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ちかこわにべ
5 years ago
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1 1 γ- グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) の新規阻害剤京都大学化学研究所生体機能化学研究系生体触媒化学研究領域助教渡辺文太

2 2 γ- グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) とはグルタチオン ( -Glu-Cys-Gly) およびその抱合体の γ- グルタミル結合を加水分解する酵素 -Glu-Cys-Gly + H 2 Glu + Cys-Gly ( 加水分解 ) -Glu-Cys-Gly + X -Glu-X + Cys-Gly ( ペプチド転移 ) X = アミノ酸ペプチドアミン類ほ乳類や植物微生物までほとんどあらゆる生物に普遍的に存在

3 3 グルタチオン (GSH) とは GGT H N N H SH グルタミン酸システイングリシンイソペプチドの一種重金属やアルキル化剤活性酸素種など生体異物の解毒生体内の酸化還元バランスの調節

4 4 グルタチオン代謝酵素としての GGT Glu Cys Gly (GSH) Glu + GSH GGT GST X Glu Cys Gly γ GCS Glu Cys Cys GS Cys + Gly Gly GS X GSH/GSSG/G S X MR GR GSH GSSG GX GSH/GSSG/GS X

5 5 GGT の生理的意義グルタチオンを加水分解し細胞のグルタチオン生合成に必要なシステインを供給するグルタチオン抱合体を代謝し生体異物を解毒するグルタチオン代謝により生体の酸化還元バランスを調節する

6 6 GGT の pro-oxidant 効果グルタチオン ( -Glu-Cys-Gly) の分解産物であるCys-Glyは極めて活性なチオールであり生理的条件下で金属イオンを介して容易に酸素を還元し活性酸素種を作り出す GGT 活性の増大はかえって酸化ストレスを亢進させることにつながる BioFactors, 17, 187 (2003).

7 7 GGT と疾病 (1) 過度のアルコール摂取や薬物により肝臓での GGT 発現および血中への漏出が顕著に起こる肝疾患やアルコール依存症のマーカー酵素 (γ-gt) Crit. Rev. Clin Lab. Sci., 38, 263 (2001). 心筋梗塞や狭心症などの心血管疾患 2 型糖尿病において血中 GGT 活性の上昇は危険因子である Circulation, 112, 2130 (2005). Atherosclerosis, 194, 498 (2006). Eur. Heart J., 27, 2170 (2006). J. Intern. Med., 258, 527 (2005).

8 GGT と疾病 (2) ピロリ菌のGGTは病害性因子として胃壁細胞のアポトーシスを誘導する Mol. Mocrobiol., 47, 443 (2003). GGTは骨再吸収因子として関節炎や骨粗鬆症に関与する Endocrinology., 148, 2708 (2007). ガン細胞では GGT を高発現するものが多く抗がん剤や放射線療法に対する耐性獲得や転移活性との関係が示唆される roc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3070 (1992). Carcinogenesis, 20, 553 (1999). Biochem. harmacol., 71, 231 (2006). 8

9 9 本研究の目的 GGT の生理的役割を明確にするため選択的 GGT 阻害剤を開発する各種疾病と GGT 活性との具体的グルタチオン代謝を通した生体防御な関係は? 酸化ストレスの亢進

10 10 従来の GGT 阻害剤 N Cl アシビシン (AT-125) Streptomyces sviceus の産生する抗生物質グルタミン代謝拮抗剤としてグルタミンアミドトランスフェラーゼ (GAT) 類に広く作用する多くのグルタミン依存性酵素を阻害し強い細胞毒性や中枢神経毒性を示す

11 11 アシビシンの問題点低い GGT 選択性とそれに起因する毒性 GGT 阻害による影響を正確に評価できない GGT 選択性を向上させるための分子設計 GGT の触媒機構に着目

12 12 阻害剤の分子設計 GGT の触媒機構 NHR H-GGT - TS1 - NHR GGT H 2 NR GGT H 2 - TS2 - GGT NHR H + H-GGT 遷移状態アナログ阻害剤 Me X H-GGT Me GGT + H X

13 阻害剤の合成 Br Et C C 2 Et 2 Et Et 2 C + Et 2 C Et AcHN Et AcHN Na + (E t) 2 C, toluene rfx Et 1) 6N HCl, rfx 2) propylene oxide (97%) H H 1) Cbz-C l, NaH 2) B nh, S Cl 2 (64%) CbzHN C 2 Bn H H (CCl) 2, DMF CH 2 Cl 2 CbzHN C 2 Bn Cl Cl MeH Et 3 N, -65ºC CbzHN C 2 Bn Cl Me + H X Et 3 N 0ºC (31~54%) CbzHN C 2 Bn Me X H 2, d/c or AlCl 3 (48~70%) Me X

14 阻害活性の測定 H N γ-glu-amc Me GGT H + Me 7- アミノ -4- メチルクマリン (AMC) 100 mm コハク酸 -Na (ph 5.5) 4.0 or 0.2 M -Glu-AMC 阻害剤ヒト GGT or 大腸菌 GGT AMC nm [I] = 0 M 蛍光測定 5 励起波長 :350 nm 蛍光波長 :440 nm Time sec GGT の時間依存的失活 14

15 15 阻害活性の評価酵素と阻害剤との 2 次反応速度定数 k on を阻害活性の指標とする E + S E S E [I] = 0 M 10 V inact = k on [E] [I] E-I AMC nm k on が大きいほど酵素が速やかに失活する強い阻害剤である Time sec GGT の時間依存的失活

16 16 ヒトおよび大腸菌 GGT に対する阻害活性 Me X H-GGT Me GGT + H 脱離基 X No X pk a k on [M -1 s -1 ] k on [M -1 s -1 ] No. X pk a ヒト大腸菌ヒト大腸菌 4-Me Me CF H N CH CN CH N Cl N ( アシビシン ) Cl (HCl)

17 17 ブレンステッドプロットヒト GGT 大腸菌 GGT Me pk on 化合物 5 pk on pk a pk a

18 18 活性中心についての考察ヒト GGT 大腸菌 GGT H 3 N + C 2 H N δ - δ - Thr N H SH C 2 H X + H 3 N + C 2 H N δ - δ - Thr N H SH C 2 H 3 N + C 2 H Me Thr C 2 H X + H 3 N + C 2 H Me Thr X ヒト GGT はグルタチオン C 末端の負電荷を厳密に認識している

19 19 水溶液中での安定性 No. 構造 k on ( ヒト GGT) D 2 ( 室温 /12 時間 ) 備考 5 51 分解せず D 2 中室温で 1 ヶ月後も安定 Me 11 Me CN 46 12% 分解 12 Me N % 分解 NaHC 3 :100% 分解 CD 3 C 2 D 中 :40% 分解 CF 3 C 2 D または DCl: 24 時間後も安定 ( いずれも 1M)

20 20 化合物 5 の特徴 GGT 選択性 GAT( アスパラギン合成酵素のグルタミナーゼドメイン ) を全く阻害しない (10 mm 2 時間 ) 安全性アシビシンは 0.1 mm の濃度で GAT を 90% 以上失活させる雌雄マウスに対して急性毒性を示さない (100 mg/kg 単回静脈内投与 2 週間観察 ) エイムス試験において変異原性を示さない

21 21 まとめ Me GGT の新規阻害剤を開発した阻害活性 ( ヒト GGT) 選択性安全性の面で既存の GGT 阻害剤であるアシビシンより優れる

22 22 想定される業界試薬メーカー用途 : グルタチオン代謝に関する基礎研究全般に有用な生化学用試薬

23 23 本技術に関する知的財産権発明の名称 : ホスホン酸ジエステル誘導体およびその製造方法出願番号 : 特願出願人発明者 : 国立大学法人京都大学 : 平竹潤坂田完三韓立友

24 24 お問い合わせ先関西 TL 株式会社アソシエイト大西晋嗣 TEL FAX

PowerPoint プレゼンテーション

PowerPoint プレゼンテーション酵素 : タンパク質の触媒タンパク質 Protein 酵素 Enzyme 触媒 Catalyst 触媒 Cataylst: 特定の化学反応の反応速度を速める物質自身は反応の前後で変化しない酵素 Enzyme: タンパク質の触媒触媒作用を持つタンパク質第 3 回 : タンパク質はアミノ酸からなるポリペプチドである第 4 回 : タンパク質は様々な立体構造を持つ第 5 回 : タンパク質の立体構造と酵素活性の関係