リアルタイム PCR 用試薬 Luna Universal qpcr & RT-qPCR be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

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よしじろうつくとの
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1 リアルタイム PCR 用試薬 Luna Universal qpcr & RT-qPCR be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

用途に最適な qpcr 試薬を提供 -Step RT-qPCR 2-Step RT-qPCR RNA RNA 逆転写 cdna cdna 逆転写 & qpcr Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3006) cdna qpcr DNA

2 用途に最適な qpcr 試薬を提供 -Step RT-qPCR 2-Step RT-qPCR RNA RNA 逆転写 cdna cdna 逆転写 & qpcr Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3006) cdna qpcr DNA DNA ピペッティング分注ミスを防ぐ青色のマスターミックス全ての Luna LunaScript 製品には青色のトラッキングダイが含まれていますトラッキングダイは qpcr 反応やシグナルに影響を及ぼすことはありません補正用ダイが含まれており ROX の添加は不要です青色トラッキングダイ LunaScript RT SuperMix Kit ( 製品番号 E300) Luna Universal qpcr Master Mix ( 製品番号 M3003) Luna Universal Probe qpcr Master Mix ( 製品番号 M3004) -Step: ダイアッセイ用或いはプローブアッセイ用キットを選択 2-Step: LunaScript スーパーミックスとダイアッセイ用或いはプローブアッセイ用マスターミックスを選択 Luna Universal qpcr Master Mix ダイアッセイ用の qpcr マスターミックス * 製品内容 Luna Universal qpcr Master Mix(2X) * SYBR Green と同等のダイ ( 色素 ) が使用されています Luna Universal Probe qpcr Master Mix プローブアッセイ用の qpcr マスターミックス製品内容 Luna Universal Probe qpcr Master Mix(2X) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit ダイアッセイ用のステップ RT-qPCR キット * キット内容 Luna Universal One-Step Reaction Mix Luna WarmStart RT Enzyme Mix * SYBR Green と同等のダイ ( 色素 ) が使用されています M3003S 200 rxns 2,0 M3003L 500 rxns 28,0 M3003X,000 rxns 49,0 M3003E 2,500 rxns 0,000 M3004S 200 rxns,000 M3004L 500 rxns 24,0 M3004X,000 rxns 42,0 M3004E 2,500 rxns 96,000 E3005S 200 rxns 25,900 E3005L 500 rxns 58,500 E3005X,000 rxns 0,500 E3005E 2,500 rxns 225,000 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit プローブアッセイ用のステップ RT-qPCR キットキット内容 Luna Universal Probe One-Step Reaction Mix Luna WarmStart RT Enzyme Mix E3006S 200 rxns 23,500 E3006L 500 rxns 52,0 E3006X,000 rxns 92,500 E3006E 2,500 rxns 204,000 2 LunaScript RT SuperMix Kit RT-qPCR 用に最適化された cdna 合成キット 5 分で cdna 合成ができる便利なスーパーミックス特長わずか 5 分間で cdna 合成液タイプの便利なスーパーミックスで cdna 合成が可能室温でセットアップ可能 E300S 25 rxns 7,500 E300L rxns 53,000 * LunaScript スーパーミックスには Luna 逆転写酵素 Random hexamer Oligo-dT dntps RNase Inhibitor が含まれています * 3 kb 以上の cdna 合成には Protoscript II cdna 合成キット ( E6560S/L) を推奨します

We tested plates and plates of reactions so you don t have to Dots in Boxes で qpcr の結果を正確に評価 NEB は qpcr の結果を正確に評価するため独自の Dots in Boxes 法を開発しましたこの方法では複数の希釈系列を含む実験結果をつのドットとしてプロットします

あるターゲットに対する qpcr について 5 点の希釈系列で反応を行う ( N=3)( 図 : ) テンプレートを入れない系 ( :Non-Template Control) も同時に行うため計 8 反応 ( 6 点 x 3 連 ) を実施することとなる 2.

Standard curve から増幅効率を計算する ( 図 :Standard curve Efficiency) 一般的な qpcr と同様 90 0% を信頼基準とする 4. 5 つの結果項目に基づいて Quality Score を決定する項目および基準を以下に示す Standard curve の直線性 : 相関係数 ( R 2 ) が 0.

3 We tested plates and plates of reactions so you don t have to Dots in Boxes で qpcr の結果を正確に評価 NEB は qpcr の結果を正確に評価するため独自の Dots in Boxes 法を開発しましたこの方法では複数の希釈系列を含む実験結果をつのドットとしてプロットしますこのドットが基準内に収まるか否かによりその qpcr 結果が信頼性を評価しますさらに異なるターゲット領域や様々な条件での実験結果をそれぞれ独立したドットとしてプロットすることもできるため複数の qpcr 結果を同じ図中にプロットして評価することも可能です方法 :. あるターゲットに対する qpcr について 5 点の希釈系列で反応を行う ( N=3)( 図 : ) テンプレートを入れない系 ( :Non-Template Control) も同時に行うため計 8 反応 ( 6 点 x 3 連 ) を実施することとなる 2. 増幅曲線から Δ を算出する Δ とはの平均から最も少ないテンプレート量 ( 最大希釈系列 ) の平均を引いた数値である Δ から感度と非特異的増幅の評価を行う Δ が小さい場合非特異的増幅がおきたことあるいは感度が満たされていないことが示唆される Δ >3 を信頼基準とする 3. Standard curve から増幅効率を計算する ( 図 :Standard curve Efficiency) 一般的な qpcr と同様 90 0% を信頼基準とする 4. 5 つの結果項目に基づいて Quality Score を決定する項目および基準を以下に示す Standard curve の直線性 : 相関係数 ( R 2 ) が 0.98 以上再現性 : 各テンプレート量 ( 希釈系列 ) の N=3 のが以内蛍光強度の一定性 : エンドポイントの蛍光強度 ( max ) が平均値が 20% 以内増幅曲線の傾き : 立ち上がりからプラトーに達するまでのが 0 以内増幅曲線の形状 :Sigmoid となっている Dots in Boxes を用いた qpcr の結果評価 Standard curve Log Starting Quantity (pg) R 2 = Efficiency = 95.% Log Starting Quantity (pg) Triplicate standards 5 pg 50 ng total RNA 50 ng 5 ng 0.5 ng 50 pg 5 pg qpcr performance dot plot Efficiency (%) Fail Pass Quality score Pass = () (5 pg) Quality score Pass: quality score 5 Fail: quality score Quality Score 項目 :. 相関係数 ( R 2 Standard curve) 2. 再現性 ( のばらつき ) 3. 蛍光強度 ( max ) 4. 増幅曲線の傾き 5. 増幅曲線の形状 Standard curve( 左上 ) から求められた増幅効率 ( Efficiency) を Dot Plot の Y 軸に増幅曲線 ( 左下 ) から求めた Δ を X 軸に反映してプロットするドットが緑色点線で示された基準内にプロットされていることから増幅効率と感度に信頼性があることが示されるさらに上記 5 つの Quality Score 項目の評価結果をドットの大きさと色で示す信頼性が高い場合緑色の大きなドットがプロットされるこの評価方法は MIQE qpcr/ RT-qPCR ガイドラインに基づく (Bustin, S.A. et al. (2009) Clin. Chem. 55, 6-22 and Trombley Hall, A. et al. (203) PLoS One 8(9):e73845) 増幅が良好にできていない場合緑点線の基準外にプロットされるまたは小さい白色のドットが表示される 3

Experience best-in-class performa すべての NEB 製品は最高の性能を発揮するために厳密な品質管理をおこなっていますが Luna リアルタイム PCR 試薬も例外ではありません特異性感度正確性再現性などの qpcr に重要な因子を徹底して調べ上げることによりクラス最高の試薬を提供していますさらに qpcr 結果や試薬性能を正確に評価できる dots

4 Experience best-in-class performa すべての NEB 製品は最高の性能を発揮するために厳密な品質管理をおこなっていますが Luna リアルタイム PCR 試薬も例外ではありません特異性感度正確性再現性などの qpcr に重要な因子を徹底して調べ上げることによりクラス最高の試薬を提供していますさらに qpcr 結果や試薬性能を正確に評価できる dots in box 法を開発することにより厳密な比較評価ができるようになりました Luna リアルタイム PCR 試薬はすべてのターゲットの確実かつ正確な測定を可能にします高い感度と再現性 n = 8 Input 20 ng 2 ng 0.2 ng 20 pg 2 pg 0.2 pg R 2 = Standard curve Efficiency = 96.6% Quantity (pg) 0.2 pg - 20 ng の広範囲の cdna から高い再現性で検出ができるトータル RNA から ProtoScript II First Strand cdna Synthesis Kit( 製品番号 E6560S) で cdna を合成 Luna Universal qpcr Master Mix でヒト GAPD をターゲットとした qpcr を行った ( N=8) 高い特異性と安定した性能 Targets passing performance criteria (%) % NEB 67% B 社 6% R 社 47% Q 社 47% A 社 Bio-Rad real-time instrument 4% P 社 % NEB ABI real-time instrument 47% A 社 Quality Score pass Efficiency (%) Δ Δ Jurkat ゲノム DNA または cdna をテンプレートとして様々なコピー数長さ GC 含量の 6-8 領域を対象にリアルタイム PCR を行った ( 0 個のゲノム DNA ターゲットと 8 個の cdna ターゲットを Bio-Rad 社リアルタイム機器で 9 個のゲノム DNA ターゲットと 7 個の cdna ターゲットを ABI 社リアルタイム機器で測定 ) 各社試薬の推奨条件に従い 2 名が個別に実験を行った増幅効率感度 ( 低インプットの検出 ) 非特異的増幅の有無について結果を評価した (Δ = 最低インプットの平均非テンプレートコントロールの平均 ) また一貫性と再現性増幅曲線の信頼性を Quality Score として評価に加えた 4

nce for your qpcr & RT-qPCR 様々なゲノム DNA からターゲット遺伝子を正確に定量 Mouse kidney β-actin Tobacco leaf PsbB Standard curve E = 96.% Melt curve E = 97.9% R 2 = 0.998 Rep (-Rn ) R 2 = 0.

5 nce for your qpcr & RT-qPCR 様々なゲノム DNA からターゲット遺伝子を正確に定量 Mouse kidney β-actin Tobacco leaf PsbB Standard curve E = 96.% Melt curve E = 97.9% R 2 = Rep (-Rn ) R 2 = Rep (-Rn ) Quantity (ng) Quantity (ng) Yeast 8S 0.5 pg - 50 ng の様々なゲノム DNA をテンプレートとして ABI 7500 FAST real-time 機器で qpcr を行ったゲノム DNA は一般的なカラムで精製したマウス腎臓由来ゲノム DNA から ACTB(β-actin) タバコゲノム DNA から psbb(photosystem II CP47 reaction center protein PsbB) 酵母ゲノム DNA から RDN8(8S ribosomal RNA) が高感度かつ特異的に定量できることが示された E = 90.2% R 2 =.000 Rep (-Rn ) Quantity (ng) プローブ法とインターカレーターダイ法の違い選択のヒント qpcr の測定には主に 2 種類の方法が使用されていますつ目はインターカレーターダイを使用する方法であり 2 本鎖 DNA に結合することで蛍光を発します 2 つ目は蛍光物質をラベルしたプローブを使用する方法でありターゲット領域にアニールした蛍光プローブが分解されることでクエンチャー効果が解除されて蛍光を発しますインターカレーターダイ法では特別なセットアップが必要ないためコスト的メリットがありますただしダイは反応中のすべての 2 本鎖 DNA を検出するためオフターゲットや非テンプレート増幅 ( ) も検出され結果として不正確な定量を招くことがありますそのため PCR 後にメルトカーブを確認して非特異的増幅が起きていないことを確認することが重要となりますまたダイ法では種類のターゲットの検出定量が可能ですが複数のターゲットの同時測定はできませんプローブ法はターゲット領域中の DNA 配列に特異的な蛍光プローブを作成する必要がありプライマーとは別途反応に添加する必要がありますしかしながらターゲットだけを認識は認識しないためより高い特異性をもった検出定量が可能となりますまたターゲット毎に異なる蛍光プローブを作成することにより複数ターゲットの同時検出が可能となります 5

-Step RT-qPCR に最適な NEB の WarmStart テクノロジー Luna RT-qPCR キットには in-silico でデザインした逆転写酵素が使用されていますまた Luna WarmStart Reverse Transcriptase と Hot Start Taq DNA Polymerase には 45 以下で酵素に結合するアプタマーが使用されているため

n = 8 2 4 6 8 0 2 4 6 8 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Input μg 0. μg 0 ng ng 0. ng 0 pg pg 0. pg Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit( 製品番号 E3005) を用いてワンステップ RT-qPCR を行ったところ 0.

逆転写酵素による室温セットアップ中の非特異的増幅の抑制 GAPDH (FAM) Input μg Luna One-Step RT-qPCR の通常反応と室温で 24 時間インキュベート後の反応のメルトカーブ 0. 0.0 40 35 30 25 20 5 2 6 0 4 8 22 26 30 34 38 42 Standard curve 0 0.

6 -Step RT-qPCR に最適な NEB の WarmStart テクノロジー Luna RT-qPCR キットには in-silico でデザインした逆転写酵素が使用されていますまた Luna WarmStart Reverse Transcriptase と Hot Start Taq DNA Polymerase には 45 以下で酵素に結合するアプタマーが使用されているため反応前には酵素活性が抑制されますこの WarmStart /HotStart により非特異的増幅を抑制する上室温でのセットアップを可能としますさらに Luna WarmStart Reverse Transcriptase は熱安定性が高く高温でも高い酵素活性を維持します高い感度と再現性 0 0. n = Input μg 0. μg 0 ng ng 0. ng 0 pg pg 0. pg Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit( 製品番号 E3005) を用いてワンステップ RT-qPCR を行ったところ 0. pg - µg の広範囲のトータル RNA から増幅定量ができることが示されたヒト GAPD をターゲットとして N=8 で RT-qPCR を行った逆転写反応は 55 0 分間サイクル条件は推奨プロトコールに従った図中のはテンプレートを入れていない区分 (non-template control) を示す複数ターゲットの同時検出 WarmStart 逆転写酵素による室温セットアップ中の非特異的増幅の抑制 GAPDH (FAM) Input μg Luna One-Step RT-qPCR の通常反応と室温で 24 時間インキュベート後の反応のメルトカーブ Standard curve Log Quantity (pg) GAPDH (FAM) Efficiency = 99.2% R 2 =.000 L32g (HEX) Efficiency = 0.5% R 2 =.000 SMG (Cy5) Efficiency = 98.% R 2 =.000 L32g (HEX) SMG (Cy5) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit( 製品番号 E3006) を用いたワンステップ RT-qPCR により 3 種類のターゲットを同時に増幅したところいずれも良好に増幅定量できることが示された 0. pg - µg の Jurkat トータル RNA をテンプレートとしたターゲットはヒト GAPDH Ribosomal Protein L32g Pl3-Kinas-Related Kinase SMG であるそれぞれ異なるコピー数であるため異なるプライマー濃度を使用した ( 低コピーの SMG は 0.4 µm 高コピーの GAPDH と L32g は 0.2 µm) 各ターゲットのプローブには異なる蛍光を使用した μg 0 ng ng 0. ng 0 pg pg Reporter (-Rn ) T 社製品の通常反応と室温で 24 時間インキュベート後の反応のメルトカーブ Reporter (-Rn ) 反応溶液を調製した後すぐに RT-qPCR を行ったものと室温で 24 時間インキュベートしてから RT-qPCR を行ったもので増幅産物のメルトカーブを解析した結果 NEB の Luna では非特異的増幅が完全に抑制されていることが示された一方 WarmStart ではない逆転写酵素を使用している T 社製品では 24 時間後に反応を行った場合に多数のピークが観察されたことから室温下で非特異的増幅が起こったことが示された Jurkat トータル RNA をテンプレート ( 5 系列の量 ) ヒト Ribosomal protein L32 をターゲットとした

リアルタイム PCR 用 cdna 合成スーパーミックス RT-qPCR の反応は -Step と 2-Step に大別されます前者はシングルチューブで逆転写反応と qpcr を一度に行う反応後者は逆転写反応 ( cdna 合成 ) と qpcr を個別に行う反応です 2-Step RT-qPCR には逆転写酵素と qpcr 試薬を個別かつ自由に選択できるため qpcr 効率の向上や

Murine RNA Inhibitor が含まれているため RNA サンプルを入れるだけで cdna 合成反応がセットアップできることに加え青色色素が含まれているためピペッティングや分注ミスを低減することができますさらに Luna 逆転写酵素は高い温度耐性があるため ( 55-65 ) RNA の二次構造を乖離して確実に cdna を合成します LunaScript RT

ERCC0030, ERCC Spike-In Mix RNA n = 3 Efficiency: 96.3% 0 2 0 0 20 30 40 s Input µg ng 0 ng ng pg 0 pg pg 0 3 n = 3 Efficiency: 99.

7 リアルタイム PCR 用 cdna 合成スーパーミックス RT-qPCR の反応は -Step と 2-Step に大別されます前者はシングルチューブで逆転写反応と qpcr を一度に行う反応後者は逆転写反応 ( cdna 合成 ) と qpcr を個別に行う反応です 2-Step RT-qPCR には逆転写酵素と qpcr 試薬を個別かつ自由に選択できるため qpcr 効率の向上や反応の最適化などがしやすく特に RNA テンプレート量が少ない場合や -Step で難しい場合に効果的です LunaScript RT SuperMix Kit は 2-Step RT-qPCR 用に最適化された cdna 合成キットでありわずか 5 分で cdna 合成ができる便利なマスターミックス試薬です Luna 逆転写酵素とランダムヘキサマーオリゴ dt プライマー dntps Murine RNA Inhibitor が含まれているため RNA サンプルを入れるだけで cdna 合成反応がセットアップできることに加え青色色素が含まれているためピペッティングや分注ミスを低減することができますさらに Luna 逆転写酵素は高い温度耐性があるため ( ) RNA の二次構造を乖離して確実に cdna を合成します LunaScript RT SuperMix Kit で合成した cdna はそのまま Luna qpcr マスターミックスで qpcr を行うことができます他の qpcr 試薬にも互換性がありますが正確かつ確実な 2-Step RT-qPCR には Luna シリーズの併用をお薦めします高い感度直線性再現性で 2-Step RT-qPCR が可能 A. β-actin, human total RNA B. ERCC0030, ERCC Spike-In Mix RNA n = 3 Efficiency: 96.3% s Input µg ng 0 ng ng pg 0 pg pg 0 3 n = 3 Efficiency: 99.4% s Input copies 5x0 9 5x0 8 5x0 7 5x0 6 5x0 5 5x0 4 5x0 3 5x0 2 5x0 幅広いレンジの RNA から cdna を合成して qpcr を行ったところ良好に増幅定量できることが示されたヒトトータル RNA( pg - µg) をテンプレート β-actin をターゲットとしたまた 50 コピーから 5 x 0 9 コピー ( 0 fg - 0 ng に相当 ) の ERCC(External RNA Controls Consortium)RNA スパイクインをテンプレートに使用した 20 µl の反応中標準条件 ( 25 /2 分 55 /0 分 95 / 分 ) で cdna 合成を行い反応産物の µl を使用して Luna Universal qpcr Master Mix( 製品番号 M3003) で qpcr を行った様々なターゲットの cdna を確実に合成わずか 5 分間で cdna 合成 Efficiency (%) Dye-based detection Probe-based detection LunaScript B 社キット T 社キット LunaScript LunaScript T 社キット T 社キット B 社キット B 社キット B 社キット Q 社キット Q 社キット T 社キット Time (min) Temp. ( C) 各社キットの推奨プロトコールに基づく cdna 合成時間を示す LunaScript RT SuperMix は短い時間かつ高い温度 ( ) で cdna 合成が可能である Targets passing performance criteria Cq 95% 73% 60% 95% 各社 cdna 合成キットでヒトトータル RNA( pg - µg) から cdna を合成して qpcr 解析を行ったところ NEB の LunaScript が最も高い信頼性で測定できることが示された GC 含量コピー数サイズが異なる 8 種類のターゲットを対象として 2-Step RT-qPCR を行い Dots in Boxes 法で結果をプロットした cdna 合成は各社推奨プロトコールに従った緑色の点線内に収まっているドットが高い増幅効率 ( 90-0%) と感度 ( Δ >3) であることを意味しているドットの色はターゲットの違いを示す青色のトラッキングダイが含まれています 7

qpcr 用途に最適な試薬を選択アッセイ方法を 2 選択ダイアッセイプローブアッセイ DNA または RNA を選択ゲノム DNA/ cdna Luna Universal qpcr Master Mix ( 製品番号 M3003) Luna Universal Probe qpcr Master Mix ( 製品番号 E3004) RNA Luna Universal

8 qpcr 用途に最適な試薬を選択アッセイ方法を 2 選択ダイアッセイプローブアッセイ DNA または RNA を選択ゲノム DNA/ cdna Luna Universal qpcr Master Mix ( 製品番号 M3003) Luna Universal Probe qpcr Master Mix ( 製品番号 E3004) RNA Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit ( 製品番号 E3006) NGS ライブラリー定量キット ( qpcr) も提供しています NEBNext Library Quant Kit for Illumina 詳細はウェブサイト ( を参照 Your purchase, acceptance, and/or payment of and for NEB s products is pursuant to NEB s Terms of Sale at com/support/terms-of-sale. NEB does not agree to and is not bound by any other terms or conditions, unless those terms and conditions have been expressly agreed to in writing by a duly authorized officer of NEB. BIORAD is a registered trademark of BioRad Laboratories. SYBR is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific. ニューイングランドバイオラボジャパン株式会社東京都墨田区江東橋倉持ビル第 2 カスタマーサービス TEL: FAX: テクニカルサポート TEL: FAX: tech.jp@neb.com ウェブサイト :

■リアルタイムPCR実践編

■リアルタイムPCR実践編リアルタイム PCR 実践編 - SYBR Green I によるリアルタイム RT-PCR - 1. プライマー設計 (1)Perfect Real Time サポートシステムを利用し設計済みのものを購入するヒトマウスラットの RefSeq 配列の大部分については Perfect Real Time サポートシステムが利用できます目的の遺伝子を検索して購入してください (2) カスタム設計サービスを利用する