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まなじゅふく
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1 Powered by TCPDF ( Title ハイリスクHPV 型のタンパクを標的とした新たな分子標的治療に関する基礎的検討 Sub Title Study of a new therapy targeting proteins of high-risk HPV Author 大野, 暁子 (Ono, Akiko) Publisher Publication year 2014 Jtitle 科学研究費補助金研究成果報告書 (2013. ) Abstract IgGシグナルペプチド (ss)- 細胞膜移行シグナル (Atp)-E7 由来 Rb 結合ペプチド (RbB)-E7 由来 myc 結合ペプチド (MycB)-5 量体化 COMPドメインペプチド (COMP)-6xHisタグおよび各種欠失体を発現する組換えアデノウィルスベクターの作製に至ったまた HPVE6タンパク質を5つの領域に分断し ss- Atp- RbB-MycB-COMPに組み込んだ遺伝子を作製しアデノウィルスへの組み込みを行いこれらのウィルスをHeLa 細胞 CaSki 細胞 C33a 細胞 A431 細胞に感染させ細胞障害性を検討した結果 HeLa 細胞では全てのウィルスで傷害性が認められた Adenovirus vector expressing IgG signal peptide(ss)-cell penetrating peptide(atp)-e7 prb-binding peptide(rbb)-e7 c-myc-binding peptide(mycb)-pentameric COMP domain peptide(comp)-6xhis was constructed. Several deletion variants as well as vector containing partial HPV E6 peptide were also generated. Cell lines such as HeLa, CaSki, C33a, and A431 were infected with these adenoviruses to examine the cytotoxicity. Growth inhibition was observed only in HPV18 positive HeLa. Notes 研究種目 : 若手研究 (B) 研究期間 : 2012~2013 課題番号 : 研究分野 : 医歯薬学科研費の分科細目 : 外科系臨床医学産婦人科学 Genre Research Paper URL

3 dom [ ant main(comp COMP-AD 1] (ss tenapedia(at P-AD) 1 Rb ss) tp) 5 COMP-asse E7 c COMP embly c-myc P-AD

ていない隣接した細胞にもペプチドが取り込まれる込まれることを期待したことを期待した

に対する抗体でが可能であるである E7 タンパクにおいては CR2 領域に LxCxE

ターゲット領域と考えられるがその他にも Rb タンパクとの結合を示す領域が E7

に搭載して解析を行う E6 E6 タンパクでは DLG,hSrib,MAG1,MUPP1

ウィルスは HeLa ウィルス HeLa CaSki C33a 細胞にそれぞれ感染させ

確認した MOI にばらつきがあり予備的な実験ではあるものの験ではあるものの HPV18

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をそろえた上で細胞増殖阻害効果の判定が必要であることまた必要であることまたβgal

各種子宮頸癌細胞株子宮頸癌細胞株に導入しに導入して細胞の増殖能の変化を観察する予定であ

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膜貫通タンパク+Rb +Rb 結合タンパク結合タンパク c-myc yc 結合タンパク

コンストラクトのうちどの部分が増殖阻害効果に寄与しているのかを判定するために分泌めに

のそれぞれの欠失コンストラクトも作成したまた作成したまたペプチドが大きくなってし

4 ていない隣接した細胞にもペプチドが取り込まれる込まれることを期待したことを期待した遺伝子導入効率は遺伝子導入効率は C 末の His tag に対する抗体でモニターが可に対する抗体でが可能であるである E7 タンパクにおいては CR2 領域に LxCxE の Rb タンパク結合モチーフが存在しておりハイリスク型 HPV に共通なことからターゲット領域と考えられるがその他にも Rb タンパクとの結合を示す領域が E7 タンパク C 末端領域に存在しているのでその部分を COMP に搭載して解析を行うに搭載して解析を行う E6 E6 タンパクでは DLG,hSrib,MAG1,MUPP1 などの PDZ ドメインを有するタンパクと E6 タンパクとの結合部位ンパクとの結合部位が HPV ハイリスク型共通のターゲットとなるのでその部分を COMP に搭載し解析を行っに搭載し解析を行った作成した計 10 種類のペプチド発現アデノウィルスは HeLa ウィルス HeLa CaSki C33a 細胞にそれぞれ感染させ細胞の増殖阻害効果の有無をぞれ感染させ細胞の増殖阻害効果の有無確認した MOI 確認した MOI にばらつきがあり予備的な実験ではあるものの験ではあるものの HPV18 型を発現している型を発現している HeLa において細胞の増殖阻害傾向細胞の形態異常を含むを観察を観察することができたすることができた図することができた 3 表表 1 この増殖阻害傾向はこの増殖阻害傾向は HPV18 を含まない CaSki 細胞や C33a 細胞では観察されなかったただ HeLa った HeLa 細胞はアデノウィルスが感染しやすい特徴を持っているため今後 MOI をそろえた上で細胞増殖阻害効果の判定が必要であることまた必要であることまたβgal gal 染色などを用いて他の細胞と比べてて他の細胞と比べて細胞のアデノウィルス細胞のアデノウィルス感染率を検討する必要がある４研究成果作成したペプチドを作成したペプチドを当初は当初はリポフェクシリポフェクション法によりョン法により各種各種子宮頸癌細胞株子宮頸癌細胞株に導入しに導入して細胞の増殖能の変化を観察する予定であったが予備的な実験において導入効率が著しく悪い状態をしく悪い状態を示唆する結果が得られた示唆する結果が得られた示唆する結果が得られたこのため効果が弱くのため効果が弱くペプチドのペプチドの優劣判定が難判定が難しいと判断ししいと判断し遺伝子導入効率の優れた組換遺伝子導入効率の優れた組換えアデノウィルスベクターアデノウィルスベクターアデノウィルスベクターを用いることにを用いることにした発現ペプチド発現ペプチドの構成はの構成は前項前項方法と同様と同様分泌タンパク分泌タンパク(ss) Antenapedia Antenapedia 膜貫通タンパク+Rb +Rb 結合タンパク結合タンパク c-myc yc 結合タンパク +COMP+His tag であるこれをこれを Gateway LR 組換え組換え法を用いてアデノウィルスベクタ法を用いてアデノウィルスベクタープラスミドプラスミドに組み込んだに組み込んだ後後 HEK293 細胞に導入し組換えアデノウィルスに変換したに導入し組換えアデノウィルスに変換したまたまたコンストラクトのうちどの部分がコンストラクトのうちどの部分が増殖コンストラクトのうちどの部分が増殖阻害効果に寄与しているのかを判定するために分泌めに分泌タンパクタンパク Rb 結合タンパク結合タンパク COMP のそれぞれの欠失コンストラクトも作成したまた作成したまたペプチドが大きくなってしペプチドが大きくなってしまう欠点はあるものの E6 タンパクとの結合部位は HPV ハイリスク型共通のターゲットとなるので基盤となるコンストラクトに fulle6 fulle6 partial partial E6 E6 5 種類を加えたものも作成しも作成した Partial artial E6 は各自アミノ酸からなるように分割したこの E6 由来の部分は Antenapedia と Rb 結合タンパクの配列の間に立体障害を避けるために前後にスペーサーを付加してコンストラクトを作成しアデノウィルスベクターに組み込んだアデノウィルスベクターに組み込んだ図 2 [図図 3]HeLa 細胞 [表表 1] 数値は感染なしの細胞数を 100 とした場合の相対細胞数を示す５主な発表論文主な発表論文主な発表論文等研究代表者研究分担者研究代表者研究分担者及び連携研究者及び連携研究者及び連携研究者には下線雑誌論文学会発表 [図 2]] 図書

Powered by TCPDF ( Title 明治以前日本水害史年表 Sub Title A chronological table of flood disasters before Meiji era in Japan Author 高木, 勇夫 (Takagi,

Powered by TCPDF ( Title 明治以前日本水害史年表 Sub Title A chronological table of flood disasters before Meiji era in Japan Author 高木, 勇夫 (Takagi, Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Title 明治以前日本水害史年表 Sub Title A chronological table of flood disasters before Meiji era in Japan Author 高木, 勇夫 (Takagi, Isao) Publisher 慶應義塾大学日吉紀要刊行委員会 Publication year 004