東京都健康安全研究センター研究年報

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かんじおおばま
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1 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 加工食品中の特定原材料 ( そば ) の分析 Analysis of Allergic Substances (Buckwheat) in Processed Foods Hiroko MATSUMOTO, Kayo HAGINO, Narue SAKAMAKI, Mitsuo NAKAZATO and Kazuo YASUDA Keywords buckwheat allergy allergic substances ELISA method PCR PCR test 緒言 ,3) ( ) ELISA ELISA PCR ELISA 4,5) 5 DNA 実験方法 1. 試料. 試薬 ELISA ( ) FASTKIT N ( ) M DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit DNA Applied Biosystems AmpliTaq Gold PCR PCR PCR Cambrex NuSieve GTG agarose SeaKem GTG agarose DNA Amersham Biosciences 50Base-Pair ladder 100Base-Pair ladder TBE PCR 3. 機器 IMF 700G IKA T5 HF93 Oster OsterizerTECAN SUNRISE CLASSIC DTU UV-1600 Applied Biosystems Gene Amp PCR System Tama Branch Institute, Tokyo Metropolitan Institute of Public Health , Shibasaki-cho, Tachikawa, Tokyo Japan

2 18 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 Mupid- 4. そばタンパク抽出法及び ELISA 検査 1) そばタンパク抽出法 : g 38 ml 3 0,500 rpm ,000 g ) ELISA N M 5. そば DNA 抽出法及び PCR 検査 1) そば DNA 抽出法 g 1 g 30 ml DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit DNA DNA ) DNA 試料液の濃度および精製度の測定 DNA 60 nm 80 nm DNA 60 nm 1 DNA 50 ng/µl DNA 60 nm 80 nm 60 nm/80 nm PCR 1..5 DNA 0 ng/µl 0 ng/µl DNA 3) PCR 反応液組成 PCR 1 PCR Applied Biosystems 0. mmol/l dntp 1.5 mmol/l 0. µmol/l F- 0. µmol/l R units/µl DNA DNA 0 ng/µl.5 µl 5 µl 4) PCR 反応条件 ) 電気泳動 0.5 µg/ml NuSieve GTG agarose SeaKem GTG agarose(1:1) 0.5 µg/ml TBE 100V UV31 nm PCR DNA 14bp 17bp 6. 加熱調理実験 ELISA PCR. 7. 加工食品及び麺類中のそばの検査 ELISA PCR DNA 8. そばゆで汁からのそば抗原タンパクのうどんへの移行実験 50 g 4 L 4 3 L 50 g L 3 3 ELISA PCR 結果及び考察 1. 抽出法の検討 1) そばタンパク抽出法

3 55, 表 1. 各種抽出用器具によるそば抗原タンパク抽出量抽出用器具回転数 (rpm) 抽出時間抽出容器そば抗原タンパク量 CV (%) (µg/g) 1 ミルサ- 0,000 30sec 3 回ガラス専用容器 1, ホモジナイザ- 1,000 5min 3 回ステンレス専用容器 1, シャフトジェネレーター付きホモジナイザー 0,500 30sec 3 回 PP 製遠沈管 1, オスタ - ブレンダ - 16,800 45sec 3 回ガラス専用容器 1, n=3 n=3 94 CV 3 ) そば DNA 抽出法 CTAB CTAB DNA DNA DNA DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit. 加熱処理による検査への影響 ELISA ELISA ELISA ELISA PCR DNA 3. 加工食品中のそばの検査 ELISA ELISA PCR 30 3 表. そばの加熱処理による ELISA 及び PCR 検査結果加熱処理条件 ELISA 法水分含量 ( 粗脂肪 ) 生そば100に対するそば抗原タンパク量 (%) (%) N 社キット M 社キット PCR 法 A 生そば B 蒸す 10 分 C ゆでる 3 分 D 炒める 5 分 ( ゆでそば ) 0.(0.06) E 加圧加熱分 ( オートクレーブ ) F 揚げる分 (5.1) G 焼く分 ( オーブン )

4 130 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 表 3. そば加工食品中のアレルギー物質検査 ELISA 法 No. 品名そば抗原タンパク量 ( µg/g) N 社キット M 社キット PCR 法 1 そば粉 1 170, ,000 + そば粉 87,000 30, 生そば 19,000 44, 揚げそばそば粉入り韓国冷麺そば粉入りパスタ 14,000 6, そば雑炊 ( レトルト ) 発芽玄米入りそば粥 ( フリーズドライ ) 634 4, そばまんじゅうそばおやきの皮 ( 野沢菜入り ) 1,700 1, そばおやきの具 ( 野沢菜入り ) そば茶 ( 実 )1 1. ND + 13 そば茶 ( 実 ) そばの実入り紅茶 ND ND + 15 そばチップそばせんべい 1,600 1, そばぼうろそばかりんとうそばクッキー 1 1,500 1, そばクッキーそばラスク 1, そばようかんそばチョコレートそばあめ 1,800, そばはちみつ ND そば新芽そば七味唐辛子ペットボトル入りそば茶 ND ND + 9 そばビール ND ND + 30 そば焼酎 ND ND - ND:1 µg/g 未満 10 µg/g µg/g ELISA PCR DNA DNA DNA PCR 4.ELISA 検査の偽陽性に対する PCR 法での確認 ELISA 4,5) N ELISA N 13.8 µg/g M.6 µg/g PCR 1 ELISA ELISA PCR

5 55, 植物プライマーそばプライマー A B C D E F C D E F A 図 1.ELISA 検査で偽陽性を示した試料の PCR 法での確認 A:50bp ladder, B:100bp ladder, C: そば粉 D: 小倉ようかん, E: そばようかん, F: 陽性コントロール 5. 麺類の検査 4 ELISA 4 1 PCR 6. そばゆで汁からのそば抗原タンパクのうどんへの移行 4 5 µg/g まとめ ELISA PCR DNA ELISA PCR 1 µg/g DNA ELISA 表 4. 市販麺類の検査結果麺の種類検体数陽性検体品名表示の有無 ELISA 法そば抗原タンパク量 (µg/g) N 社キット M 社キット PCR 法生うどんゆでうどん細生うどん無生うどん無 1.3 ND / 手打ち生うどん無 / 手練れ生うどん無 / 手打ちうどん ( 生 ) 無 ( 注意喚起 ) ND 1. / ゆでうどん無ゆでうどん無 ND.0 + 中華麺生ラーメン無生中華麺 a 無生中華麺 b 無 1. ND / 卵麺無 1.1 ND / 生中華麺 c 無 1.1 ND / その他の麺 6 1 韓国冷麺有計 4 13 ND:1µg/g 未満 /: 未試験

6 10 そば抗原タンパクばゆで汁原液13 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 µg/g 10 そ希釈量40 0 ゆで汁太麺 µg/g 希40 釈1 ゆ1 でそばゆで汁でうどんをゆでた時のそば抗原タンパクの移行汁図そばゆで汁原液細麺処理条件 1. ゆで汁原液でゆでた直後. 水に漬ける 3. 流水にさらす 1 希釈ゆで汁でゆでた直後水に漬ける 3 流水にさらす文献 1) (001) ) (001) 3) (00) 4) )

東京都健康安全研究センター　研究年報59号

東京都健康安全研究センター　研究年報59号食品中の特定原材料 ( 乳, 卵, 小麦, そば ) の検査事例 - 平成 19 年度 * - 下井俊子, 茅島正資, 観公子, 井部明広東京都健康安全研究センター研究年報第 59 号別刷 2008 東京健安研セ年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. Pub. Health, 59, 229-234, 2008 食品中の特定原材料 ( 乳, 卵, 小麦, そば ) の検査事例