ISOSPIN Plasmid

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ほのかながだき
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1 プラスミド DNA 抽出キット ISOSPIN Plasmid マニュアル ( 第 5 版 ) Code No NIPPON GENE CO., LTD.

2 I 製品説明 ISOSPIN Plasmid( アイソスピンプラスミド ) はスピンカラムを用いて簡単に大腸菌から高純度なプラスミド DNA を抽出できるキットです本キットはカオトロピックイオン存在下で DNA がシリカへ吸着する原理を応用しておりフェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用しません使用するスピンカラムはカラム容積を最大限確保しており内封されたシリカゲル膜は充分な DNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています本キットを使用して得られたプラスミド DNA は制限酵素反応形質転換シークエンスなどの分子生物学実験に使用することができます II キット内容キット内容品 (100 回用 ) 備考 IS1 Buffer 30 ml 1 本 IS2 Buffer 30 ml 1 本 IS3 Buffer 40 ml 1 本 ISPW Buffer 60 ml 1 本 ISW Buffer 100 ml 1 本 ISE Buffer 10 ml 1 本組成 :10 mm Tris-HCl (ph 8.5) RNase A (100 mg/ml) 60 μl 1 本 Spin Column 50 本 2 袋上部パーツ : カラム下部パーツ :Collection Tube 次ページの<キットをはじめて使用する際の準備 > 参照 III 保存室温保存 RNase Aは室温保存可能ですが長期間使用しない場合は冷蔵保存もしくは冷凍保存 (-20 ) して下さいまた RNase A 添加後の IS1 Buffer は冷蔵保存して下さい ISW Buffer にはエタノールが含まれていますご使用後は蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め保管して下さい 1

3 IV 使用上の注意本品は試験研究用試薬ですので医薬品その他の目的にはご使用になれません試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい本品の取り扱いはマニュアル記載内容通りに行って下さいマニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては弊社では責任を負いかねます製品安全性データシート (MSDS) につきましてはニッポンジーンホームページをご覧下さい V プロトコール <キット以外に必要な器具機器など> マイクロピペットピペットチップ 1.5 ml マイクロチューブ遠心分離機 <キットをはじめて使用する際の準備 > キットの中の RNase A (100 mg/ml) を IS1 Buffer の中に全量添加し混合する IS1 Buffer のボトルラベルに RNase Aを添加したことを書いておく (RNase A 添加後の IS1 Buffer は冷蔵保存して下さい ) < 抽出に使用する大腸菌培養液の準備 > 抗生物質を含む LB 寒天培地からシングルコロニーを取り同じ抗生物質を含む LB 液体培地へ接種し 37 の振とう培養器で一晩 (12~16 時間 ) 培養する長時間培養すると細胞が溶解するため培養は長時間行わないようにする本キットでは 1 回あたり 1~5 ml の LB 培地から高コピープラスミドの抽出を行う ( 低コピープラスミドの場合 1~10 ml の LB 培地から抽出する ) 例 ) 高コピープラスミド :puc 系ベクターなど低コピープラスミド :pbr 系ベクターなど < 抽出プロトコールを始める前の確認 > IS1 Buffer に RNase Aが添加済みであるか確認する IS2 Buffer に沈殿が見られた場合 37 で保温し沈殿が完全に溶解してから使用する 2

4 < 抽出プロトコール > 1 37 で一晩 (12~16 時間 ) 振とう培養した大腸菌培養液を mlマイクロチューブに移して遠心 (10,000 g 5 分間室温 ) し上清を捨てて大腸菌の沈殿を回収する注 ) 使用する液量は前ページの < 抽出に使用する大腸菌培養液の準備 > 参照 2 大腸菌の沈殿に IS1 Buffer(RNase A 添加済み ) を 250μl 加えボルテックスまたはピペッティングにより大腸菌の塊がなくなるまで懸濁する 3 IS2 Buffer を 250μl 加え溶液が透明になるまで 4~6 回穏やかに転倒混和する注 ) ゲノム DNA が切断されるのでボルテックスなど激しい撹拌はしないまたこのステップは 5 分間以上行わないようにする 4 IS3 Buffer を 350μl 加え溶液が完全に混合するように 4~6 回転倒混和する注 ) ボルテックスなどの激しい撹拌はしない 5 遠心 (12,000 g 10 分間室温 ) する 6 メンブレンに DNAを吸着させるため上清を全量 Spin Columnに添加する注 ) 上清 (~800μl) を取るときに白い沈殿を吸い取らないように注意する 7 遠心 (12,000 g 1 分間室温 ) する 8 Spin Column のカラムを外し Collection Tube の中のろ液を捨てた後カラムを同じ Collection Tube の上に戻す 9 500μlの ISPW Buffer を Spin Columnに添加する 10 遠心 (12,000 g 1 分間室温 ) するろ液を捨ててカラムを Collection Tube に再度戻す洗浄のため 750μl の ISW Buffer を Spin Column に添加する 13 遠心 (12,000 g 1 分間室温 ) する 14 ろ液を捨ててカラムを Collection Tube に再度戻す 3

5 15 Spin Column を空の状態のまま遠心 (12,000 g 1 分間室温 ) しメンブレンを乾燥させる注 )ISW Buffer に含まれるエタノール分を取り除くため 16 Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる 17 DNAを溶出させるため 50μlの ISE Bufferをメンブレン中央に滴下した後 3 分間室温で静置する注 )ISE Buffer(10 mm Tris-HCl, ph 8.5) の代わりに Nuclease フリー水や TE(pH 8.0) も溶出液として使用できる回収したプラスミド DNA 溶液を長期保存する場合は EDTA を含む TE(pH 8.0) の使用を勧める 18 遠心 (12,000 g 1 分間室温 ) する 19 プラスミド DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される 4

6 < 簡易プロトコール > 大腸菌培養液 1~5 ml( 低コピープラスミドの場合 1~10 ml) 遠心 (10,000 g, 5 分間, 室温 ) 上清を捨てる大腸菌 ( 沈殿 ) 250μl の IS1 Buffer(RNase A 添加済み ) を添加ボルテックスなどで大腸菌の塊がなくなるまで懸濁 250μl の IS2 Buffer を添加透明になるまで 4~6 回穏やかに転倒混和 (5 分間以上行わない ) 350μl の IS3 Buffer を添加 4~6 回転倒混和遠心 (12,000 g, 10 分間, 室温 ) Spin Column に上清を全量添加 ( 沈殿物は入れないようにする ) 遠心 (12,000 g, 1 分間, 室温 ) ろ液を捨てる 500μl の ISPW Buffer を添加遠心 (12,000 g, 1 分間, 室温 ) ろ液を捨てる 750μl の ISW Buffer を添加遠心 (12,000 g, 1 分間, 室温 ) ろ液を捨てる空の状態で遠心 (12,000 g, 1 分間, 室温 ) Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す 50μl の ISE Buffer をメンブレン中央に滴下室温静置 3 分間遠心 (12,000 g, 1 分間, 室温 ) プラスミド DNA 5

7 VI トラブルシューティングトラブル低収量プラスミド DNAの純度が低い RNAの混入ゲノム DNAの混入対策低コピープラスミドであったプラスミドのコピー数を確認し必要に応じて培養量を増やす ISE Buffer がメンブレン中央にアプライされるように添加する添加後室温で 3 分間から 5 分間ほど放置する吸光度測定には TE(pH 8.0) など ph 8.0 以上のバッファーを使用する ISW Buffer での洗浄後必ず空の Spin Column の遠心を行うもしエタノールが残留しているようであれば空の Spin Column の遠心時間を 5 分間に延ばす IS1 Buffer に RNase Aを添加したことを確認する RNase A 添加後の IS1 Buffer は冷蔵保存 (2 ~10 ) する IS2 Buffer 添加後ボルテックスしない IS2 Buffer 添加後長時間放置しない培養時間を確認する培養時間が長すぎると細胞が溶解しゲノム DNA が混入することがある IS3 Buffer 添加後の遠心上清を取るときに沈殿をとらないようにする VII データ < 製品性能 > DNA 吸着容量カラム容量溶出液量最大プラスミドサイズ 20μg 900μl 50μl 20 kbp 6

8 VIII 関連製品 Code No. 製品名包装単位 ml TE (ph8.0) 100 ml ml 6 本 ml 1M Tris-HCl (ph8.5) ml ml Distilled Water, Deionized, Sterile 100 ml ml μl 40 本 ECOS Competent E. coli DH5α 100μl 20 本 μl 80 本 ECOS Competent E. coli DH5α -Jumbo Pack- 500μl 6 本 μl 40 本 ECOS Competent E. coli JM μl 20 本 μl 80 本 μl 10 本 ECOS Competent E. coli XL1-Blue μl 20 本 μl 10 本 ECOS Competent E. coli BL21(DE3) μl 20 本 ECOS X Competent E. coli DH5α 100μl 10 本マニュアル記載内容や製品仕様価格に関しては予告なしに変更する場合がありますお問い合わせ先株式会社ニッポンジーン研究試薬部学術営業課 T E L U R L お問い合わせはお電話もしくは WEB フォームより承っております ISOSPIN Plasmid マニュアル ( 第 5 版 )

ISOSPIN Blood & Plasma DNA

血液血清血しょうからの DNA 抽出キット ISOSPIN Blood & Plasma DNA マニュアル ( 第 2 版 ) Code No. 312-08131 NIPPON GENE CO., LTD. I 製品説明 ISOSPIN Blood & Plasma DNA( アイソスピンブラッド & プラズマ DNA) は血液血清血しょうから DNAを抽出するためのキットです本キットは