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あおいみやまる
2 years ago
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1 東京都品川区東品川天王洲セントラルタワー 4F Tel: (03) Fax: (03) SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix 製品番号 S4438 保存温度 -20 C TECHNICAL BULLETIN ( 使用説明書 ) 製品概要 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix は SYBR Green I を用いたホットスタート PCR 用 JumpStart Taq 抗体の高い性能と取り扱いが容易な ReadyMix 溶液の利便性が組み合わされています ReadyMix には蛍光色素と PCR 用試薬が含まれているためハイスループットな定量的 PCR を行うために理想的な溶液となっています SYBR Green I JumpStart Taq DNA ポリメラーゼ純度 99% のデオキシヌクレオチドおよび反応バッファーで構成された ready-to-use の混合液は 2 濃度で提供され扱いやすくなっています DNA テンプレートプライマーおよび水に 2 濃度の混合液を 25 µl 加えるだけです JumpStart Taq 抗体は DNA ポリメラーゼを室温で不活化しますサイクル初期過程の変性ステップで温度を 70 C 以上に上げると複合体が解離しポリメラーゼが完全に活性化します特に試料を調製したりプロトコールを変更したりすることなくホットスタートで起動することができます特長 ReadyMix はハイスループットな定量的 PCR アプリケーションに最適 SYBR Green I はあらゆる DNA 配列の定量に理想的です 1 色素は二本鎖 DNA に結合し蛍光強度増加を測定することによりサイクル全体にわたってモニターできます JumpStart Taq 抗体を使用したホットスタートのメカニズムにより非特異的産物の生成が避けられるため PCR 反応過程全体を室内で 2 時間まで行ってもパフォーマンスに影響しません反応のノーマライゼーションのために Internal Reference Dye が付属されていますこの色素の最大励起波長は 586 nm であり最大蛍光波長は 605nm です PCR 反応を多数回行う場合 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix によって調製時間がかなり短縮できまた多数回のピペッティングによるコンタミネーションのリスクが低減できバッチ間反応間でのパフォーマンスが一貫したものとなります試薬 100 回または 500 回の PCR 反応分 ( 反応量 50 µl) に十分な量が含まれています SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix( 製品番号 S9939) 20 mm Tris-HCl (ph 8.3), 100 mm KCl, 7 mm MgCl 2, 各 0.4 mm の dntp (datp, dctp, dgtp, TTP) 安定化剤 0.05 unit/µl Taq DNA ポリメラーゼ JumpStart Taq 抗体および SYBR Green I を含有 Internal Reference Dye( 製品番号 R4526) 100x 色素 0.3 ml バイアル入り本製品以外にごにご用意用意いただくいただく試薬試薬およびおよび器具水 PCR 用製品番号 W1754 プライマー DNA テンプレート定量的 PCR 用サーマルサイクラー保存 / 安定性 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix は 2~8 C で 3 カ月間まで保存できこの場合これを解凍する時間を要しませんまた 20 C で1 年まで保存できます凍結解凍サイクルを 10 回行っても性能劣化はみられません注意事項と免責事項 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix は研究開発用途のみに使用できます医薬品家庭での使用など試験研究用以外の用途には使用できません

2 2 予備事項 DNA の調製 PCR で確実に成功するために最も重要なステップは DNA の調製です DNA テンプレートの完全性と純度は必須です定量 PCR は複数の酵素反応が係るためタンパク質やフェノール / クロロホルム塩 EDTA 化学溶媒などの不純物に影響を受けやすくなっていますコンタミネーションも蛍光検出に干渉します吸光度 260 nm と 280 nm の比率によって DNA の純度を計算することができます高純度の DNA は A 260 /A 280 が 1.8~2.0 ですこの比率が低い場合はタンパク質などによるコンタミネーションの可能性がありますプライマーのデザインプライマーダイマーや二次構造を形成しないようにプライマーデザインソフトを用いて特異的なプライマーをデザインしてくださいプライマー濃度を低くすることでプライマーダイマー形成や非特異的生成物の蓄積を減少させますこれは定量 PCR で SYBR Green I を用いるときに重要ですマグネシウムの濃度一般的に塩化マグネシウム濃度が低いと非特異的生成物が生じやすくなります ReadyMix 溶液は塩化マグネシウム濃度が 7 mm で 2x 濃度になっています ( 最終濃度 3.5 mm) 内部標準色素反応の標準化用に内部標準色素が付属しています最大励起波長は 586 nm 最大吸光波長は 605 nm です ROX Reference Dye 用の標準的な装置で内部標準色素は適用できますこの内部標準色素は ABI シークエンス検出システムに必要ですコントロールポジティブコントロールはすべてのキットが正常に働くかを確認するために常に有用ですネガティブコントロールはコンタミネーションの有無を検出するために必要ですテンプレートなしでシグナルが見られる場合は DNA の混入かプライマーダイマー形成が考えられます qpcr 用コントールに関しては Lovatt らの文献を参照してください 3 データ解析 SYBR Green I を用いた定量 PCR を実行する装置の推奨に従ってください一般的に相対蛍光強度の対数をサイクル数に対してプロットして閾値サイクル (C t ) または交点を決めます C t 値は各サンプル中にあるテンプレートの量を測定するために使われます C t を考慮する際に以下のポイントがあります C t は PCR 産物生成による最初の蛍光増加 C t 以前はサイクルのベースライン閾値は手動で調節可能閾値は対数増幅プロットに対して必ず定められる閾値は反応のプラトー後ではなく対数期に定められる融解曲線融解曲線の解析は PCR 産物の解析に役立ちますリアルタイム装置の融解曲線解析用手順に従ってくださいメルティングカーブの分析後同じ PCR 産物が係るその他のデータを集めることでプライマーダイマーや他の非特異的シグナルを減少させる検出ステップの追加的なデータとなります定量の手法標準曲線標準曲線は絶対定量および相対定量のどちらにも必要ですスタンダードカーブを作るために異なる濃度の DNA ( 通常 5 種類 ) が用いられそれによって不明な濃度を測量することができます各濃度は繰り返して行ってください絶対定量および相対定量本製品は絶対定量および相対定量のどちらでも目的の DNA 定量に使用できます絶対定量は最初のサンプルにおける目的 DNA の量を測定するために利用され相対定量は目的 DNA とリファレンス遺伝子間の比率によって測定されますリファレンス遺伝子は不変で継続的に発現することが理想です実際にはハウスキーピング遺伝子が選ばれますがその他の遺伝子が選択されることもあります 4 絶対定量は目的の核酸の絶対量を測定するために外部のスタンダードが用いられますこれらの外部標準には目的の配列と同じ配列を含むかごくわずかに異なる配列が用いられます外部標準に結合するプライマーは必ず目的の配列と同一です外部標準と目的配列の類似性は両者間で増幅効率が基本的に等価であるために必要です増幅効率が等価であることは絶対定量に必須です外部標準の希釈系列による標準曲線は濃度が不明な目的サンプルの測定に利用されます相対定量はサンプル中の目的テンプレートとリファレンステンプレートの量比によって算出します遺伝子発現の相対量は相対定量で共通の増幅ですリファレンス遺伝子は通常ハウスキーピング遺伝子が利用され異なる実験条件や組織の状態によって濃度の変化ができるだけ変動しない遺伝子が相対定量に用いられますサンプル中の目的およびリファレンステンプレートの希釈系列を個別の

3 チューブで増幅します SYBR Green PCR 定量はマルチプレックスができませんリファレンステンプレートと目的テンプレートの増幅効率が異なる場合は 2 つの標準曲線を用意する必要がありますサンプル中の目的及びリファレンスの得られた量の比率はこれらの 2 つの標準曲線から決定されます目的テンプレートとリファレンステンプレートが非常に近い増幅効率を示す場合は

3 3 チューブで増幅します SYBR Green PCR 定量はマルチプレックスができませんリファレンステンプレートと目的テンプレートの増幅効率が異なる場合は 2 つの標準曲線を用意する必要がありますサンプル中の目的及びリファレンスの得られた量の比率はこれらの 2 つの標準曲線から決定されます目的テンプレートとリファレンステンプレートが非常に近い増幅効率を示す場合はリファレンステンプレートから 1 つの標準曲線を作りサンプル中の目的およびリファレンスの量の比率を測定します PCR 反応効率の測定リファレンスサンプルと目的サンプルの PCR 効率は各ターゲットの希釈系列を用意することで測定されます各リファレンスまたはターゲットから得られるそれぞれの Ct 値を差し引きますその Ct 値の差をテンプレート量の対数に対してプロットします得られる直線の傾きが 0.1 より小さければ増幅は類似していると言えます参考文献 1. Morrison, T. B., et al., Quantification of Low-Copy Transcripts by Continuous SYBR R Green I Monitoring during Amplification. BioTechniques, 24: (1998). 2. Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2000). Catalog Number M Lovatt, A., et al., Validation of Quantitative PCR Assays, BioPharm., March 2002, p Bustin, S. A., Quantification of mrna using realtime reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems, J. Mol. Endocrinol. 29, 23-9 (2002) 手順注意 : SYBR Green I は二本鎖 DNAに結合することから PCR 産物が確実にシングルバンドになるプライマーとサイクル条件をテストすることが重要ですそうしない場合結果を解釈できなくなります PCRの特異性を確認するために通常のサーマルサイクラー ( 非定量 ) で反応させアガロースゲルによる分離結果から確認することが最も良い方法です 2 以下の手順は最適なプライマー濃度を確立するためのガイドラインとして考慮してくださいプライマーの特性によってはさらに最適化が必要な場合もあります最適化に関する情報はウェブ上の qpcr ユーザーガイドをご覧下さい ( 注意 : ジメチルスルホキシド (DMSO) は 5% まで酵素 - 抗体結合を妨害することなく使用できます他の溶媒塩や極端な ph によって Taq ポリメラーゼに対する JumpStart Taq 抗体のアフィニティが減少することがあり効果が損なわれることがあります A. プライマー濃度の最適化 1. 図 1 のように希釈したプライマーを分注します a. フォワード (fwd) とリバース (rev) をそれぞれ 8 μm の溶液で 60 μl 作り最初のチューブに入れます (1 番 ) 4 本の空チューブ 2 セット (2~5 番 ) を用意 b. チューブ 2~5 番に各 30 μl の水を分注 c. 1 番のチューブ (8 μm) から 30 μl を取り 2 番のチューブに入れ 5 分以上ピペッティングにより完全に混合 d. 同様に 2 から 3 3 から 4 4 から 5 に移動混合を行う e. 希釈した fwd プライマーを含むチューブ列からマルチチャネルピペッターで 5 μl 取り 96-well プレートの 1-5 に 5 番目まで順に入れる (PCR ミックスとテンプレートを添加後の fwd プライマー最終濃度は 1000, 500, 250, 125, 62.5 nm) f. 同様に rev プライマーも 5 μl ずつ A-E に 5 番目のウェルまで入れる (PCR ミックスとテンプレートを添加後の rev プライマー最終濃度は 1000, 500, 250, 125, 62.5 nm) 最も良い結果を得るためにプライマー MgCl 2 KCl 濃度や PCR 条件の最適化が必要ですさまざまなプライマー濃度の組み合わせ (50~1000 nm) を試すことがプライマー最適化に効果的です目的の PCR にそれほど高感度が必要にならない場合両プライマーの最終濃度として 200~400 nm でよく行われます

4 4 2. qpcr ミックスの準備 DNase フリーの適切なサイズのチューブに下記の試薬を入れます軽くボルテックスしてから少し遠心してチューブの底にミックスを集めます量成分最終濃度 520 μl 2x SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix 1.25 units Taq DNA polymerase, 10 mm Tris-HCl, 50 mm KCl, 3.5 mm MgCl2, 0.2 mm dntp, stabilizers (7μL) リファレンス色素 * 1x ( オプション ) 676μL 水になるように調節 676μL 合計量 *ABI 7500 または同等の装置 (BioRad icycler 用 FITC) では 0.1xを使用 3. プライマーを入れた PCR プレートのウェル (A1-E5) にマスターミックス 26 μl を分注します 4. よく混ぜてから A1~E5 の各ウェルから 18 μl を A8 ~E12 に移します 5. 2 μl のテンプレート DNA(10-50 ng ゲノム DNA または ng プラスミド DNA) を 1 方の反応セットの ( カラム 1-5) 2 μl の水を他方の反応セット (8-12) に添加します 6. 穏やかにボルテックスし軽く遠心して底に集めます 7. サーマルサイクルを行います最適なパラメーターはプライマーのデザインやサーマルサイクラーによって異なりますサーマルサイクラーのマニュアルをご参照下さい最大の収率や品質を達成するためにサイクルのパラメーターを最適化することもあります 100~600 bp フラグメント用の一般的一般的なサイクルパラメーター : 初期変性 94 C 2 分 40 サイクル : 変性 94 C 15 秒アニーリング伸長蛍光測定 60 C または最低プライマー T M より 5 下 1 分ホールド ( オプション ) 4 C ( ゲル上で産物を見る場合のみ ) 本プロトコールは次のサーマルサイクラーで成功しています :Stratagene MX 3000P,BioRad icycler, MJ Opticon, ABI 目的の核酸を含んだ反応 ( カラム 1-5) について蛍光強度プロット (ΔRn) を評価します最も低い Ct で高い蛍光強度を示すプライマーの組み合わせが最も感度がよく再現性のあるアッセイになります B. ルーチン分析の手順 1. 反応マスターミックスを用意することで再現性の高い結果が得られますテンプレートを除く共通するすべての試薬を混ぜ必要な量の約 10% を多めに用意しますテンプレートを希釈して反応容器に入れてからマスターミックスを適切なチューブやプレートに分注して PCR を行います量 * 成分最終濃度 25 µl 2x JumpStart Taq ReadyMix 1.25 units Taq DNA polymerase, 10 mm Tris-HCl, 50 mm KCl, 3.5 mm MgCl2, 0.2 mm dntp, stabilizers 1x (0.5 µl) Reference Dye ** ( オプション ) - µl フォワードプライマセクション A で決めーた最適濃度 - µl リバースプライマーセクション A で決めた最適濃度 - µl テンプレート DNA 10 ng- 100 ng - µl 水 50 µl 総量 *50 μl 反応用他の反応量で行う場合は計算する必要があります ** ABI 7500 または同等の装置 (BioRad icycler 用 FITC) では 0.1xを使用 2. ボルテックスにより穏やかに混合し軽く遠心して全コンポーネントをチューブ底に回収します 3. サーマルサイクルを行います 100~600 bp 断片に対するする典型的典型的なサイクルパラメータ : 初期変性 94 C 2 分 40 サイクル : 変性 94 C 15 秒アニーリング伸長蛍光測定 60 C または最低プライマー T M より 5 下 1 分ホールド ( オプション ) 4 C ( ゲル上で産物を見る場合のみ )

5 5 トラブルシューティングガイド症状 PCR 産物 ( シグナル ) が認められないシグナルがテンプレートの希釈度に依存しない ( 複数の産物またはスメアー状産物 ) 考えられるえられる原因 PCR プライマーがないかまたは分解しているサイクル数が少なすぎるアニーリング温度が高すぎるプライマー設計が最適でないテンプレートの量が十分でないテンプレートの品質が悪い目的とするテンプレートが複雑であるアニーリング温度が低すぎるプライマー設計が最適でないテンプレート濃度が高すぎる対策コンポーネントが機能していることを確認するために常にポジティブコントロール実験を行う必要があります反応液を調製する際にチェックリストを作成することを推奨しますサイクル数を増やしてくださいアニーリング温度を 2~4 C ずつ下げてください配列情報が正確であることを確認してくださいプライマーが 27 ヌクレオチドより短い場合は 27~33 ヌクレオチドまでプライマーを伸ばしてみてくださいプライマーの GC 含量が 45% 未満の場合は GC 含量が 45~60% となるようプライマーを再設計してみてくださいサイクル数を増やしても成功しない場合にはテンプレート濃度を 10 倍にして再び反応を行ってくださいアガロースゲル電気泳動を行って鋳型の完全性を評価してくださいせん断およびニック形成が最小限に抑えられる方法を用いてテンプレートを再精製することが必要な場合があります多くの場合複雑なテンプレートには GC 含有量が非常に高い二次構造を持つといった特徴があります 0.8~1.3 M の濃度のベタインは GC 含量の高いテンプレートの増幅を助けることが報告されています [Rees, W. et al., Biochemistry, 32, (1993)] アニーリング温度を 2~3 C ずつ上げてください配列情報が正確であることを確認してくださいプライマーが 27 ヌクレオチドより短い場合は 27~33 ヌクレオチドまでプライマーを伸ばしてみてくださいプライマーの GC 含量が 45% 未満の場合は GC 含量が 45~60% となるようプライマーを再設計してみてください PCR 反応時のテンプレート濃度を下げてくださいプライマー濃度が高すぎるプライマー濃度を 2 倍希釈系列 ( すなわち 0.1 µm 0.05 µm µm および µm) で下げこれらで PCR 反応をテストしてください

6 6 NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE Use of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patent claims outside the US: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152 (claims 1 to 23 only), 5,773,258 (claims 1 and 6 only), 5,407,800, 5,322,770, 5,310,652, 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787, 6,258,569, 6,214,979, and claims outside the US corresponding to US Patent No. 4,889,818. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser s own internal research. No right under any other patent claim (such as apparatus or system claims in US Patent No. 6,814,934) and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained from the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. SYBR は登録商標でありその使用は米国特許第 5,436,134 号で保護されています Molecular Probes 社からライセンス取得 JumpStart 及び JumpStart Taq Antibody は米国特許第 6,887,377 7,163,633 及び 7,438,806 号の認可を受けこれに相当する外国特許があります JumpStart 及び ReadyMix は Sigma-Aldrich Biotechnology LP 及び Sigma-Aldrich Co. の商標です AF,CR,PHC 06/09-1 Sigma ブランド製品は Sigma-Aldrich, Inc. を通じて販売されています Sigma-Aldrich, Inc. は同社製品がこの文書およびその他の Sigma-Aldrich 発行文書に含まれる情報に合致していることを保証しますお客様の個別の用途と製品の適合性についてはお客様にてご判断ください収載の品目製品情報価格などは予告なく変更される場合がございます納品伝票または同梱の内容明細書の裏面をご覧ください

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TaqMan MGB 遺伝子発現検出キットのご注文について注文書の記入方法 2 ページ目以降が注文書になっています注文書に日付とご氏名ご所属所在地電話番号 FAX 番号をご記入下さい * 注文書が複数になる場合は記入したものをコピーしてご使用下さい注文するプローブについての情報をご記入 TaqMan MGB 遺伝子発現検出のご注文について注文書の記入方法 2 ページ目以降が注文書になっています注文書にとご氏名 FAX 番号をご記入下さい * 注文書が複数になる場合は記入したものをコピーしてご使用下さい注文するプローブについての情報をご記入下さい : 下の表で確認しにチェック : 英字または数字 15 ケタ以内で記入リポーター色素 : ご希望の仕様をにチェック注文本数の合計