本論文の共同筆頭著者であるが主に動物モデルの解析を行い中心的役割を果たした 4. 審査結果以上を踏まえ本論文は博士 ( 医学 ) の学位を申請するのに十分な価値があるものと認められた ( 2 )

「肥満に伴う脂肪組織の線維化を招く鍵分子を発見」【菅波孝祥特任教授】

「肥満に伴う脂肪組織の線維化を招く鍵分子を発見」【菅波孝祥特任教授】解禁時間ﾃﾚﾋﾞﾗｼﾞｵ WEB 平成 26 年 9 月 19 日金午後 6 時日本時間新聞平成 26 年 9 月 20 日土付朝刊平成２６年９月１７日科学技術振興機構ＪＳＴ Tel 03-5214-8404 広報課東京医科歯科大学 Tel 03-5803-5833 広報課肥満に伴う脂肪組織の線維化を招く鍵分子を発見メタボリックシンドローム治療の新たな分子標的