[PDF] Biacore T200 version2 日本語取扱説明書 基本操作編

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3 目 次 1. セットアップ 電 源 およびソフトウェアの 起 動 電 源 の 立 ち 上 げ ランニング 緩 衝 液 超 純 水 のセット コントロールソフトウェアの 起 動 システムの 初 期 化 センサーチップの 挿 入 ランニング 緩 衝 液 による 平 衡 化 温 度 設 定 試 料 のセットと 取 り 出 し 基 本 操 作 マニュアル 測 定 の 実 行 方 法 試 料 の 添 加 レポートポイントの 追 加 測 定 の 終 了 ファイルの 保 存 データの 印 刷 固 定 化 アミンカップリング 法 リガンド 希 釈 液 の ph 選 択 基 本 プロトコールでの 固 定 化 固 定 化 量 を 調 節 して 固 定 化 マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討... 45

4 5. 相 互 作 用 測 定 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 の 算 出 マルチサイクル 法 プログラムの 実 行 カーブフィッティングによる 解 析 平 衡 値 解 析 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 の 算 出 シングルサイクル 法 プログラムの 実 行 カーブフィッティングによる 解 析 メソッドによるプログラムの 作 成 ウィザードで 作 成 保 存 したプログラムの 呼 び 出 し メソッドの 編 集 メソッドの 実 行 メンテナンス システムの 洗 浄 Desorb Desorb and Sanitize Empty Buffer Tubing Wash Buffer Tubing シグナルの 校 正 Normalize システムチェック 実 験 の 終 了 スタンバイ 状 態 での 放 置 電 源 の 落 とし 方 センサーチップの 保 存

5 9. センサーグラムの 編 集 ソフトウェアの 起 動 ファイルの 呼 び 出 し センサーグラムの 編 集 センサーグラムの 表 示 センサーグラムの 表 示 の 変 更 センサーグラムの 添 加 開 始 時 間 ベースライン 合 わせ センサーグラムの 不 必 要 部 分 の 削 除 センサーグラムの 差 し 引 き センサーグラムのノーマライズ グラフの 編 集 データの 移 管 データの 保 存

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7 1. セットアップ 1 1. セットアップ 1-1. 電 源 およびソフトウェアの 起 動 電 源 の 立 ち 上 げ テーブルタップの 電 源 プリンター モニター 画 面 システム 本 体 コンピュー ター の 順 番 に 電 源 を 入 れます Windows のバージョンにより パスワード(biacore)の 入 力 が 必 要 な 場 合 があります 注 ) 装 置 本 体 の 電 源 を 入 れると 本 体 のフロント 右 上 にあるすべてのインジケーター(LED ランプ)が 数 秒 間 点 灯 し リセットされて 消 えます その 後 ready のインジケーターが 点 灯 し temperature のインジケーターは 点 滅 します 補 足 1-1. 装 置 の 配 置 Sample compartment door インジケーター ポンプ 部 ドア( 左 側 ) Sample compartment injection window センサーチップ 挿 入 位 置 (Sensor chip port) ポンプ 部 ドア( 右 側 ) ラックトレイ 挿 入 位 置 (Rack tray port) ランニング 緩 衝 液 セット 位 置 廃 液 ボトル 超 純 水 ボトルセット 位 置

8 2 1. セットアップ ランニング 緩 衝 液 超 純 水 のセット 本 体 に 向 かって 左 側 トレイにランニング 緩 衝 液 ボトルをセットし チューブ A を 挿 入 し ます 廃 液 ボトル 後 ろの 扉 を 開 けて ぺリスターポンプのロックをします 右 側 トレイに 超 純 水 ボトルおよび 廃 液 ボトルをセットして 対 応 するチューブを 挿 入 し ます チューブ 廃 液 ボトル A, B, C, D 4 本 超 純 水 ランニング 緩 衝 液 ボトル ボトル 左 側 ;ランニング 緩 衝 液 ボトル 右 側 ; 廃 液 ボトル 超 純 水 ボトル 補 足 1-2. チューブの 配 置 本 体 左 側 チューブ A,B,C,D には タグがついているので 確 認 します チューブ A ランニング 緩 衝 液 ボトルに 入 れます チューブ B,C,D 必 要 に 応 じて 複 数 のランニング 緩 衝 液 をセットできます 本 体 右 側 超 純 水 チューブ 廃 液 チューブ(2 本 ) 超 純 水 を 入 れた 500 ml ボトルに 入 れます 廃 液 ボトルキャップに 接 続 します

9 1. セットアップ 3 補 足 1-3. ランニング 緩 衝 液 の 種 類 ランニング 緩 衝 液 として 弊 社 から HBS 緩 衝 液 および PBS 緩 衝 液 を 販 売 しています HBS-EP+ 10X (1000 ml, BR ) 0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl, 30 mm EDTA, 0.5 % v/v Surfactant P 20 超 純 水 で 10 倍 希 釈 :0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mm EDTA, 0.05 % Surfactant P 20, ph7.4 HBS-P+ 10X (1000 ml, BR ) 0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl, 0.5 % v/v Surfactant P 20 超 純 水 で 10 倍 希 釈 :0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05 % Surfactant P 20, ph7.4 HBS-N 10X (1000 ml, BR ) 0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl 超 純 水 で 10 倍 希 釈 :0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, ph7.4 PBS 10X (1000 ml, BR ) 0.1 M phosphate Buffer, 27 mm KCl, 1.37 M NaCl 超 純 水 で 10 倍 希 釈 :0.01 M phosphate Buffer, 2.7 mm KCl, M NaCl, ph7.4 PBS-P+ 10X (1000 ml, ) 0.1 M phosphate Buffer, 27 mm KCl, 1.37 M NaCl, 0.5 % v/v Surfactant P 20 超 純 水 で 10 倍 希 釈 : 0.01 M phosphate Buffer, 2.7 mm KCl, M NaCl, 0.05 % Surfactant P 20, ph7.4 実 験 目 的 にあわせて 緩 衝 液 を 変 更 してください 各 自 で 調 製 する 場 合 には 0.22 μm フィルターでろ 過 してください

10 4 1. セットアップ コントロールソフトウェアの 起 動 初 期 画 面 中 の 左 下 の Start から All programs Biacore Control Software のアイコンをクリックします 補 足 1-4. 画 面 の 説 明 Menu bar Toolbar Event log ボタン Sensorgram Event log window Report point table Status bar Keyword table Menu bar Toolbar Sensorgram window Report point table Event log Status bar で 実 行 可 能 な 操 作 コマンドが 含 まれます 使 用 頻 度 の 高 いコマンドをアイコン 化 簡 便 にコマンド 操 作 を 選 択 できます その 時 点 で 実 行 可 能 なコマンドが 選 択 可 能 です センサーグラムをリアルタイムに 表 示 します 任 意 時 間 のレスポンスを 数 値 で 表 示 します 測 定 中 の 操 作 内 容 を 表 示 します 現 在 のシステムの 状 態 を 表 示 します オンライン 状 況 システム 温 度 (Temperature) センサーチップ のタイプ サンプル 温 度 (Sample compartment temperature) Run 実 行 状 態 など

11 1. セットアップ システムの 初 期 化 センサーチップの 挿 入 コントロールソフトウェアを 起 動 すると Insert Chip ダイアログが 表 示 され 同 時 に Biacore T200 本 体 右 側 のセンサーチップポートが 自 動 的 に 開 きます Series S センサーチップ CM5 新 品 のセンサーチップを 使 用 する 際 は New Chip に 再 利 用 のセンサーチップの 場 合 は Reuse Chip にチェックを 入 れ 使 用 する Chip type を 選 択 します ( 再 利 用 のセンサーチ ップを 使 用 する 場 合 は 7 ページを 参 照 してください ) Chip id は 日 付 - 時 間 :システムシリアルナンバーが 自 動 入 力 されます 必 要 に 応 じて 変 更 可 能 です Chip lot no (optional) を 入 力 します

12 6 1. セットアップ センサーチップを 印 字 面 の 両 側 の 矢 印 の 方 向 でセンサーチップポートに 挿 入 します セン サーチップポートを 手 で 押 して 閉 めます Insert Chip ダイアログの Dock Chip をクリックします Dock が 完 了 して 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります Standby flow とは セットしたランニング 緩 衝 液 (チューブ A)を 低 流 速 で 流 し 続 けるモー ドです 最 長 7 日 間 継 続 します (バッファー 必 要 量 ;65 ml/ 24 時 間 ) 補 足 1-5. センサーチップ 挿 入 時 の 注 意 事 項 センサーチップ 内 のプラスチックシートがセンサーチップのカバーにしっかり 収 まってい ることを 確 認 してから 挿 入 してください 冷 蔵 庫 に 保 存 しているセンサーチップは 室 温 に 戻 してから Dock してください センサーチップポートを 閉 じた 後 センサーチップを 取 り 出 す 必 要 がある 場 合 は 一 旦 Insert Chip のダイアログを Cancel します Toolbar の Eject アイコン( )を 選 択 して Eject Chip をクリックしてください Insert Chip ダイアログを 閉 じてしまった 場 合 Toolbar の Insert アイコン( )を 選 択 す ると 再 度 ダイアログが 表 示 されます

13 1. セットアップ 7 補 足 1-6. センサーチップの 固 定 化 履 歴 再 利 用 のセンサーチップを 使 用 する 場 合 は 挿 入 時 Reuse Chip にチェックを 入 れると 下 記 のダイアログが 表 示 されます Reuse:で そのセンサーチップに 対 応 した id 番 号 を 選 択 し Details をクリックすると 固 定 化 履 歴 が 表 示 されます 確 認 後 Close をクリックします センサーチップを 取 り 出 して 保 存 する 場 合 は センサーチップカバーに id を 書 き 込 むと 次 回 使 用 する 際 に id を 選 択 しやすくなります なお 固 定 化 済 みセンサーチップを 再 使 用 する 際 に New chip として Dock すると 前 回 ま での 固 定 化 履 歴 が Chip Properties に 登 録 されず 測 定 データの 解 析 時 に 解 析 ソフトウェアに リガンド 情 報 が 反 映 されません このため 固 定 化 した 表 面 を 再 度 測 定 に 使 用 する 場 合 に は Reuse chip で 該 当 するチップ id 番 号 を 選 択 して Dock してください

14 8 1. セットアップ 補 足 1-7. センサーチップの 種 類 各 センサーチップの 詳 細 は 弊 社 総 合 カタログ 等 を 参 照 してください カルボキシル 基 タイプ(タンパク 質 ペプチド 化 合 物 などの 固 定 化 ) Series S Sensor Chip CM5 3 枚 BR Series S Sensor Chip CM4 3 枚 BR Series S Sensor Chip CM3 3 枚 BR Series S Sensor Chip C1 3 枚 BR Series S Sensor Chip CM7 1 枚 ストレプトアビジンタイプ(ビオチン 標 識 の DNA やペプチドなどの 固 定 化 ) Series S Sensor Chip SA 3 枚 BR Biotin CAPture Kit, Series S 1 箱 疎 水 基 タイプ(リン 脂 質 糖 脂 質 膜 タンパク 質 などの 固 定 化 ) Series S Sensor Chip HPA 3 枚 BR Series S Sensor Chip L1 3 枚 BR 金 属 キレートタイプ(His-tag タンパク 質 の 固 定 化 ) Series S Sensor Chip NTA 3 枚 BR

15 1. セットアップ ランニング 緩 衝 液 による 平 衡 化 Menu bar の Tools Prime を 選 択 します ランニング 緩 衝 液 および 廃 液 ボトルを 確 認 後 Start をクリックします Prime がスタートします 終 了 後 Close をクリックしてください 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります 補 足 1-8. 実 験 途 中 でのランニング 緩 衝 液 の 交 換 Prime は ポンプやマイクロ 流 路 系 オートサンプラーなどをランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 置 換 する 操 作 です 実 験 途 中 でランニング 緩 衝 液 を 変 更 する 場 合 も 必 ず 実 行 してください

16 10 1. セットアップ 温 度 設 定 測 定 温 度 (Analysis temperature)およびサンプルコンパートメントの 温 度 をそれぞれ 設 定 し ます Menu bar の Tools Set Temperature を 選 択 します 4~45 の 範 囲 で 設 定 して OK をクリックします (サンプルコンパートメントの 温 度 は 室 温 ±15 以 内 ) 補 足 1-9. 設 定 温 度 と 実 際 の 温 度 測 定 は 設 定 温 度 で 安 定 した 後 に 実 施 してください 設 定 温 度 に 達 していない 場 合 は 画 面 上 の Status bar 中 の 温 度 表 示 が 赤 の 点 滅 本 体 インジ ケーターの temperature ランプが 橙 色 に 点 滅 します 設 定 温 度 で 安 定 した 場 合 には 画 面 上 の 温 度 の 表 示 が 黒 インジケーターの temperature ランプは 点 灯 に 変 わります 温 度 が 完 全 に 安 定 するには ある 程 度 時 間 を 要 します 測 定 温 度 が 室 温 (25 )と 大 きく 異 なる 場 合 は 測 定 を 始 める 前 にあらかじめ 設 定 してください

17 1. セットアップ 試 料 のセットと 取 り 出 し すべての 試 料 はラックトレイにセットし システム 内 に 挿 入 します サンプルコンパート メント 内 に 入 っているラックトレイを 取 り 出 すには Toolbar の Eject Rack アイコン( ) をクリックします 速 やかにシステム 本 体 前 面 のラックトレイポートが 開 き ラックトレ イが 出 てきます ラックトレイの 下 に 配 置 した 円 形 のボタンを 押 すとロックが 解 除 して ラックトレイを 引 き 出 すことが 出 来 ます 同 時 に 画 面 上 に Eject Rack Tray ダイアログが 表 示 されます ラックトレイポートは 60 秒 で 自 動 的 に 閉 まります すぐに 閉 めたい 場 合 は OK をクリックしてください

18 12 1. セットアップ 補 足 ラックトレイ ラックとバイアルの 組 み 合 わせ バイアルをセットするフォルダをラック ラックをセットするトレイをラックトレイと 呼 びます ラック ラックトレイ ト 各 ラックは 次 のバイアルをセットすることができます バイアルをセットする 際 は 必 ず 専 用 のラバーキャップを 使 用 してください パラフィルムなどニードルの 穴 を 塞 ぐ 可 能 性 のあるシールは 使 用 しないでください Reagent rack, Type ml プラスチックバイアル(φ11 mm)x 20 本 Type 2 Reagent rack, Type 2 16 mm ガラスバイアル(4 ml)x 9 本 または 15 mm プラスチックバイアル(4 ml)x 9 本 7 mm プラスチックバイアル(0.8 ml)x 24 本 Type 1 Sample and reagent rack(ラックトレイとラックの 一 体 型 タイプ) 16 mm ガラスバイアル(4 ml)x 9 本 または 15 mm プラスチックバイアル(4 ml)x 9 本 1.5 ml プラスチックバイアル(φ11 mm)x 24 本 7 mm プラスチックバイアル(0.8 ml)x 45 本 Rubber caps, type 3 Rubber caps, type 2 Rubber caps, type 5 BR BR BR mm Plastic Vials 1.5 ml Plastic Vials 16 mm Glass Vials 15 mm Plastic Vials BR BR BR BR Rack tray 96 well/ 384 well マイクロプレート x 1 枚 Microplate 96-well (BR ) 専 用 シール:Microplate Foil (96 well) ( ) Microplate 384-well (BR ) 専 用 シール:Microplate Foil (384 well) (BR )

19 1. セットアップ 13 補 足 ラックトレイへのバイアルおよびプレートのセット 方 法 Reagent rack 押 す Rack tray 補 足 バイアル 位 置 の 指 定 方 法 バイアル 位 置 は ラックトレイ 上 の 座 標 で 指 定 します ラックトレイ 前 面 に 刻 印 されてい る 各 列 A B C の 手 前 から とカウントします ( 例. 左 手 一 番 手 前 は A1 その 奥 は A2 ) A A B G H A B C D E F G

20 14 2. 基 本 操 作 2. 基 本 操 作 測 定 モードには 以 下 の 3 つのモードがあります 測 定 モードを 起 動 する 際 には Toolbar の 各 アイコンをクリックします Manual run 画 面 上 のアイコンを 使 い 測 定 を 行 いながら 操 作 するマニュアルモードです 簡 単 な 試 験 など 数 回 の 添 加 で 完 了 する 試 験 を 行 う 場 合 に 有 効 です ただし 測 定 結 果 は 解 析 できません Application wizards ガイダンスに 従 いながら 実 験 条 件 を 入 力 して 実 行 させるオートモードです リガンド 分 子 の 固 定 化 や 濃 度 定 量 相 互 作 用 解 析 サーモダイナミクスなどの 実 験 ごとの 専 用 ウィザードや ph スカウティングなど 実 験 条 件 の 検 討 を 目 的 とした ウィザードなどの 実 験 項 目 について 対 応 しています Methods 複 雑 な 条 件 設 定 や 特 殊 な 設 定 が 可 能 な 汎 用 性 が 高 いオートモードです メソッドビルダー 機 能 によりメソッドを 作 成 します ここでは Manual run について 説 明 します

21 2. 基 本 操 作 マニュアル 測 定 の 実 行 方 法 Toolbar の Start Manual run アイコン( リックします )または Menu bar の Run Manual run をク 流 速 (Flow rate)を 入 力 します 流 速 は 1~100 μl/min で 設 定 可 能 です 検 出 モード(Flow path) Rack の 種 類 を 選 択 します ラックがセットされていない 場 合 Start をクリックしてもエラーメッセージが 表 示 され 先 に 進 めません 測 定 開 始 後 にサンプ ルをセットする 場 合 でも ラックを 挿 入 してください Start をクリックします 補 足 2-1. 試 料 必 要 量 試 料 必 要 量 は 流 速 (μl/min)と 添 加 時 間 (s)から 計 算 される 試 料 添 加 量 (μl)に 流 路 の 共 洗 い 分 28 μl を 加 算 した 量 が 必 要 です 平 底 のバイアルを 使 用 する 場 合 特 殊 な 添 加 モー ドを 使 用 する 場 合 は 必 要 試 料 量 が 異 なります 測 定 開 始 後 にサンプルをセットできるの で 添 加 ダイアログに 表 示 される 必 要 試 料 量 を 確 認 後 試 料 を 調 製 してセットすると 間 違 いがありません

22 16 2. 基 本 操 作 ファイルの 保 存 先 を 指 定 します C: \Bia Users\( 自 分 のフォルダ)に 移 動 後 ファイル 名 を 入 力 して Save をクリックします センサーグラムが 表 示 され 測 定 が 開 始 します

23 2. 基 本 操 作 17 補 足 2-2. アイコンの 説 明 流 速 の 変 更 流 路 の 切 り 替 え 赤 色 試 料 の 添 加 青 色 洗 浄 溶 液 の 添 加 待 機 ( 次 の 操 作 コマンドを 実 行 するまでの 時 間 を 任 意 で 設 定 ) ラックの 取 り 出 し サイクルの 切 り 替 え( 検 出 セルの 変 更 も 可 能 ) 測 定 の 終 了 一 時 停 止

24 18 2. 基 本 操 作 試 料 の 添 加 Inject command アイコン( します ; 赤 色 )または Menu bar の Commands Inject を 選 択 試 料 の 位 置 (Vial/well position)を 設 定 します この 時 試 料 の 位 置 入 力 ボックス 右 のアイ コンをクリックすると ラックの 図 上 で 選 択 できます 添 加 時 間 (contact time)を 入 力 します 位 置 と 添 加 時 間 を 設 定 すると Inject ダイアログ の 右 下 に 必 要 量 が 表 示 されます 試 料 をラックにセットする 場 合 は 一 旦 Cancel をクリックし Inject ダイアログを 解 除 し てください

25 2. 基 本 操 作 19 Eject rack tray アイコン( )または Menu bar の Commands Eject Rack を 選 択 します ラックトレイを 取 り 出 し 適 切 な 量 の 試 料 を 分 注 したバイアルをセットします ラックト レイを 再 びシステム 本 体 にセットし OK をクリックします Inject command アイコンを 選 択 し 試 料 位 置 および 添 加 時 間 を 入 力 します OK をクリックします 必 要 に 応 じて 引 き 続 き 試 料 を 添 加 します

26 20 2. 基 本 操 作 レポートポイントの 追 加 レポートポイントとは センサーグラムの 任 意 の 時 間 におけるレスポンス(RU)を 記 録 し たものです レポートポイントは レポートポイントテーブルに 表 示 されます 試 料 が 添 加 されると その 都 度 自 動 的 にレポートポイントが 取 得 されます 自 動 取 得 したレポー トポイント 以 外 にも 任 意 の 時 間 に 幾 つも 追 加 することが 可 能 です 補 足 2-3. 自 動 取 得 されるレポートポイント レポートポイントテーブル Id(レポートポイント 名 ) baseline_1 添 加 開 始 10 秒 前 binding _1 添 加 終 了 5 秒 前 stability _1 添 加 終 了 10 秒 後 baseline_1 のセンサーグラムの 高 さ(RU)は 0(ゼロ)RU (RelResp 0.0)に 自 動 設 定 されます binding_1 もしくは stability_1 の RelResp は baseline_1 からの 相 対 値 (RU)を 示 しています 2 つ 目 の 試 料 添 加 時 のレポートポイント 名 は baseline_2 binding_2 stability_2 と なります RelResp は baseline_2 からの 相 対 値 (RU)です Toolbar の Reference line アイコン( )または Menu bar の View Reference Line をク リックして センサーグラム 上 にリファレンスラインを 表 示 します

27 2. 基 本 操 作 21 マウスのカーソル( 矢 印 )をリファレンスラインの 縦 線 に 合 わせ 任 意 の 時 間 までドラッ グします または 任 意 の 時 間 上 のセンサーグラムをクリックし リファレンスラインを 移 動 させます Toolbar の Add Report point アイコン( )または Menu bar の Edit Report point をク リックします Id にコメントを 入 力 します 相 対 値 0(ベースライン)として 設 定 する 場 合 は Baseline を チェックします OK をクリックすると レポートポイントが 追 加 されます

28 22 2. 基 本 操 作 測 定 の 終 了 試 料 添 加 終 了 後 End Manual run アイコン( )または Menu bar の Commands End Run をクリックします 装 置 は 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります 2-2. ファイルの 保 存 得 られたセンサーグラムは 測 定 終 了 時 に 自 動 保 存 されます 追 加 したレポートポイントを 保 存 するには Menu bar の File Save をクリックします 2-3. データの 印 刷 File Print をクリックします 印 刷 したい 項 目 にチェックを 入 れ OK をクリックします File Properties Wizard Template または Method Wizard Results または Sensorgram Include event log for cycles ファイルプロパティ 測 定 内 容 測 定 結 果 Current Cycle 表 示 されているセンサーグ ラム Range 複 数 サイクル 存 在 する 場 合 の 必 要 な 部 分 のセンサーグラム All cycles すべてのセンサーグラムの 印 刷 イベントログ

29 3. 固 定 化 固 定 化 リガンド 相 互 作 用 を 検 討 する 分 子 のうち 固 定 化 する 分 子 をリガンドと 言 います リガンドの 精 製 度 は 結 合 特 異 性 の 判 定 やアナライトの 結 合 許 容 量 に 大 きく 影 響 します 直 接 固 定 化 を 行 う 場 合 には 90% 以 上 の 精 製 度 のリガンドを 使 用 してください 各 種 固 定 化 方 法 センサーチップ CM5 に 化 学 結 合 で 固 定 化 する 代 表 的 な 方 法 を 記 載 します 詳 細 およびそ の 他 の 固 定 化 方 法 については 生 体 分 子 相 互 作 用 解 析 攻 略 ガイド を 参 照 してください アミンカップリング 法 リガンド 表 面 に 存 在 するアミノ 基 (N 末 端 アミノ 基 またはリジンε-アミノ 基 )を 利 用 して 固 定 化 する 方 法 です CM(カルボキシメチル)デキストランのカルボキ シル 基 を NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)で 活 性 化 し リガンドを 固 定 化 し ます 固 定 化 後 残 った 活 性 NHS 基 をエタノールアミンでブロッキングします リガンドチオールカップリング 法 リガンドの 表 面 に 存 在 する 遊 離 型 チオール 基 を 用 いて -S-S- 結 合 で 固 定 化 する 方 法 です サーフェスチオールカップリング 法 センサー 表 面 にチオール 基 を 導 入 し リガンドのカルボキシル 基 を 介 して-S-S- 結 合 で 固 定 化 する 方 法 です アルデヒドカップリング 法 大 量 の 糖 鎖 を 持 つムチンタンパク 質 等 の 糖 を 利 用 して 固 定 化 をする 方 法 です 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 をメタ 過 ヨウ 素 酸 により 開 裂 させ アルデヒド 基 を 作 成 して ヒ ドラジンにより ヒドラジノ 基 を 導 入 したセンサーチップにシッフ 塩 基 で 固 定 化 します

30 24 3. 固 定 化 固 定 化 量 実 験 の 目 的 によって 調 節 する 必 要 があります 特 異 的 結 合 の 有 無 の 判 定 スクリーニング アナライトの 結 合 レスポンスが 十 分 得 られる 固 定 化 量 が 必 要 となります 固 定 化 量 の 下 限 として 理 論 的 最 大 結 合 量 R max( 固 定 化 したリガンドにアナライトが 最 大 量 結 合 したときのレスポンス)が 最 低 でも 20 RU は 必 要 です 理 論 的 な 最 大 結 合 量 は 以 下 の 式 で 算 出 できます アナライトの 最 大 結 合 レスポンス( 理 論 的 最 大 結 合 量 R max) =アナライトの 分 子 量 x リガンドの 固 定 化 量 /リガンドの 分 子 量 x S (Da) (RU) (Da) S はリガンドのアナライト 結 合 部 位 数 ( 例 ) リガンドの 分 子 量 50,000 Da リガンド 固 定 化 量 1,000 RU リガンド 結 合 部 位 数 1 アナライト 分 子 量 20,000 Da 理 論 的 最 大 結 合 量 (R max)= 20,000 x 1,000 / 50,000 x 1 = 400 RU 濃 度 測 定 固 定 化 量 はできるだけ 多 くします 目 安 として タンパク 質 リガンドの 場 合 10,000 RU 以 上 固 定 化 します 固 定 化 量 を 多 くすると 既 知 濃 度 アナライト 測 定 時 に 得 ら れる 結 合 レスポンス RU vs C( 濃 度 )をプロットした 検 量 線 の 直 線 性 が 高 くなりま す 反 応 速 度 定 数 (k a,k d) 解 離 定 数 (K D)の 算 出 固 定 化 量 はできるだけ 抑 えます マストランスポートリミテーション( 固 定 化 量 が 多 いことにより アナライトの 供 給 が 追 いつかない 現 象 )を 抑 制 するためです 至 適 固 定 化 量 は 以 下 の 式 から 算 出 される 最 大 と 最 小 の 固 定 化 量 (RU)の 範 囲 と なります 最 小 固 定 化 量 (RU) 40 x 1/S x (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) 最 大 固 定 化 量 (RU) 200 x 1/S x (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) S はリガンドのアナライト 結 合 部 位 数 ( 例 ) リガンドの 分 子 量 50 kda アナライトの 分 子 量 100 kda リガンド 結 合 価 数 1 最 小 固 定 化 量 40 x 1/1 x(50,000/100,000)= 20 RU 最 大 固 定 化 量 200 x 1/1 x(50,000/100,000)= 100 RU 至 適 固 定 化 量 範 囲 20~100 RU

31 3. 固 定 化 アミンカップリング 法 リガンド 表 面 に 存 在 するアミノ 基 (N 末 端 アミノ 基 またはリジンε-アミノ 基 )を 利 用 して 固 定 化 します CM デキストランのカルボキシル 基 を NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド) で 活 性 化 し 至 適 な 緩 衝 液 で 希 釈 したリガンドを 添 加 して 固 定 化 します 残 った 活 性 NHS 基 をエタノールアミンでブロッキングします 1NHS 活 性 化 2リガンドの 固 定 化 3ブロッキング 準 備 するもの アミンカップリングキット(BR ) アミンカップリングキットには 以 下 の 試 薬 が 含 まれています EDC (N-ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) NHS (N-hydroxysuccinimide) 1 M ethanolamine hydrochloride 溶 液 (ph 8.5) キットに 添 付 されている 説 明 書 に 従 い EDC および NHS はそれぞれ 10 ml の 超 純 水 に 溶 解 し 400 mm EDC 100 mm NHS を 調 製 します ただちに 200 μl ずつを 7 mm プラスチックバイアルにそれぞれ 分 注 し ラバーキャップをして 使 用 直 前 まで -20 で 冷 凍 保 存 してください ( 使 用 期 限 :2 か 月 ) 使 用 直 前 に 1 組 ずつの 試 薬 を 取 り 出 して 融 解 して 使 用 します 融 解 後 試 薬 の 再 凍 結 はできません エタ ノールアミンは 溶 液 で 供 給 されるので 冷 蔵 (4 ) 保 存 します 200 μl ずつ 小 分 けしておくか 使 用 する 直 前 に 分 注 します ランニング 緩 衝 液 1 級 アミンを 含 まない 緩 衝 液 を 準 備 してください (トリスやグリシン 緩 衝 液 は 1 級 アミンの 緩 衝 液 です ) リガンド アジ 化 ナトリウムなどの 求 核 性 物 質 を 含 まないものを 準 備 してください リガン ドの 安 定 化 目 的 のために 添 加 されている BSA(ウシ 血 清 アルブミン) ゼラチンな どのタンパク 質 類 は あらかじめ 除 去 するか 含 まれないものを 準 備 してください リガンド 希 釈 液 10 mm 酢 酸 緩 衝 液 10 mm HEPES 緩 衝 液 10 mm Borate/1 M NaCl 緩 衝 液 (ph 8.5)

32 26 3. 固 定 化 リガンドの 調 製 リガンドがタンパク 質 の 場 合 リガンドの 等 電 点 より 0.5~2 低 い ph の 緩 衝 液 を 用 いて 終 濃 度 5~200 μg/ml 程 度 になるよう リガンドを 希 釈 します 等 電 点 が 中 性 付 近 であれば 希 釈 用 緩 衝 液 として 10 mm 酢 酸 ナトリウム 緩 衝 液 (ph 4.0 ~ 5.5)を 用 います ph 3.5 以 下 のものは 使 用 しないでください 等 電 点 が 塩 基 性 であれば 希 釈 用 緩 衝 液 とし て 10 mm HEPES 緩 衝 液 (ph 6.0 ~ 8.0)を 用 います 等 電 点 が 不 明 な 場 合 も 既 知 の 場 合 も 固 定 化 前 に あらかじめ 27 ページに 示 し たウィザードの Immobilization ph Scouting により 至 適 なリガンド 希 釈 液 の ph を 検 討 します 濃 縮 効 果 が 確 認 できない 酸 性 タンパク 質 の 場 合 は サーフェスチオールカップリ ングもしくはリガンドをビオチン 化 後 センサーチップ SA に 固 定 化 する 方 法 を 検 討 します リガンドがペプチドや 低 分 子 物 質 の 場 合 100 μg/ml 以 上 の 高 濃 度 のリガンドを 使 用 し 弱 アルカリ 性 条 件 10 mm Borate/1 M NaCl 緩 衝 液 (ph 8.5)で 希 釈 します 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 との 反 応 効 率 が ph 8.5 前 後 でもっとも 高 いためです 溶 解 性 が 低 い 低 分 子 化 合 物 を 固 定 化 する 際 には DMSO などの 有 機 溶 媒 存 在 下 で 固 定 化 を 実 施 します 有 機 溶 媒 を 利 用 する 際 には 化 学 耐 性 を 英 語 版 マニュアル (Instrument handbook)で 確 認 してください

33 3. 固 定 化 リガンド 希 釈 液 の ph 選 択 センサーチップ CM5 表 面 にコーティングされている 直 鎖 デキストランにはカルボキシル 基 が 導 入 されているため 表 面 は 負 に 荷 電 しています リガンドを 正 に 荷 電 した 状 態 で 添 加 すると 負 に 荷 電 している CM デキストランとの 間 に 静 電 気 的 な 結 合 が 生 じ リガンドを CM デキストラン 中 に 濃 縮 させることができます この 濃 縮 効 果 のことを プレコンセント レーション 効 果 といいます この 条 件 を 用 いることで 低 濃 度 のリガンドをセンサーチップ 表 面 に 高 濃 度 で 供 給 でき 効 率 よく 固 定 化 することができます 等 電 点 が 既 知 のリガンドの 場 合 等 電 点 よりも 0.5 以 上 低 い ph を 使 用 する ただし 等 電 点 が 既 知 の 場 合 であって も 高 次 構 造 の 状 態 などにより 濃 縮 される ph が 予 想 外 に 異 なることもあるため 固 定 化 前 に ウィザードの Immobilization ph Scouting により 確 認 することをお 奨 めします 等 電 点 が 不 明 な 場 合 ウィザードの Immobilization ph Scouting を 実 行 し 希 釈 液 の ph を 検 討 します この 操 作 は 何 も 処 理 していないフローセル( 固 定 化 実 施 予 定 のセル)を 使 用 し て 各 ph におけるセンサー 表 面 へのリガンドの 濃 縮 度 合 いを 評 価 します この 検 討 で リガンドは 固 定 化 されません 検 討 後 引 き 続 き そのセルにリガンドを 固 定 化 してください リガンド 添 加 終 了 後 ランニング 緩 衝 液 に 置 換 されると 通 常 は 静 電 的 に 結 合 し たリガンドはセンサーチップ 表 面 から 速 やかに 解 離 します しかし まれにリガ ンドがデキストランに 非 特 異 的 吸 着 を 起 こすため Immobilization ph Scouting で は リガンド 添 加 終 了 後 洗 浄 溶 液 (50 mm NaOH)を 添 加 し 吸 着 したリガンド を 洗 浄 する 操 作 が 組 み 込 まれています

34 28 3. 固 定 化 Toolbar の Run Wizard アイコン( ます )または Menu bar の Run Wizard をクリックし Surface Preparation Immobilization ph Scouting を 選 択 し New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフ ォルダに 保 存 されているプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプ ログラムをハイライトにして Open をクリックします Flow path を 選 択 します 固 定 化 予 定 セルを 選 択 し( 偶 数 セルを 選 択 ) リガンド 希 釈 液 を 入 力 します (デフォルトの 変 更 も 可 能 です ) Next > をクリックします

35 3. 固 定 化 29 Ligand Solution リガンドの 名 称 contact time 添 加 時 間 (s) 通 常 は 60 s に 変 更 Flow rate 流 速 (μl/min) 10μl/min Surface regeneration Solution リガンド 添 加 終 了 後 のチップ 表 面 の 洗 浄 溶 液 (50 mm NaOH) 各 項 目 に 情 報 を 入 力 後 Next >をクリックします 固 定 化 操 作 を 始 める 前 に Prime および Normalize の 設 定 が 可 能 です Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 入 力 後 Next>をクリックします

36 30 3. 固 定 化 右 側 の 表 で 試 薬 の 位 置 と 必 要 量 (μl)を 確 認 します 表 をクリックすると 対 応 する 左 側 の ラック 上 のバイアル 位 置 が 強 調 表 示 になります 位 置 と 必 要 量 (μl)を 確 認 しながら 調 製 したリガンド 試 薬 バイアルをラックにセットします Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリック します

37 3. 固 定 化 31 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 の 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォ ルダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save をクリッ クすると 測 定 が 開 始 します

38 32 3. 固 定 化 Immobilization ph Scouting 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 ph の 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます (Control Software 上 の 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 されています )

39 3. 固 定 化 33 補 足 3-1. Immobilization ph Scouting の 評 価 ph4 ph4.5 ph5 ph5.5 濃 縮 効 果 が 確 認 できる もっとも 高 い ph を 固 定 化 条 件 として 採 用 します 上 記 結 果 では ph4 がもっとも 濃 縮 効 果 が 高 いが ph が 低 いほど 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 とのカップリング 効 率 は 低 下 します( 活 性 化 NHS 基 とアミノ 基 の 至 適 反 応 条 件 は ph8.5 です) また タンパク 質 の 安 定 性 は 一 般 的 に 中 性 に 近 い 程 安 定 です ph を 変 化 させても 濃 縮 効 果 ( 添 加 時 の 傾 き)に 極 端 な 差 がない 場 合 は ph が 高 い 条 件 を 選 択 するのが 望 まし いです 上 記 結 果 では ph5 を 選 択 します なお Immobilization ph Scouting における 濃 縮 レベル 以 上 の 固 定 化 は 困 難 です 確 認 した 濃 縮 レベル(RU)よりもっと 多 くの 固 定 化 量 を 望 む 場 合 は リガンド 濃 度 を 上 げて( 例 100 μg/ml 等 ) 再 度 Immobilization ph Scouting を 実 施 し 濃 縮 レベルを 確 認 してください

40 34 3. 固 定 化 基 本 プロトコールでの 固 定 化 Toolbar の Run Wizard アイコン( ます )または Menu bar の Run Wizard をクリックし Surface Preparation Immobilization を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプ ログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダ に 保 存 されているプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラ ムをハイライトにして Open をクリックします Chip type のプルダウンメニューで 使 用 するセンサーチップ(CM5)を 選 択 します Flow cells per cycle で 一 度 に 固 定 化 するセルの 数 を 選 択 します 通 常 1 を 選 択 します キャプチャー 法 を 使 用 する 場 合 で キャプチャー 分 子 を 複 数 セルに 固 定 化 する 場 合 には 2 または 4 を 選 択 します

41 3. 固 定 化 35 固 定 化 する Flow cell にチェックを 入 れます 固 定 化 は 偶 数 セルを 選 択 するのが 望 ましい です ( 通 常 リファレンスセルとして Fc1 または Fc3 を 使 用 します ) Method 固 定 化 方 法 を 選 択 します (ここでは Amine を 選 択 します ) Ligand リガンドの 名 称 を 入 力 します 標 準 プロトコールでは NHS 活 性 化 とブロッキングは 流 速 10 μl/min 添 加 7 分 間 と 固 定 さ れています リガンドの 添 加 条 件 については 以 下 の 項 目 から 選 択 します Aim for immobilized level リガンドの 固 定 化 量 を 調 節 して 固 定 化 できます Specify contact time and flow rate リガンドの 添 加 時 間 と 流 速 を 指 定 して 固 定 化 できます Blank Immobilization リガンドは 添 加 しません NHS 活 性 化 後 エタノールアミンでブロッキン グしたリファレンスセルを 作 成 できます ここでは Specify contact time and flow rate を 選 択 し 標 準 的 な 条 件 添 加 時 間 420(s) 流 速 10(μl/min)を 入 力 します Next >をクリックします 補 足 3-2. 標 準 プロトコールの 変 更 Specify contact time and flow rate は 活 性 化 時 間 およびブロッキング 時 間 は 7 分 間 と 指 定 さ れています 固 定 化 量 を 多 くする 目 的 で 添 加 時 間 を 長 くしたいなど 既 存 のメソッドを 変 更 する 場 合 は 画 面 左 下 の Custom Methods をクリックします 画 面 上 部 に 既 存 のメソッドが 表 示 されている Amine をクリックし ハイライトにします

42 36 3. 固 定 化 画 面 右 上 の Copy をクリックします Methods:に コピーしたメソッドが 追 加 されます コピーしたメソッドの 各 項 目 の 条 件 を 変 更 することができます 変 更 したいコマンドをダ ブルクリックするか またはクリックして Edit をクリックします ( 例 )EDC/NHS の 項 目 必 要 に 応 じて 流 速 および 添 加 時 間 を 変 更 後 OK をクリックします 変 更 後 右 下 の OK をクリックします

43 3. 固 定 化 37 固 定 化 操 作 を 始 める 前 に Prime および Normalize の 設 定 が 可 能 です Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 Next >をクリックします 右 側 の 表 で 試 薬 の 位 置 と 必 要 量 (μl)を 確 認 します 表 をクリックすると 対 応 する 左 側 のラ ック 上 のバイアル 位 置 が 強 調 表 示 になります 位 置 と 必 要 量 を 確 認 しながらバイアルをラ ックにセットします

44 38 3. 固 定 化 EDC 89 μl/ 7 mm プラスチックバイアル NHS 89 μl/ 7 mm プラスチックバイアル 空 (NHS/EDC 混 合 用 ) 空 / 7 mm プラスチックバイアル Ethanolamine 129 μl/ 7 mm プラスチックバイアル Ligand 98 μl/ 7 mm プラスチックバイアル 固 定 化 時 間 流 速 を 変 更 した 場 合 には 必 要 量 が 変 わります Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 して OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じ た 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックします 基 本 的 な 注 意 事 項 固 定 化 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォ ルダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測

45 3. 固 定 化 39 定 がスタートします 固 定 化 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 的 に 保 存 されます 補 足 3-3. 緊 急 停 止 測 定 開 始 後 プログラムを 緊 急 停 止 したい 場 合 には キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キー を 同 時 に 押 してください 1 NHS/EDC 2 Ligand 3 Ethanolamine 固 定 化 量 固 定 化 量 (RU)が 別 途 表 示 されます

46 40 3. 固 定 化 補 足 3-4. 固 定 化 量 の 確 認 固 定 化 量 として Response Bound と Response Final の 2 種 類 が 表 示 されます Bound Final リガンド 添 加 前 後 のセンサーグラムの 高 さの 差 NHS/EDC 添 加 前 からエタノールアミン 添 加 終 了 後 の 差 リガンドがアグリゲーションしている 場 合 やセンサーチップ 表 面 に 吸 着 する 場 合 は エタ ノールアミンを 添 加 することにより 非 共 有 結 合 でセンサーチップ 表 面 に 残 ったリガンド は 洗 い 流 されるため Final のレスポンスは Bound より 小 さくなります また 固 定 化 量 が 少 ない 場 合 は NHS 化 した 部 分 の 大 半 に( 一 部 はリガンドが 導 入 されている)エタノール アミンが 導 入 されるため Final のレスポンスは Bound より 大 きくなることがあります い ずれの 場 合 も レスポンスが 小 さい 方 を 固 定 化 量 として 採 用 してください

47 3. 固 定 化 固 定 化 量 を 調 節 して 固 定 化 反 応 速 度 定 数 の 算 出 を 目 的 とした 実 験 の 場 合 固 定 化 量 を 少 なく 調 節 する 必 要 があります この 場 合 リガンドの 添 加 方 法 として Aim for Immobilized level を 使 用 すると 便 利 です 固 定 化 量 をできるだけ 多 くしたい 場 合 には この 方 法 は 不 向 きです この 場 合 は リガン ド 添 加 時 間 を 長 くして 固 定 化 してください ( 補 足 3-2 参 照 ) Toolbar の Run Wizard アイコン( ます )または Menu bar の Run Wizard をクリックし Surface Preparation Immobilization を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプ ログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダ に 保 存 されているプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラ ムをハイライトにして Open をクリックします

48 42 3. 固 定 化 Chip type のプルダウンメニューで 使 用 するセンサーチップ(CM5)を 選 択 します 固 定 化 する Flow cell を 選 択 します Aim for immobilized level にチェックを 入 れます Method 固 定 化 方 法 Amine を 選 択 Ligand リガンドの 名 称 Target level 目 標 固 定 化 量 (RU) Wash solution 固 定 化 前 のリガンドテスト 添 加 後 のチップ 表 面 洗 浄 液 (50 mm NaOH) 各 項 目 に 情 報 を 入 力 後 Next >をクリックします 以 下 測 定 方 法 は 37~40 ページを 参 照 してください

49 3. 固 定 化 43 リガンドのテスト 添 加 洗 浄 リガンド 添 加 Immobilization Results ダイアログに 固 定 化 量 (RU)が 表 示 されます 目 標 固 定 化 量 に 到 達 したかは Target Reached に 表 示 されます 最 終 的 な 固 定 化 量 は 前 章 と 同 様 に 値 が 小 さ い Response を 採 用 してください

50 44 3. 固 定 化 補 足 3-5. 固 定 化 ウィザードの 中 断 このウィザードでは NHS 活 性 化 前 に リガンド 溶 液 をテスト 添 加 し 濃 縮 効 果 が 得 られる か また その 結 果 から 目 的 の 固 定 化 量 が 調 節 できる 条 件 であるかを 判 断 します リガンド 条 件 に 問 題 がある 場 合 この 時 点 でプログラムが 自 動 的 に 終 了 します リガンド は 固 定 化 されていないので リガンド 溶 液 を 調 製 し 直 し 同 じフローセルに 再 度 固 定 化 を 試 みてください Preconcentration binding is too fast 濃 縮 効 果 が 強 すぎ 添 加 時 間 を 短 くしても 目 標 のレベル 以 上 固 定 化 され ると 判 断 された 場 合 に 表 示 されます 希 釈 緩 衝 液 の ph を 上 げるか リガ ンド 濃 度 を 下 げる 必 要 があります Preconcentration binding is too slow 濃 縮 効 果 が 不 十 分 または 観 察 されず 添 加 時 間 を 長 くしても 目 標 のレベ ルまで 固 定 化 できないと 判 断 された 場 合 に 表 示 されます 希 釈 緩 衝 液 の ph を 下 げるか リガンド 濃 度 を 上 げる 必 要 があります

51 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 マニュアル 操 作 により アナライトの 特 異 的 結 合 を 確 認 します 必 要 であれば 引 き 続 き 再 生 条 件 を 検 討 します 再 生 条 件 が 決 まったら 同 一 濃 度 のアナライトを 添 加 し 再 現 性 を 確 認 します なお シングルサイクル 法 で 速 度 定 数 解 離 定 数 を 算 出 する 場 合 には 再 生 条 件 の 検 討 は 必 要 ありません アナライト リガンドを 固 定 化 したセンサーチップに 対 して リガンドとの 結 合 を 測 定 する 目 的 で 添 加 する 分 子 を 指 します 血 清 や 培 養 上 清 等 のクルード(crude)なサンプルを 使 用 できますが 不 溶 性 の 粒 子 などは 遠 心 などで 除 去 してください 反 応 速 度 定 数 や 解 離 定 数 算 出 を 目 的 と した 実 験 の 場 合 は アナライトの 精 製 度 が 高 く モル 濃 度 が 既 知 である 必 要 があります アナライトの 調 製 ランニング 緩 衝 液 で 希 釈 してください 希 釈 できない 場 合 は ゲルろ 過 などを 使 用 してランニング 緩 衝 液 で 緩 衝 液 交 換 するか ランニング 緩 衝 液 自 体 をアナライ ト 溶 解 液 条 件 に 合 わせることが 必 要 となります 緩 衝 液 が 異 なる 場 合 には 溶 液 効 果 (Bulk Effect:ランニング 緩 衝 液 と 添 加 溶 液 (アナライトなど)の 密 度 の 差 に より 発 生 するレスポンスの 差 )が 発 生 します 反 応 速 度 定 数 や 解 離 定 数 の 算 出 を 目 的 とした 実 験 においては 結 合 領 域 (アナライト 溶 解 液 )と 解 離 領 域 (ランニ ング 緩 衝 液 )が 異 なる 緩 衝 液 組 成 条 件 下 の 測 定 になり 解 析 結 果 に 影 響 を 与 える 可 能 性 があります アナライト 濃 度 は 結 合 の 強 さや 分 子 量 にもよりますが 数 十 ng/ml~ 数 百 μg/ml で 測 定 します 反 応 速 度 定 数 を 算 出 する 場 合 には 予 想 される K D( 解 離 定 数 ) 値 の 1/10~10 倍 のモル 濃 度 で 解 析 すると 良 好 な 結 果 が 得 られます 予 備 検 討 時 は 結 合 が 弱 いことや 再 生 条 件 (リガンドに 結 合 したアナライトを 溶 出 し リガンド 固 定 化 表 面 を 固 定 化 直 後 の 状 態 に 再 生 する 操 作 )を 検 討 する 必 要 性 を 考 慮 し 高 濃 度 (タンパク 質 アナライトの 場 合 数 ~ 数 十 μg/ml)を 用 いるのが 望 ましいです リファレンスセル 溶 液 効 果 および 非 特 異 的 吸 着 を 差 し 引 くために 必 ずリファレンスセルへもアナライトを 添 加 してください リファレンスセルは 未 処 理 のセル 活 性 化 ブロッキングセル ネ ガティブコントロール 固 定 化 セルなどを 利 用 します

52 46 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 再 生 溶 液 リガンドに 結 合 したアナライトを 強 制 的 に 解 離 させる 操 作 を 再 生 といいます 解 離 が 速 い 相 互 作 用 では ランニング 緩 衝 液 が 流 れることで 短 時 間 でアナライトが 完 全 に 解 離 する ため 再 生 の 必 要 がありません 解 離 速 度 が 遅 い 相 互 作 用 の 場 合 には 適 当 な 塩 酸 アル カリ 溶 液 をアナライト 結 合 表 面 に 30 秒 ~1 分 間 添 加 し 再 生 します 至 適 な 再 生 条 件 (どの 溶 液 で 何 分 間 何 回 添 加 するか)は 分 子 間 ごとに 異 なるため その 都 度 検 討 が 必 要 とな ります 理 想 的 な 再 生 条 件 リガンドの 活 性 が 失 われない 条 件 アナライトを 完 全 に 解 離 する 条 件 リガンドがセンサーチップ 表 面 から 遊 離 しない 条 件 補 足 4-1. 再 生 溶 液 の 種 類 再 生 溶 液 は 通 常 以 下 のようなものが 使 用 されます 検 討 の 際 にはマイルドな 条 件 から 検 討 してください( 塩 溶 液 酸 溶 液 アルカリ 溶 液 ) 添 加 時 間 は 1 分 以 内 で 検 討 します 試 薬 塩 NaCl 濃 度 あるいは ph < 2 M 酸 性 条 件 アルカリ 条 件 10 mm Gly-HCl > ph 1.5 HCl < 100 mm Phosphoric acid < 100 mm Formic acid < 20 % 10 mm Gly-NaOH < ph 12 NaOH < 100 mm Ethanolamine < 100 mm Ethanolamine-HCl < 1 M キレート 剤 EDTA 多 価 カチオン 依 存 性 反 応 の 場 合 < 0.35 M 界 面 活 性 剤 Surfactant P-20 (Tween 20) < 5 % Triton X-100 < 5 % SDS < 0.5 % Octylglucoside < 40 mm 有 機 溶 媒 Acetonitrile < 20% DMSO < 8% Ethylene glycol in HBS Buffer < 50% Ethanol < 20% Formamide < 40% 変 性 剤 Guanidine-HCl Urea < 5M < 8M

53 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 47 Toolbar の Start Manual run アイコン( リックします )または Menu bar の Run Manual run をク 流 速 (Flow rate)( 30 μl/min)を 入 力 します Flow path でアナライトを 添 加 するリファレ ンスセルと 固 定 化 セルを 選 択 します 必 ず Reference subtraction でリファレンスセルの 差 し 引 きを 設 定 します ( 選 択 肢 として 2-1, 4-3 または 2-1, 3-1, 4-1 があります ) Rack の 種 類 を 選 択 し Start をクリックします 測 定 結 果 の 保 存 先 を 指 定 し File name を 入 力 して Save をクリックします

54 48 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 センサーグラムが 表 示 され 測 定 が 開 始 されます 補 足 4-2. センサーグラムの 表 示 変 更 View Show Only Current Curve 選 択 したセンサーグラムを 1 本 表 示 します 右 上 のカーブリストから 表 示 するセンサーグラムを 選 択 します View Show All Curves すべてのセンサーグラムを 表 示 します View Show Curves of Same Type センサーグラムを 種 類 別 に 表 示 します 右 上 のカーブリストから 各 フローセルのセンサーグラムもしくは 差 し 引 きセン サーグラムのいずれかを 選 択 して 表 示 することができます Inject command アイコン( します ; 赤 色 )または Menu bar の Commands Inject を 選 択

55 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 49 アナライトの 位 置 (Vial/well position)および 添 加 時 間 (contact time)60~120 秒 を 入 力 すると Inject ダイアログの 右 下 に 必 要 なサンプル 量 が 表 示 されます 一 旦 Cancel をクリックし Eject rack tray アイコン( )または Menu bar の Commands Eject Rack を 選 択 します ラックトレイを 取 り 出 して アナライトを 分 注 したバイアルをセットします ラックトレ イを 再 び 本 体 に 戻 して OK をクリックします Inject command アイコンを 選 択 します アナライトの 位 置 および 添 加 時 間 (s)を 入 力 します OK をクリックします アナライトの 結 合 を 確 認 します 再 生 の 必 要 がある 場 合 には 引 き 続 き 検 討 します

56 50 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 Regeneration command アイコン( Regeneration を 選 択 します ; 青 色 )または Menu bar の Commands 再 生 溶 液 の 位 置 および 添 加 時 間 (30~60s)を 入 力 して OK をクリックします ( 再 生 溶 液 をセットしていない 場 合 には 必 要 容 量 確 認 後 一 旦 Cancel をクリックして バイアルをセットします ) レポートポイントまたはリファレンスラインウィンドウを 利 用 して 再 生 溶 液 添 加 後 のレ スポンス (RU) が アナライト 添 加 前 のレスポンス (RU) に 近 いかどうかを 確 認 します 不 十 分 な 場 合 には 引 き 続 き 検 討 します 固 定 化 リガンドの 活 性 および 再 現 性 を 確 認 します

57 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 51 New Cycle アイコン( ;アイコンが 並 んでいる 下 段 左 から 1 番 目 )をクリックし 測 定 サイクルを 切 り 替 えます 同 濃 度 のアナライトを 添 加 し 前 回 のアナライト 結 合 レスポン スと 比 較 してください 引 き 続 き 再 生 します すべての 検 討 が 終 了 したら End Manual run アイコン( )または Menu bar の Commands End Run をクリックします 装 置 は 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります 測 定 データははじめに 入 力 したファイル 名 で 自 動 的 に 保 存 されます 補 足 4-3. リファレンスウィンドウを 利 用 した 再 生 の 確 認 方 法 Tool bar の Reference Line アイコン( )あるいは View Reference Line をクリックし センサーグラム 上 にリファレンスラインを 表 示 させます 同 時 にセンサーグラム 左 上 にリ ファレンスラインウィンドウ( )が 表 示 されます マウスのカーソル( 矢 印 )をリファレンスラインの 縦 線 上 に 移 動 後 マウスの 左 ボタンを ドラッグし ベースラインを 取 りたい 時 間 に 移 動 します もしくはベースラインを 取 りた い 場 所 のセンサーグラム 上 の 位 置 でカーソルをクリックし リファレンスラインを 移 動 し ます View Base Line をクリックする(もしくは F9 ボタンを 押 す)と リファレンスライン ウィンドウのレスポンスが 相 対 値 0 となります リファレンスラインの 縦 軸 にもう 一 度 カ ーソルをあわせ 左 ボタンでドラッグし 移 動 させると リファレンスウィンドウにベース ラインとして 設 定 した 位 置 からのレスポンスが 表 示 されます

58 52 4. マニュアル 測 定 による 相 互 作 用 の 条 件 検 討 補 足 4-4. ウィザードを 用 いた 再 生 条 件 の 検 討 Application Wizard/ Assay Development/ Regeneration Scouting 複 数 の 再 生 溶 液 を 用 いて 各 再 生 溶 液 で 設 定 した 添 加 条 件 で 最 大 5 回 まで ア ナライト 結 合 量 の 変 化 とベースラインの 安 定 性 を 評 価 できます Application Wizard/ Assay Development/ Surface Performance 決 定 した 再 生 条 件 でセンサーチップの 安 定 性 を 評 価 できます 400 回 までの 繰 り 返 し 測 定 が 可 能 です

59 5. 相 互 作 用 測 定 相 互 作 用 測 定 実 験 目 的 に 応 じたウィザードまたはメソッドのテンプレートに サンプル 名 や 添 加 情 報 お よび 再 生 条 件 等 必 要 事 項 を 入 力 するだけで プログラムを 組 み 立 てることができます この 章 では 反 応 速 度 定 数 および 解 離 定 数 の 算 出 (マルチサイクル 法 およびシングルサイ クル 法 )のテンプレートを 利 用 した 基 本 的 なプログラム 作 成 について 記 載 します その 他 アプリケーションの 測 定 方 法 および 解 析 手 法 は BiacoreT200 応 用 編 をご 覧 ください メソッド 作 成 方 法 の 詳 細 は 6 章 を 参 照 してください ウィザードテンプレートを 利 用 反 応 速 度 定 数 および 解 離 定 数 の 算 出 マルチサイクル 法 Kinetics/Affinity 54 ページ 濃 度 測 定 Concentration Analysis 応 用 編 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング Binding Analysis 応 用 編 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 Thermodynamics 応 用 編 低 分 子 化 合 物 アナライトの 反 応 速 度 定 数 および 解 離 定 数 の 算 出 Kinetics/Affinity 応 用 編 免 疫 原 性 試 験 Immunogenicity 応 用 編 メソッドテンプレートを 利 用 反 応 速 度 定 数 および 解 離 定 数 の 算 出 シングルサイクル 法 Single-cycle kinetics 93 ページ 検 量 線 不 要 の 濃 度 測 定 Calibration-Free Concentration 応 用 編 低 分 子 化 合 物 アナライトのスクリーニング LMW screen 応 用 編 結 合 アナライトの 回 収 Inject and recover 応 用 編

60 54 5. 相 互 作 用 測 定 5-1. 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 の 算 出 マルチサイクル 法 マルチサイクル 法 とシングルサイクル 法 1 濃 度 のアナライト 添 加 とリガンドの 再 生 操 作 を 1 サイクルとして 濃 度 が 異 なるアナライ トを 繰 り 返 し 測 定 し 得 られたセンサーグラムから 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 を 算 出 する 方 法 をマルチサイクル 法 といいます 一 方 異 なるアナライト 濃 度 系 列 を 再 生 操 作 なしに 低 濃 度 側 から 連 続 添 加 し 得 られたセンサーグラムを 利 用 して 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 を 算 出 する 方 法 をシングルサイクル 法 といいます マルチサイクル 法 シングルサイクル 法 再 生 溶 液 添 加 アナライト 添 加 アナライト 添 加 アフィニティーとカイネティクス 分 子 同 士 が 相 互 作 用 する 時 には 両 者 にはアフィニティー( 親 和 性 )があると 表 現 します 解 離 定 数 は アフィニティーの 強 さを 表 す 尺 度 として 一 般 的 に 使 用 され K D( 単 位 M)と して 記 述 されます その 逆 数 1/ K D(= K A 単 位 1/M)が 用 いられることもあります 解 離 定 数 は A+B AB 反 応 の 平 衡 状 態 において K D = [A][ B]/[AB]と 定 義 されます 形 成 さ れる 複 合 体 の 割 合 が 多 いほど つまり この 数 値 が 小 さいほどアフィニティーは 強 いと 表 現 できます Biacore を 用 いたカイネティクス 解 析 では アフィニティーは その 分 子 間 の 反 応 速 度 定 数 から 算 出 します( K D = k d / k a ) 速 い 結 合 および 遅 い 解 離 の 相 互 作 用 ほど ア フィニティーは 強 くなります これら 反 応 速 度 (カイネティクス)に 関 するパラメータは 結 合 速 度 定 数 (k a 単 位 M -1 s -1 ) 解 離 速 度 定 数 (k d 単 位 s -1 )として 表 現 されます A + B ka kd AB KD = kd /ka KA = ka /kd

61 5. 相 互 作 用 測 定 55 解 離 定 数 (K D) 反 応 速 度 定 数 (k a k d)の 算 出 方 法 カイネティクス 解 析 では 得 られたセンサーグラムに 直 接 反 応 速 度 式 をカーブフィッティ ングさせ 非 線 形 最 小 二 乗 法 により 定 数 を 導 き 出 します R = f (ka, kd, Rmax, C,...) k aを 変 化 させると k dを 変 化 させると アフィニティーの 弱 い( 結 合 解 離 が 速 い) 相 互 作 用 の 場 合 反 応 はきわめて 速 く 平 衡 状 態 (Req)へと 移 行 しますが 複 合 体 の 安 定 性 は 悪 いため センサーグラムは 箱 型 とな ります 結 合 領 域 および 解 離 領 域 はきわめて 短 く カーブフィッティングによる 反 応 速 度 定 数 の 算 出 は 困 難 です アフィニティーが 強 い 反 応 アフィニティーが 弱 い 反 応 カーブフィッティングによる 解 析 Req vs C のプロットからの 平 衡 値 解 析 このような 場 合 アナライト 濃 度 (C)に 対 する 平 衡 値 (Req)のプロットから 親 和 定 数 (K A)あるいは 解 離 定 数 (K D)を 算 出 します 平 衡 状 態 では 以 下 の 関 係 式 が 成 り 立 ちます Req = C R max / (C + KD) Req (RU) e- 2e- 3e- 4e- 5e- 6e- 7e- 8e- 9e- 1e- C (M)

62 56 5. 相 互 作 用 測 定 至 適 なアナライト 濃 度 良 好 な 結 果 を 得 るためには 予 想 される 解 離 定 数 (K D) 値 の 1/10~10 倍 の 濃 度 で 測 定 しま す 結 合 速 度 または 解 離 速 度 が 遅 く 結 合 領 域 のセンサーグラムの 傾 きが 直 線 的 な 場 合 に は センサーグラムのカーブが 得 られる 高 濃 度 領 域 も 測 定 すると 良 好 な 解 析 結 果 が 得 られ ます また 5 段 階 以 上 の 濃 度 系 列 と 濃 度 0(アナライトを 含 まない 緩 衝 液 のみ)について 測 定 し 1 濃 度 については 再 現 性 の 確 認 目 的 で 2 回 (n=2) 測 定 します アフィニティーが 弱 く 箱 型 のセンサーグラムになり カイネティクス 解 析 が 困 難 な 場 合 は 10 段 階 以 上 の 濃 度 系 列 と 濃 度 0 について 測 定 します 濃 度 範 囲 は 高 濃 度 側 まで 幅 広 く とることを 推 奨 します 至 適 な 流 速 30 μl/min 以 上 の 高 流 速 に 設 定 します アナライト 添 加 時 間 と 解 離 時 間 通 常 は 添 加 2 分 程 度 解 離 2 分 程 度 で 測 定 します ただし 結 合 速 度 が 遅 く 結 合 領 域 の センサーグラムが 直 線 的 な 場 合 には カーブが 得 られるよう 添 加 時 間 を 5~10 分 程 度 にし ます また 解 離 速 度 が 遅 く 解 離 領 域 の 傾 きがほとんど 確 認 できない 場 合 には 解 離 時 間 を 10~30 分 程 度 で 測 定 します

63 5. 相 互 作 用 測 定 プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( ます )または Menu bar の Run Wizard をクリックし Assay Kinetics/Affinity を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダに 保 存 されて いるプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラムをハイライ トにして Open をクリックします

64 58 5. 相 互 作 用 測 定 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します Detection Flow path 2-1 または 4-3 から 選 択 します Chip Chip type 利 用 するセンサーチップの 種 類 を 選 択 します Capture アナライトの 添 加 前 に 固 定 化 したキャプチャー 分 子 に 対 して リガンドを 捕 捉 する 場 合 にチェックを 入 れます リガンドは フローセル 2 もしくはフローセル 4 にキャプチャーされます Sample アナライトの 添 加 Regeneration 再 生 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます 添 加 回 数 を 選 択 します (1 or 2 回 ) Carry Over アナライト 添 加 後 アナライトがキャリーオーバーするかどうかランニング 緩 衝 液 を 添 加 して 確 認 する 場 合 にチェックします Next >をクリックします ダミーランサイクルを 設 定 します Startup Solution 指 定 した 溶 液 で 相 互 作 用 測 定 と 同 様 の 工 程 をアナラ イト 測 定 前 に 実 施 します 通 常 は ランニング 緩 衝 液 を

65 5. 相 互 作 用 測 定 59 Number of cycles 用 います サイクル 数 です 3 回 以 上 を 推 奨 します Next >をクリックします Sample contact time アナライトの 添 加 時 間 通 常 120 s Flow rate 流 速 通 常 30 μl/min Dissociation time 解 離 時 間 通 常 120 s Regeneration( 再 生 条 件 を 検 討 し 確 定 した 条 件 を 入 力 します) Solution 再 生 溶 液 の 名 称 High viscosity solution 粘 性 の 高 い 溶 液 (40% エチレングリコール 以 上 )の 場 合 はチェックを 入 れてください contact time 再 生 溶 液 の 添 加 時 間 Flow rate 流 速 Stabilization period 再 生 溶 液 添 加 後 のベースライン 安 定 化 時 間 ( 必 要 に 応 じて 設 定 します ) 入 力 後 Next >をクリックします

66 60 5. 相 互 作 用 測 定 Sample id アナライトの 名 称 MW (Da) アナライトの 分 子 量 Concentration アナライトの 濃 度 ( 単 位 も 選 択 ) 分 子 量 と 濃 度 を 入 力 すると 自 動 的 に モル 濃 度 nm と 重 量 濃 度 μg/ml を 換 算 します 入 力 後 Next >をクリックします 補 足 5-1. アナライト 濃 度 測 定 サンプル 濃 度 は アナライト 5 段 階 以 上 の 濃 度 シリーズ と 0(ゼロ) 濃 度 の 測 定 を 推 奨 しています また 測 定 中 のリガンドの 安 定 性 確 認 のために 0(ゼロ) 以 外 で 最 低 1 濃 度 を 2 回 測 定 することも 推 奨 しています このルールに 従 わない 場 合 Next >をクリック した 時 に 推 奨 項 目 を 列 挙 した 画 面 が 表 示 されます 推 奨 を 無 視 して 測 定 する 場 合 は Ignore をクリックし 次 のステップに 進 んでください

67 5. 相 互 作 用 測 定 61 補 足 5-2. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 することができます 測 定 を 始 める 前 に Prime および Normalize を 実 施 したい 場 合 はチェックをします Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 Cycle Run List をクリックすると 測 定 サイクルの 確 認 ができます Next >をクリックします

68 62 5. 相 互 作 用 測 定 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 5-3. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Simple Position Import でそのファイル を 読 み 込 むと サンプル 位 置 が 変 更 されます

69 5. 相 互 作 用 測 定 63 補 足 5-4. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 設 定 が 可 能 です Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 してください

70 64 5. 相 互 作 用 測 定 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリック します 基 本 的 な 注 意 事 項 固 定 化 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォ ルダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

71 5. 相 互 作 用 測 定 65 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save をクリッ クすると 測 定 が 開 始 されます 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます 補 足 5-5. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 します

72 66 5. 相 互 作 用 測 定 カーブフィッティングによる 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 自 動 保 存 された 取 得 データが 開 きます 補 足 5-6. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします リガンド 名 の 変 更 は 右 下 の Edit Chip Information をクリックして 変 更 します

73 5. 相 互 作 用 測 定 67 補 足 5-7. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニューを 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

74 68 5. 相 互 作 用 測 定 Toolbar の をクリック 後 をクリックします 同 一 サンプル 名 のセンサーグラムがすべて 重 ね 書 き 表 示 されます Select Evaluation mode で 解 析 方 法 を 選 択 します 1 サンプルごとに 解 析 する 場 合 には Single mode を 選 択 します 複 数 サンプルをバッチ 解 析 する 場 合 は Batch mode を 選 択 し ます Bath mode については 補 足 5-14 を 参 照 してください 複 数 のサンプルについて 同 時 に 測 定 している 場 合 は Sample: 右 側 の 別 サンプルのデータに 移 行 できます をクリックすると ゼロ 濃 度 のブランクサイクルを 複 数 回 測 定 している 場 合 センサーグラム 下 の Show average blank(s)にチェックを 入 れると 平 均 したセンサーグラムが 表 示 されます エアーの 混 入 などの 理 由 で 解 析 データから 削 除 したいセンサーグラムがある 場 合 は そ のセンサーグラムについて テーブル 中 の Include カラムのチェックを 外 してください

75 5. 相 互 作 用 測 定 69 自 動 的 にテーブル 下 のチャートから チェックを 外 したセンサーグラムは 消 えます Next >をクリックします

76 70 5. 相 互 作 用 測 定 濃 度 0 のセンサーグラムが ブランクとして 全 センサーグラムから 差 し 引 かれます Kinetics >をクリックします 補 足 5-8. センサーグラムの 部 分 的 削 除 エアーの 混 入 や 添 加 開 始 終 了 点 のノイズなど 解 析 データの 中 から 一 部 削 除 したい 領 域 がある 場 合 には マウスの 左 ボタンをドラッグし 該 当 の 領 域 を 拡 大 したのち マウスの 右 ボタンをドラッグして 削 除 する 領 域 を 選 択 します 拡 大 図 を 解 除 する 場 合 は センサーグ ラムを 含 まない 余 白 をダブルクリックすると 一 つ 前 の 縮 小 画 面 に 戻 ります 領 域 を 選 択 すると グラフの 右 上 の Remove Selection ボタンがアクティブになります ボ タンをクリックすると 選 択 部 位 が 削 除 されます

77 5. 相 互 作 用 測 定 71 Model:に フィッティングに 採 用 する 反 応 モデル 式 を 選 択 します をクリックすると す べての 反 応 モデルが 表 示 されます 反 応 モデルが 不 明 な 場 合 は 1:1 Binding を 選 択 します 選 択 後 Fit をクリックします

78 72 5. 相 互 作 用 測 定 補 足 5-9. 反 応 モデル リガンドを B アナライトを A とします 1:1 Binding A + B AB リガンドとアナライトが 1 分 子 同 士 で 結 合 するもっとも 単 純 な 反 応 モデル Bivalent Analyte A + B AB, AB + B AB2 アナライトが 2 価 もしくはホモ 2 量 体 の 反 応 モデル AB 複 合 体 形 成 後 リガンド B が 2 次 的 に 結 合 する 反 応 Heterogeneous Analyte A1 + B A1B, A2 + B A2B 競 合 反 応 リガンド 上 の 1 種 類 の 結 合 部 位 を 2 種 類 のアナライトが 競 合 する 反 応 Heterogeneous Ligand A + B1 AB1, A + B2 AB2 アナライトに 対 して 親 和 性 の 異 なる 2 つの 結 合 部 位 を 持 つリガンドにアナライト が 並 行 して 結 合 する 反 応 モデル Two state Reaction A + B AB AB* リガンドとアナライトの 1 分 子 同 士 の 結 合 であるが 複 合 体 形 成 後 コンフォメー ション 変 化 を 起 こす 反 応 モデル 解 析 結 果 が 表 示 されます

79 5. 相 互 作 用 測 定 73 黒 色 のセンサーグラムは フィッティングにより 得 られたフィッティングカーブです 既 存 の 1:1 Binding モデルで 解 析 した 場 合 には Quality Control テーブルが 表 示 され 解 析 結 果 の 評 価 が 表 示 されます 補 足 解 析 結 果 の Quality Control 5 項 目 の 品 質 評 価 結 果 が ステータスマークで 表 示 されます ステータスマーク クオリティーアセスメントにパスしています クオリティーアセスメントの 許 容 限 界 に 近 いです クオリティーアセスメントにパスしていません ニュートラルまたは 各 自 で 確 認 します 品 質 評 価 基 準 速 度 定 数 がシステムのスペック 範 囲 内 かどうかチェックしています スペックに 近 い 場 合 や 超 えている 場 合 には が 付 きます スペック 範 囲 k a = 10 3 ~10 7 (1/Ms) k d = 10-5 ~0.5 (1/s) 2 各 パラメータが 独 立 して 算 出 されているかどうかチェックしています k a k d および R max について 解 析 結 果 に 与 える パラメータ 間 の 相 関 性 を 確 認 して います マストランスポートリミテーション 下 で 測 定 した 結 果 は k a k d に 相 関 性 が 見 られます 3 溶 液 効 果 の 値 (RI)の 妥 当 性 をチェックしています リファレンスセルおよびアナライトのゼロ 濃 度 を 差 し 引 いている 場 合 には RI は 限 りなくゼロとなりますが 結 合 解 離 速 度 が 速 くセンサーグラムが 箱 型 の 場 合 には RI の 値 が 大 きく 算 出 され 解 析 結 果 へ 影 響 を 与 えます

80 74 5. 相 互 作 用 測 定 4センサーグラムがカーブを 描 いているかどうか 確 認 してください センサーグラムの 結 合 解 離 領 域 が 直 線 的 な 場 合 得 られる 解 析 結 果 の 信 頼 性 は 低 くなります 5フィッティングカーブに 対 して 測 定 プロットがランダムに 分 散 しているかどうか 確 認 してください Residuals タブをクリックして 残 差 プロットを 確 認 します Y 軸 のゼロ 近 傍 ( 目 安 :±1~2 RU)で ランダムにプロットが 分 散 している 場 合 は 良 好 なフィッティ ングと 判 断 できます 緑 色 のガイドライン 内 にほとんどのプロットが 入 っている ことを 確 認 してください

81 5. 相 互 作 用 測 定 75 Report タブをクリックすると 算 出 された 各 種 パラメータが 表 示 されています k a (1/Ms) 結 合 速 度 定 数 k d (1/s) 解 離 速 度 定 数 K D (M) 解 離 定 数 R max(ru) アナライトの 最 大 結 合 量 RI (RU) 溶 液 効 果 (bulk effect) Chi 2 (RU 2 ) カイ 二 乗 U-value U-バリュー( 既 存 の 1:1 Binding モデル 使 用 時 のみ) Finish をクリックします 上 記 解 析 結 果 は 画 面 左 端 の Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 されます ファイル 名 にはサンプル 名 が 自 動 的 に 入 力 されます

82 76 5. 相 互 作 用 測 定 引 き 続 き 同 時 に 測 定 した 別 のサンプルについて 解 析 する 場 合 は Toolbar の をクリックします 補 足 フィッティング 結 果 の 評 価 フィッティングが 良 好 な 場 合 センサーグラムとフィッティングによって 得 られたフィッ ティングカーブがほぼ 重 なります センサーグラムの 傾 きが 大 きく 異 なる 場 合 フィッテ ィングは 良 好 ではないと 判 断 します また 解 析 結 果 の RI 値 が 0(RU)に 近 いか 確 認 しま す 統 計 学 的 に 以 下 の 各 項 目 を 確 認 します Residual Residuals タブをクリックして 残 差 プロットを 確 認 します Y 軸 のゼロ 近 傍 ( 目 安 :±1~2 RU)で ランダムにプロットが 分 散 している 場 合 は 良 好 なフィッティ ングと 判 断 できます 緑 色 のガイドライン 内 にほとんどのプロットが 入 っている ことを 確 認 してください Chi 2 測 定 データとフィッティングカーブ 間 の 差 を 示 します 良 好 なフィッティングで は シグナルノイズの 平 均 平 方 値 に 一 致 します U-value 解 析 値 が 信 頼 できるか 否 かを 判 断 する 値 です 15 以 下 であれば 問 題 ありません 25 以 上 になると 算 出 された 値 の 信 頼 性 は 低 くなります SE (Standard error) 各 パラメータについて SE( 標 準 誤 差 )が 表 示 されます 各 パラメータの 解 析 結 果 に 対 して SE の 値 が 10% 以 下 であれば 問 題 ありません Check Kinetic Data 解 析 ウインドウ 右 上 の Tools にあります マストランスポートリミテーションの 影 の 強 さを 確 認 します ウインドウ 上 の Modification factor M のスライダーを 1 から 10 まで 移 動 します この 際 解 析 結 果 の 黒 色 のセンサーグラムに 対 して 赤 色 と 青 色 のセンサーグラ

83 5. 相 互 作 用 測 定 77 ムの 変 化 を 確 認 します 赤 色 と 青 色 のセンサーグラムは 黒 色 のセンサーグラム の k a k d 値 をそれぞれ 1~10 倍 変 化 させて 得 られるセンサーグラムです 変 化 が 小 さい 場 合 には マストランスポートリミテーションの 影 響 が 強 いと 判 断 します フィッティングが 良 好 ではない 要 因 1フィッティングに 採 用 したモデルが 異 なっている 2 箱 型 のセンサーグラムである 3 経 時 的 なリガンドの 活 性 低 下 が 考 えられる 4 再 生 が 不 十 分 である 5アナライト 濃 度 の 調 製 ミスが 考 えられる など 1が 要 因 と 考 えられる 場 合 は 再 度 妥 当 な 反 応 モデルを 選 択 し 解 析 してください 2が 要 因 の 場 合 解 析 結 果 の RI がセンサーグラムのレスポンスの 大 半 を 占 める 値 になるこ とがあります これは 結 合 解 離 領 域 の 急 激 なレスポンスの 変 動 を RI とみなしてしまうか らです この 場 合 は RI=0 (Constant)として 再 解 析 してください 複 数 濃 度 のセンサーグラムから 1 つの 定 数 を 算 出 する 解 析 方 法 では すべての 濃 度 のセン サーグラムにおいて k a, k d, R max が 同 一 のパラメータであることが 前 提 となります しかし 上 記 3~5の 実 験 状 況 では 各 濃 度 のセンサーグラムにおいて これらのパラメータは 必 ずしも 一 致 しません 例 えば R max は リガンドに 対 するアナライトの 最 大 結 合 量 (RU)であり 理 想 的 な 実 験 系 では 連 続 して 同 一 セルを 使 用 している 限 り どの 濃 度 のセンサーグラムに 対 しても 同 一 値 となります ところが リガンドの 再 生 が 不 十 分 な 場 合 や 再 生 操 作 によりリガンド の 活 性 がサイクルごとに 低 下 している 場 合 には R max はサイクルごとに 低 下 します フィッ ティングが 良 好 でない 要 因 が 測 定 結 果 から 明 らかに R max にある 場 合 は R max が 同 一 パラ メータであることを 解 除 し 再 解 析 してください

84 78 5. 相 互 作 用 測 定 補 足 カーブフィッティングにおける 再 解 析 反 応 モデルの 変 更 反 応 モデルを 変 更 し 再 解 析 する 場 合 は Finish をクリックせず Add Fit ボックスの Model: 右 側 の をクリックし 新 しい 反 応 モデルを 選 択 します Fit をクリックします 新 しい 解 析 結 果 が 表 示 されます 解 析 したすべての 結 果 は 履 歴 として Current Fits ボックスに 残 ります 前 の 解 析 結 果 を 見 る 場 合 は Current Fits ボックスの 目 的 の 反 応 モデルをクリックすると 結 果 が 表 示 されます 終 了 後 Finish をクリックします

85 5. 相 互 作 用 測 定 79 解 析 パラメータの 解 析 設 定 条 件 の 変 更 解 析 パラメータ(R max,ri)の 解 析 設 定 条 件 を 変 更 し 再 解 析 する 場 合 は Add Fit ボックスの Parameters をクリックします 経 時 的 なリガンドの 活 性 低 下 や 再 生 の 不 十 分 さが 原 因 で 全 センサーグラムにおいて R max を 同 一 パラメータとみなせない 場 合 R max の 行 の Fit カラムの をクリックし Fit local を 選 択 します 箱 型 のセンサーグラムを 解 析 する 際 に 濃 度 0 のセンサーグラムを 差 し 引 いているにもか かわらず センサーグラムの 急 激 なレスポンスの 変 化 を RI としてみなしてしまう 場 合 RI の Fit カラムの をクリックし Constant を 選 択 します Initial value は 自 動 的 に 0 が 入 力 さ れます Parameter Setting ダイアログ 中 の OK をクリックすると 条 件 が 適 用 されます 引 き 続 き Fit をクリックすると 解 析 結 果 が 表 示 されます

86 80 5. 相 互 作 用 測 定 補 足 解 析 履 歴 からの 結 果 の 消 去 解 析 結 果 を 履 歴 から 消 去 する 場 合 は Current Fits ボックス 中 の 目 的 のデータを 選 択 します Delete をクリックします 確 認 ダイアログが 表 示 されます 消 去 する 場 合 は OK をクリックします 解 析 結 果 が 消 去 されます

87 5. 相 互 作 用 測 定 81 補 足 Batch mode による 解 析 方 法 複 数 のサンプルについて 同 時 に 解 析 したい 場 合 には Select Evaluation mode で Batch mode を 選 択 します なお Batch mode では 各 サンプルについて 解 析 に 利 用 するセンサ ーグラムの 選 択 はできません Samples に 測 定 サンプルの 一 覧 が 表 示 されます Evaluation purpose と Model を 選 択 します 解 析 するサンプルにチェックを 入 れます それぞれのサンプルについて 解 析 が 開 始 されます

88 82 5. 相 互 作 用 測 定 解 析 結 果 が 表 示 されます 各 ウインドウを 並 べて 表 示 させたい 場 合 には ツールバーの Window > Tile Horizontally ま たは Tile Vertically を 選 択 します 画 面 左 端 の Evaluation Explorer 中 のフォルダにそれぞれの 解 析 結 果 が 追 加 されます ファ イル 名 にはサンプル 名 が 自 動 的 に 入 力 されます

89 5. 相 互 作 用 測 定 83 補 足 Multiple Rmax を 用 いた 解 析 方 法 同 一 サンプルにおいて 固 定 化 量 が 異 なるセンサーグラムを 同 時 に 解 析 して 1 つの 解 析 結 果 を 算 出 することができます 解 析 に 利 用 するセンサーグラムは 同 一 温 度 で 測 定 した 同 一 濃 度 系 列 のものを 利 用 してください Select Curves [ Create ]ウインドウで サンプルを 選 択 後 Multiple R max をクリックします Curve でセンサーグラムを 選 択 し Add をクリックすると 解 析 に 利 用 するセンサーグラム がウインドウ 左 上 の R max の 一 覧 に 追 加 されます 最 大 5 つまで 追 加 可 能 です ウインドウ 右 上 の Curves の Include で 解 析 に 持 ち 込 むセンサーグラムを 選 択 します Next >をクリックします

90 84 5. 相 互 作 用 測 定 Kinetics >をクリックします モデルを 選 択 後 Fit をクリックします 解 析 結 果 が 表 示 されます R max は 固 定 化 量 ごとに Fit global で 算 出 されます

91 5. 相 互 作 用 測 定 85 補 足 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 のマッピング Kinetics Summary を 使 用 することで 各 サンプルの 解 析 結 果 の 反 応 速 度 定 数 を Y 軸 =k a X 軸 =k d のチャートに 自 動 マッピングすることができます また Affinity 解 析 で 得 られた 解 離 定 数 は 別 途 Y 軸 =K D X 軸 =サンプルのチャートを 作 成 できます Kinetics Summary にデータを 持 ち 込 む 場 合 には 事 前 に 解 析 データを 保 存 しておく 必 要 があります 別 の 解 析 データファイルの 結 果 も 同 時 にプロットしたい 場 合 には Append File または File Append File をクリックして 該 当 の 解 析 データを 読 み 込 みます Tools Kinetics Summary をクリックします Kinetics Summary が 起 動 し Thumbnails に 解 析 ソフトウェアで 解 析 したすべての 結 果 が 読 み 込 まれます 表 示 方 法 は アイコン: の Small Thumbnails Standard Thumbnails Extended Thumbnails から 選 択 できます また 各 サンプルのセンサーグラム 上 でダブルクリックをすると 解 析 結 果 ウインドウが 開 き 解 析 結 果 の 詳 細 を 確 認 できます センサーグラムを 画 像 として 一 括 保 存 したい 場 合 には File > Save as でファイルを 保 存 後 Thumbnails 画 面 上 で マウス 右 クリック 後 Export All Graphs And Table を 選 択 して 保 存 先 を 指 定 してください または マウス 右 クリック 後 Copy の Copy All Graphs または Copy All Thumbnails を 選 択 して Paint または WordPad に 画 像 を 貼 り 付 けて 保 存 してください

92 86 5. 相 互 作 用 測 定 Table タブをクリックして Include をチェックし プロットするデータを 選 択 します On-Off Rate Map タブをクリックします k d vs k d プロットが 表 示 されます ポイントをクリックすると 画 面 右 に 該 当 するセンサーグラムが 表 示 されます Steady State KD Plot タブをクリックします K D vs Sample のプロットが 表 示 されます ( Affinity 解 析 で 得 られた K D のみプロットします ) プロットを 画 像 として 保 存 したい 場 合 には マウス 右 クリック 後 Copy Graph を 選 択 して Paint または WordPad に 画 像 を 貼 り 付 けて 保 存 してください

93 5. 相 互 作 用 測 定 平 衡 値 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 されます 補 足 サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします リガンド 名 の 変 更 は 右 下 の Edit Chip Information をクリックして 変 更 します

94 88 5. 相 互 作 用 測 定 Toolbar の をクリック 後 をクリックします 同 一 サンプル 名 のセンサーグラムが 重 ね 書 き 表 示 されます Select Evaluation mode で 解 析 方 法 を 選 択 します 1 サンプルごとに 解 析 する 場 合 には Single mode を 選 択 します 複 数 サンプルをバッチ 解 析 する 場 合 は Batch mode を 選 択 し ます Bath mode については 補 足 5-14 を 参 照 してください 複 数 のサンプルについて 同 時 測 定 している 場 合 は Sample: 右 側 の サンプルのデータに 移 行 できます をクリックすると 別 ゼロ 濃 度 のブランクサイクルを 複 数 回 測 定 している 場 合 センサーグラム 下 の Show average blank(s)にチェックを 入 れると 平 均 したセンサーグラムが 表 示 されます エアーの 混 入 などの 理 由 で 解 析 データから 削 除 したいセンサーグラムがある 場 合 は そ のセンサーグラムについて テーブル 中 の Include カラムのチェックを 外 します Next >をクリックします

95 5. 相 互 作 用 測 定 89 ゼロ 濃 度 のセンサーグラムがブランクとして 全 センサーグラムから 差 し 引 かれます Affinity >をクリックします

96 90 5. 相 互 作 用 測 定 アナライト 添 加 終 了 直 前 のレスポンス(RU)を 平 衡 値 (Req 値 )( RU)とし 各 アナライト 濃 度 における Req 値 がプロットされます Next >をクリックします X 軸 =アナライト 濃 度 (M) Y 軸 =Req(RU)のグラフが 表 示 されます Model を 選 択 後 Fit をクリックします 通 常 は Steady State Affinity を 使 用 します 補 足 平 衡 値 解 析 のモデル 式 平 衡 値 解 析 のモデル 式 は 次 の 3 つから 選 択 できます Steady State Affinity 1:1 Binding モデルで R max は Fitting パラメータです 次 の 式 を 使 用 します Steady State Affinity Constant Rmax 1:1 Binding モデルの 平 衡 値 解 析 で R max を 指 定 した 値 で 解 析 を 行 います 低 アフィニティー 相 互 作 用 で アナライト 濃 度 を 高 濃 度 で 確 保 できない 場 合 に 使 用 します モデル 選 択 後 Fit をクリックして R max 値 を 入 力 します コントロールサンプルを 高 濃 度 で 添 加 して 得 られる R max を 基 準 として R max を 設 定 します アナライトの R max 算 出 式 は 次 の 通 りです

97 5. 相 互 作 用 測 定 91 Steady State Affinity Constant Rmax (Multi Site) リガンド 上 にアフィニティーが 異 なる 結 合 サイトが 2 つあるモデルです 以 下 の 式 を 使 用 しています モデル 選 択 後 に 結 合 が 強 いサイトの R max 値 (R max1)を 入 力 します 解 析 時 には R max1 は 入 力 した 値 で 解 析 を 行 います コントロールサンプルを 高 濃 度 で 添 加 して 得 られる R max を 基 準 として R max1 を 設 定 してください 終 了 後 Finish をクリックします 解 析 結 果 が 表 示 されます グラフ 上 には X 軸 = 算 出 さ れた K D 値 (M)のラインが 表 示 されます K D (M) 解 離 定 数 R max(ru) アナライトの 最 大 結 合 量 offset(ru) X = 0 の 時 の Y 軸 の 値 Chi 2 (RU 2 ) カイ 二 乗 上 記 解 析 結 果 は 画 面 左 端 の Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 されます ファイル 名 にはサンプル 名 が 自 動 的 に 入 力 されます 引 き 続 き 同 時 に 測 定 した 別 のサンプルについて 解 析 する 場 合 は Toolbar の をクリックします

98 92 5. 相 互 作 用 測 定 補 足 平 衡 値 解 析 結 果 の Quality Assessment 平 衡 値 解 析 において 信 頼 性 の 高 い 解 析 結 果 を 得 るためには 解 析 結 果 の K D 値 がアナライ トのもっとも 高 濃 度 の 1/2 以 下 の 濃 度 である 必 要 があります つまり アナライトの 濃 度 範 囲 が 低 濃 度 領 域 で R max からかけ 離 れた 平 衡 値 範 囲 で 測 定 している 場 合 には 解 析 結 果 の 信 頼 性 は 低 くなります 解 析 結 果 のグラフ 上 の X 軸 = 算 出 された K D 値 (M)のラインが 黒 色 表 示 の 場 合 は アナラ イトのもっとも 高 濃 度 の 1/2 以 下 の 濃 度 で 算 出 されていることを 表 します 以 下 のように 赤 色 の 破 線 の 場 合 には 濃 度 範 囲 を 変 更 して 再 度 測 定 および 解 析 を 実 施 してください

99 5. 相 互 作 用 測 定 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 の 算 出 シングルサイクル 法 マルチサイクル 法 とシングルサイクル 法 54 ページを 参 照 してください アフィニティーとカイネティクス 54 ページを 参 照 してください 解 離 定 数 (K D) 反 応 速 度 定 数 (k a k d)の 算 出 方 法 55 ページを 参 照 してください 至 適 アナライト 濃 度 良 好 な 結 果 を 得 るためには 予 想 される 解 離 定 数 (K D) 値 の 1/10~10 倍 の 濃 度 範 囲 で 5 濃 度 測 定 します 解 離 定 数 値 が 不 明 な 場 合 には 1 nm~1 μm の 範 囲 で 5 倍 希 釈 系 列 の 5 濃 度 のアナライトで 測 定 および 解 析 を 行 って 算 出 された 暫 定 的 な K D 値 から 至 適 濃 度 範 囲 を 求 めるのが 望 ましいです その 場 合 再 生 ができるのであればリガンドを 再 生 して 至 適 アナライト 濃 度 で 再 測 定 できます 再 生 がで 困 難 な 場 合 には リガンドを 新 しいフローセ ルに 固 定 化 して 至 適 アナライト 濃 度 で 再 測 定 してください また 濃 度 0 についてもアナライトと 同 一 条 件 で 測 定 します 至 適 な 流 速 30 μl/min 以 上 の 高 流 速 に 設 定 します アナライト 添 加 時 間 と 解 離 時 間 通 常 は 添 加 2 分 程 度 解 離 2 分 程 度 で 測 定 します ただし 結 合 速 度 が 遅 く 結 合 領 域 の センサーグラムが 直 線 的 な 場 合 には カーブが 得 られるよう 添 加 時 間 を 5~10 分 程 度 にし ます また 解 離 速 度 が 遅 く 解 離 領 域 の 傾 きがほとんど 確 認 できない 場 合 には 解 離 時 間 を 10~30 分 程 度 で 測 定 します 複 数 のアナライトの 測 定 通 常 シングルサイクル 法 では 一 度 相 互 作 用 測 定 をおこなった 固 定 化 セルは 繰 り 返 し 測 定 しません 複 数 アナライトがある 場 合 や 再 現 性 を 確 認 する 場 合 には その 都 度 リガンド を 新 しいフローセルに 固 定 化 してください ただし リガンドが 安 定 で アナライトの 解 離 速 度 が 速 い 場 合 や 結 合 したアナライトが 完 全 に 解 離 するまでランニング 緩 衝 液 を 流 す プログラムに 設 定 した 場 合 に 限 り 複 数 のアナライトを 同 時 に 測 定 することも 可 能 です

100 94 5. 相 互 作 用 測 定 プログラムの 実 行 Toolbar の Run Method アイコン( ます )または Menu bar の Run Method をクリックし Biacore Methods を 選 択 した 後 Open をクリックします Single-cycle Kinetics を 選 択 した 後 Open をクリックします Method Builder の Main ダイアログが 表 示 されます Overview 画 面 にはメソッド 全 体 の 設 定 項 目 が 表 示 されます 以 下 変 更 項 目 について 記 載 します 詳 細 は 6 章 を 参 照 してください General Settings をクリックします

101 5. 相 互 作 用 測 定 Data Collection rate 10Hz を 選 択 します 2 Detection 検 出 モードを 以 下 の 3 つ(Single,Dual,Multi)から 選 択 します Single Dual 1,2 3, Multi 1,2,3,4 2-1, ,3-1,4-1 3 Sample compartment temperature サンプルコンパートメントの 温 度 (4~45 )を 設 定 します 4 Concentration unit アッセイ 全 体 を 通 して 用 いる 濃 度 単 位 を 選 択 します 5 Buffer settings 使 用 するランニング 緩 衝 液 名 を 入 力 します 6 After run チェックを 入 れておくと 全 測 定 が 終 了 した 後 に センサー 表 面 の 温 度 が 指 定 し た 温 度 に 自 動 変 更 されます 設 定 後 Assay Steps をクリックします

102 96 5. 相 互 作 用 測 定 Startup を 選 択 します Number of replicates Times ベースライン 安 定 化 のためのスタートアップの 測 定 回 数 を 指 定 します 3 回 以 上 を 推 奨 します

103 5. 相 互 作 用 測 定 97 Sample を 選 択 します Number of replicates Times 繰 り 返 し 測 定 回 数 を 選 択 します Cycle Types をクリックします

104 98 5. 相 互 作 用 測 定 Sample をクリックします Type Concentrations per cycle contact time Dissociation time Flow rate Flow path Extra wash after injection with: Stabilization period Single cycle kinetics を 選 択 します アナライトの 濃 度 数 を 選 択 します 最 大 5 濃 度 です アナライト 添 加 時 間 を 入 力 します(s) 最 終 添 加 するアナライト 解 離 時 間 を 入 力 します(s) 流 速 (μl/min) 通 常 30 μl/min Both または Multi を 選 択 します チェックを 入 れると 指 定 溶 液 でアナライト 添 加 後 に 流 路 内 を 洗 浄 します センサーチップ 表 面 には 流 れません チェックを 入 れると 指 定 した 解 離 時 間 後 に 指 定 した 時 間 ベースライン 安 定 化 のための 待 機 時 間 を 設 定 する ことができます なお 再 生 しない 場 合 には Commands タブをクリックして Regeneration を 選 択 後 Remove をクリックして 削 除 してください

105 5. 相 互 作 用 測 定 99 Startup をクリックします ダミーランを 設 定 します Type contact time Dissociation time Flow rate Flow path Low Sample consumption が 選 択 されています 60 (s)と 入 力 されています 変 更 の 必 要 はありません 60 (s)と 入 力 されています 変 更 の 必 要 はありません 30 μl/min Both または Multi が 選 択 されています なお 再 生 しない 場 合 には Commands タブをクリックして Regeneration を 選 択 後 Remove をクリックして 削 除 してください Variable Settings をクリックします

106 相 互 作 用 測 定 各 ステップの 変 数 をどの 時 点 で 入 力 するのか 画 面 右 上 の 3 項 目 から 選 択 します Define all values at run time 測 定 開 始 直 前 に 入 力 するモードです Define all values in Method 現 画 面 上 で 入 力 するモードです 作 成 したメソッドを 頻 繁 にテンプレー トとして 使 用 し 毎 回 変 更 がない 場 合 は ここで 入 力 しておくと 測 定 直 前 での 情 報 入 力 が 不 要 になります Define some values in Method and others at run time 幾 つかの 情 報 を 現 画 面 上 で 入 力 し その 他 の 情 報 は 測 定 開 始 直 前 に 入 力 するモードです Verification をクリックします

107 5. 相 互 作 用 測 定 101 メソッドの 設 定 に 不 備 が 無 ければ The Method has been verified and can be used to set up a run. と 表 示 されます 間 違 いがある 場 合 は 該 当 部 分 が 表 示 されるので 指 示 に 従 って 修 正 します 確 認 後 Setup Run をクリックします 適 切 な Flow path を 選 択 し Next >をクリックします

108 相 互 作 用 測 定 Startup Sample をそれぞれクリックし テーブルにサンプル 情 報 を 入 力 します Sample1 Sample Solution Conc(nM) MW(Da) アナライトの 名 称 アナライト 濃 度 Conc (1) Conc (5)の 順 番 で 低 濃 度 から 順 番 に 入 力 してください アナライトの 分 子 量 サンプル 測 定 前 にアナライトゼロ 濃 度 のサイクルを 2 回 以 上 実 施 してください 入 力 後 Next >をクリックします

109 5. 相 互 作 用 測 定 103 測 定 サイクルリストが 表 示 されます Next >をクリックします 測 定 を 始 める 前 に Prime および Normalize をおこなう 場 合 にはチェックを 入 れてください Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 入 力 後 Next >をクリックします

110 相 互 作 用 測 定 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Simple Position Import でそのファイル を 読 み 込 むと サンプル 位 置 が 変 更 されます

111 5. 相 互 作 用 測 定 105 補 足 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 してください

112 相 互 作 用 測 定 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックします 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したメソッドをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォ ルダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

113 5. 相 互 作 用 測 定 107 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

114 相 互 作 用 測 定 補 足 プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 します

115 5. 相 互 作 用 測 定 カーブフィッティングによる 解 析 メソッドを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 自 動 保 存 された 取 得 データが 開 かれます 補 足 サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします リガンド 名 の 変 更 は 右 下 の Edit Chip Information をクリックして 変 更 します

116 相 互 作 用 測 定 補 足 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

117 5. 相 互 作 用 測 定 111 Toolbar の をクリック 後 をクリックします 同 一 サンプル 名 のセンサーグラムが 重 ね 書 き 表 示 されます 複 数 のサンプルについて 同 時 測 定 している 場 合 は Sample: 右 側 の のサンプルデータに 移 行 できます をクリックすると 別 ゼロ 濃 度 のブランクサイクルを 複 数 回 測 定 している 場 合 センサーグラム 下 の Show average blank(s)にチェックを 入 れると 平 均 したセンサーグラムが 表 示 されます エアーの 混 入 などの 理 由 で 解 析 データから 削 除 したいセンサーグラムがある 場 合 は そ のセンサーグラムについて テーブル 中 の Include カラムのチェックを 外 します

118 相 互 作 用 測 定 自 動 的 にテーブル 下 のチャートから チェックを 外 したセンサーグラムは 消 えます Next >をクリックします

119 5. 相 互 作 用 測 定 113 濃 度 0 のセンサーグラムが ブランクとして 全 センサーグラムから 差 し 引 かれます Kinetics >をクリックします 補 足 センサーグラムの 部 分 的 削 除 エアーの 混 入 や 添 加 開 始 終 了 点 のノイズなど 解 析 データの 中 から 一 部 削 除 したい 領 域 がある 場 合 には マウスの 左 ボタンをドラッグし 該 当 の 領 域 を 拡 大 したのち マウスの 右 ボタンをドラッグして 削 除 する 領 域 を 選 択 します 拡 大 図 を 解 除 する 場 合 は センサーグ ラムを 含 まない 余 白 をダブルクリックすると 一 つ 前 の 縮 小 画 面 に 戻 ります 領 域 を 選 択 すると グラフの 右 上 の Remove Selection ボタンがアクティブになります ボ タンをクリックすると 選 択 部 位 が 削 除 されます

120 相 互 作 用 測 定 Model:に フィッティングに 採 用 する 反 応 モデル 式 を 選 択 します をクリックすると す べての 反 応 モデルが 表 示 されます 反 応 モデルが 不 明 な 場 合 は 1:1 Binding を 選 択 します 選 択 後 Fit をクリックします

121 5. 相 互 作 用 測 定 115 補 足 反 応 モデル リガンドを B アナライトを A とします 1:1 Binding A + B AB リガンドとアナライトが 1 分 子 同 士 で 結 合 するもっとも 単 純 な 反 応 モデル Bivalent Analyte A + B AB, AB + B AB2 アナライトが 2 価 もしくはホモ 2 量 体 の 反 応 モデル AB 複 合 体 形 成 後 リガンド B が 2 次 的 に 結 合 する 反 応 Heterogeneous Analyte A1 + B A1B, A2 + B A2B 競 合 反 応 リガンド 上 の 1 種 類 の 結 合 部 位 を 2 種 類 のアナライトが 競 合 する 反 応 Heterogeneous Ligand A + B1 AB1, A + B2 AB2 アナライトに 対 して 親 和 性 の 異 なる 2 つの 結 合 部 位 を 持 つリガンドにアナライト が 並 行 して 結 合 する 反 応 モデル Two state Reaction A + B AB AB* リガンドとアナライトの 1 分 子 同 士 の 結 合 であるが 複 合 体 形 成 後 コンフォメー ション 変 化 を 起 こす 反 応 モデル 解 析 結 果 が 表 示 されます

122 相 互 作 用 測 定 黒 色 のセンサーグラムは フィッティングにより 得 られたフィッティングカーブです 1:1 binding で 解 析 した 場 合 には Quality Control テーブルが 表 示 され 解 析 結 果 の 評 価 が 表 示 されます 補 足 解 析 結 果 の Quality Control 5 項 目 の 品 質 評 価 結 果 が ステータスマークで 表 示 されます ステータスマーク クオリティーアセスメントにパスしています クオリティーアセスメントの 許 容 限 界 に 近 いです クオリティーアセスメントにパスしていません ニュートラルまたは 各 自 で 確 認 します 品 質 評 価 基 準 速 度 定 数 がシステムのスペック 範 囲 内 かどうかチェックしています スペックに 近 い 場 合 や 超 えている 場 合 には が 付 きます スペック 範 囲 k a = 10 3 ~10 7 (1/Ms) k d = 10-5 ~0.5 (1/s) 2 各 パラメータが 独 立 して 算 出 されているかどうかチェックしています k a k d および R max について 解 析 結 果 に 与 える パラメータ 間 の 相 関 性 を 確 認 して います マストランスポートリミテーション 下 で 測 定 した 結 果 は k a k d に 相 関 性 が 見 られます 3 溶 液 効 果 の 値 (RI)の 妥 当 性 をチェックしています リファレンスセルおよびアナライトのゼロ 濃 度 を 差 し 引 いている 場 合 には RI は 限 りなくゼロとなりますが 結 合 解 離 速 度 が 速 くセンサーグラムが 箱 型 の 場 合 には RI の 値 が 大 きく 算 出 され 解 析 結 果 へ 影 響 を 与 えます

123 5. 相 互 作 用 測 定 117 4センサーグラムはカーブを 描 いているかどうか 確 認 してください センサーグラムの 結 合 解 離 領 域 が 直 線 的 な 場 合 得 られる 解 析 結 果 の 信 頼 性 は 低 くなります 5フィッティングカーブに 対 して 測 定 プロットがランダムに 分 散 しているかどうか 確 認 してください Residuals タブをクリックして 残 差 プロットを 確 認 します Y 軸 のゼロ 近 傍 ( 目 安 :±1~2 RU)で ランダムにプロットが 分 散 している 場 合 は 良 好 なフィッティ ングと 判 断 できます 緑 色 のガイドライン 内 にほとんどのプロットが 入 っている ことを 確 認 してください

124 相 互 作 用 測 定 Report タブをクリックすると 算 出 された 各 種 パラメータが 表 示 されています k a (1/Ms) k d (1/s) K D (M) R max (RU) RI (RU) Chi 2 (RU 2 ) U-value 結 合 速 度 定 数 解 離 速 度 定 数 解 離 定 数 アナライトの 結 合 最 大 量 溶 液 効 果 (bulk effect) カイ 二 乗 U-バリュー( 既 存 の 1:1 Binding モデル 使 用 時 のみ) Finish をクリックします 上 記 解 析 結 果 は 画 面 左 端 の Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 されます ファイル 名 にはサンプル 名 が 自 動 的 に 入 力 されます

125 5. 相 互 作 用 測 定 119 引 き 続 き 同 時 に 測 定 した 別 のサンプルについて 解 析 する 場 合 は Toolbar の をクリックします 補 足 フィッティング 結 果 の 評 価 フィッティングが 良 好 な 場 合 センサーグラムとフィッティングによって 得 られたフィッ ティングカーブがほぼ 重 なります センサーグラムの 傾 きが 大 きく 異 なる 場 合 フィッテ ィングは 良 好 ではないと 判 断 します また 解 析 結 果 の RI 値 が 0(RU)に 近 いか 確 認 しま す 統 計 学 的 には 以 下 の 各 項 目 を 確 認 します Residual Residuals タブをクリックして 残 差 プロットを 確 認 します Y 軸 のゼロ 近 傍 ( 目 安 :±1~2 RU)で ランダムにプロットが 分 散 している 場 合 は 良 好 なフィッティ ングと 判 断 できます 緑 色 のガイドライン 内 にほとんどのプロットが 入 っている ことを 確 認 してください Chi 2 測 定 データとフィッティングカーブ 間 の 差 を 示 します 良 好 なフィッティングで は シグナルノイズの 平 均 平 方 値 に 一 致 します U-value 解 析 値 が 信 頼 できるか 否 かを 判 断 する 値 です 15 以 下 であれば 問 題 ありません 25 以 上 になると 算 出 された 値 の 信 頼 性 は 低 くなります SE (Standard error) 各 パラメータについて SE( 標 準 誤 差 )が 表 示 されます 各 パラメータの 解 析 結 果 に 対 して SE の 値 が 10% 以 下 であれば 問 題 ありません Check Kinetic Data 解 析 ウインドウ 右 上 の Tools にあります マストランスポートリミテーションの 影 の 強 さを 確 認 します ウインドウ 上 の Modification factor M のスライダーを 1 から 10 まで 移 動 します この 際 解 析 結 果 の 黒 色 のセンサーグラムに 対 して 赤 色 と 青 色 のセンサーグラ ムの 変 化 を 確 認 します 赤 色 と 青 色 のセンサーグラムは 黒 色 のセンサーグラム

126 相 互 作 用 測 定 の k a k d 値 を factor M(1~10)で 割 った 場 合 と 掛 けた 場 合 に 得 られるセンサーグ ラムです 変 化 が 小 さい 場 合 はマストランスポートリミテーションの 影 響 が 強 い と 判 断 します フィッティングが 良 好 ではない 要 因 1フィッティングに 採 用 したモデルが 異 なっている 2 箱 型 のセンサーグラムである 3 経 時 的 なリガンドの 活 性 低 下 が 考 えられる 4 再 生 が 不 十 分 である 5アナライト 濃 度 の 調 製 ミスが 考 えられる 等 1が 要 因 と 考 えられる 場 合 は 再 度 妥 当 な 反 応 モデルを 選 択 し 解 析 してください 2が 要 因 の 場 合 解 析 結 果 の RI がセンサーグラムのレスポンスの 大 半 を 占 める 値 になるこ とがあります これは 結 合 解 離 領 域 の 急 激 なレスポンスの 変 動 を RI とみなしてしまうか らです この 場 合 は RI=0 (Constant)として 再 解 析 してください 複 数 濃 度 のセンサーグラムから 1 つの 定 数 を 算 出 する 解 析 方 法 では すべての 濃 度 のセン サーグラムにおいて k a, k d, R max が 同 一 のパラメータであることが 前 提 となります しかし 上 記 3~5の 実 験 状 況 では 各 濃 度 のセンサーグラムにおいて これらのパラメータは 必 ずしも 一 致 しません 例 えば R max は リガンドに 対 するアナライトの 最 大 結 合 量 (RU)であり 理 想 的 な 実 験 系 では 連 続 して 同 一 セルを 使 用 している 限 り どの 濃 度 のセンサーグラムに 対 しても 同 一 値 となります ところが リガンドの 再 生 が 不 十 分 な 場 合 や 再 生 操 作 によりリガンド の 活 性 がサイクルごとに 低 下 している 場 合 には R max はサイクルごとに 低 下 します フィッ ティングが 良 好 でない 要 因 が 測 定 結 果 から 明 らかに R max にある 場 合 は R max が 同 一 パラ メータであることを 解 除 し 再 解 析 してください

127 5. 相 互 作 用 測 定 121 補 足 カーブフィッティングにおける 再 解 析 反 応 モデルの 変 更 反 応 モデルを 変 更 し 再 解 析 する 場 合 は Finish をクリックせず Add Fit ボックスの Model: 右 側 の をクリックし 新 しい 反 応 モデルを 選 択 します Fit をクリックします 新 しい 解 析 結 果 が 表 示 されます 解 析 したすべての 結 果 は 履 歴 として Current Fits ボックスに 残 ります 前 の 解 析 結 果 を 見 る 場 合 は Current Fits ボックスの 目 的 の 反 応 モデルをクリックすると 結 果 が 表 示 されます 終 了 後 Finish をクリックします

128 相 互 作 用 測 定 解 析 パラメータの 解 析 設 定 条 件 の 変 更 解 析 パラメータ(R max,ri)の 解 析 設 定 条 件 を 変 更 し 再 解 析 する 場 合 は Add Fit ボックスの Parameters をクリックします 経 時 的 なリガンドの 活 性 低 下 や 再 生 の 不 十 分 さが 原 因 で 全 センサーグラムにおいて R max を 同 一 パラメータとみなせない 場 合 R max の 行 の Fit カラムの をクリックし Fit local を 選 択 します 箱 型 のセンサーグラムを 解 析 する 際 に 濃 度 0 のセンサーグラムを 差 し 引 いているにもか かわらず センサーグラムの 急 激 なレスポンスの 変 化 を RI としてみなしてしまう 場 合 RI の Fit カラムの をクリックし Constant を 選 択 します Initial value は 自 動 的 に 0 が 入 力 さ れます Parameter Setting ダイアログ 中 の OK をクリックすると 条 件 が 適 用 されます 引 き 続 き Fit をクリックすると 解 析 結 果 が 表 示 されます

129 5. 相 互 作 用 測 定 123 補 足 解 析 履 歴 からの 結 果 の 消 去 解 析 結 果 を 履 歴 から 消 去 する 場 合 は Current Fits ボックス 中 の 目 的 のデータを 選 択 します Delete をクリックします 確 認 ダイアログが 表 示 されます 消 去 する 場 合 は OK をクリックします 解 析 結 果 が 消 去 されます

130 メソッドによるプログラムの 作 成 6. メソッドによるプログラムの 作 成 ウィザードで 作 成 するプログラムには リファレンスの 選 択 や 再 生 溶 液 の 添 加 回 数 などに 制 約 があります そこで ウィザードでは 対 応 できない 複 雑 なプログラムを 使 用 したい 場 合 は メソッドビルダーを 使 用 してメソッドを 作 成 します 作 成 時 には あらかじめ 実 験 目 的 に 応 じたウィザードテンプレートから 望 みに 近 いプログラムを 作 成 して 保 存 したファ イルをメソッドビルダーで 編 集 すると 効 率 も 良 く 間 違 いが 減 ります メソッドの 構 成 メソッドビルダーの 重 要 な 設 定 項 目 は Assay Steps と Cycle types です 始 めに Assay Steps で 測 定 全 体 のアウトラインを 設 定 します 一 つもしくは 複 数 の 測 定 ス テップを 設 定 します それぞれの 測 定 ステップは Startup Samples Control Samples など の 測 定 目 的 別 で 設 定 します Cycle types では 測 定 ステップ 別 に 詳 細 なプログラム( 温 度 流 速 試 料 の 添 加 順 序 など) を 設 定 します Assay Steps Cycle Types スタートアップ サンプルの 測 定 1 アナライトの 添 加 条 件 5 min 10 µl/min 再 生 条 件 10 mm Gly-HCl µl/min サンプルの 測 定 2 アナライトの 添 加 条 件 10 min 30 µl/min 再 生 条 件 50 mm NaOH 60 µl/min

131 6. メソッドによるプログラムの 作 成 ウィザードで 作 成 保 存 したプログラムの 呼 び 出 し 実 験 目 的 別 に 既 存 のテンプレートがあります 既 存 のテンプレートがない 場 合 には 実 験 目 的 に 応 じたウィザードで 実 験 条 件 に 近 いプログラムを 作 成 保 存 しておきます その 後 以 下 の 操 作 に 従 ってメソッドを 作 成 します Toolbar の Run Method アイコン( )または Menu bar の Run Method をクリックし ます Show importable wizard templates にチェックを 入 れます Methods and Templates フォルダ 内 に 保 存 されているウィザードファイルが 表 示 されます それ 以 外 のフォルダに 保 存 したファイルを 呼 び 出 す 場 合 は Browse を 利 用 します 目 的 の ファイルを 選 択 し Open をクリックします

132 メソッドによるプログラムの 作 成 ウィザードで 入 力 されていた 情 報 が 自 動 的 にメソッドの 形 式 に 変 換 されます ファイルを 開 いた 直 後 は メソッドビルダーの Overview 画 面 が 表 示 されています 6-2. メソッドの 編 集 画 面 左 列 に 設 定 ボタンが 存 在 します General Settings から Verification までの 上 から 5 つ のボタンでメソッドを 作 成 します Overview 測 定 内 容 の 表 示 General Settings システム 初 期 条 件 の 設 定

133 6. メソッドによるプログラムの 作 成 127 Assay Steps Cycle Types Variable Settings Verification Overview をクリックします 測 定 全 体 のアウトラインの 作 成 測 定 ステップごとの 詳 細 なプログラムの 設 定 変 数 入 力 方 法 の 設 定 作 成 メソッドの 確 認 各 項 目 をクリックすると 右 側 の 画 面 で 測 定 ステップの 詳 細 を 確 認 することができます General settings をクリックします

134 メソッドによるプログラムの 作 成 General settings では 6 項 目 を 設 定 します 1 Data Collection rate 1Hz もしくは 10Hz を 選 択 します 反 応 速 度 定 数 熱 力 学 パラメータ 算 出 の 場 合 それ 以 外 の 実 験 目 的 の 場 合 10Hz 1Hz 2 Detection 流 したいフローセルに 対 応 した 検 出 モードを 以 下 の 3 つ(Single, Dual, Multi)から 選 択 します Single Dual 1,2 3, Multi 1,2,3,4 2-1, ,3-1,4-1 3 Sample compartment temperature サンプルコンパートメントの 温 度 (4~45 )を 設 定 します サンプルコンパート メントの 温 度 は サンプルの 安 定 性 を 考 慮 し 10 程 度 に 設 定 することもありま すが DMSO を 含 むサンプルの 場 合 は 低 温 で 析 出 することがあるので 注 意 が 必 要 です

135 6. メソッドによるプログラムの 作 成 129 Vary with analysis temperature Analysis temperature と 同 じ 温 度 に 設 定 したい 場 合 に チェックを 入 れます 4 Concentration unit アッセイ 全 体 を 通 して 用 いる 濃 度 単 位 を 選 択 します 5 Buffer settings 使 用 するランニング 緩 衝 液 名 を 入 力 しておくと 記 録 として 残 すことができます 6 After run この 項 目 にチェックを 入 れておくと 全 測 定 が 終 了 した 後 に センサー 表 面 の 温 度 が 指 定 した 温 度 に 自 動 変 更 されます

136 メソッドによるプログラムの 作 成 Assay steps をクリックします Assay steps では 5 つの 設 定 項 目 があります アッセイを 正 しく 構 築 するためには 1 2 および3の 理 解 が 必 須 です 編 集 したい 測 定 ステップをクリックし 各 項 目 を 設 定 します 1 Assay Steps 測 定 ステップの 作 成 と 各 測 定 ステップの 配 置 を 変 更 します 測 定 ステップを 追 加 する 場 合 は New ( ) から 作 成 できます 新 規 で 作 成 する 測 定 ステップは 後 述 する Purpose と Cycle type の 関 連 づけが 必 要 です 詳 細 は 補 足 6-3. を 参 照 してください 各 測 定 ステップの 配 置 は Move Up ( ) および Move Down ( ) にて 調 整 します 測 定 ステップを 削 除 したい 場 合 には 該 当 の 測 定 サイクルを 選 択 後 Delete ( ) をクリックします 2 Base settings Name 測 定 ステップの 名 称 を 入 力 します 最 初 は Purpose の 名 称 と 同 一 ですが 変 更 することも 可 能 です

137 6. メソッドによるプログラムの 作 成 131 Purpose 各 測 定 ステップを 何 のために 実 行 するか 設 定 しま す Evaluationsoftware において 各 測 定 ステップを 適 切 に 認 識 するために 必 要 かつ 重 要 な 項 目 です 以 下 の 7 種 類 があります Conditioning Startup Solvent correction Calibration Sample Control Sample Undefined Connect to cycle type Cycle types 画 面 で 定 義 したサイクルタイプを 関 連 づけ ます サイクルタイプはプルダウンメニューに 一 覧 で 表 示 されます サイクルタイプに 関 しては 後 述 する 該 当 項 目 を 参 照 してください ウィザードで 作 成 した プログラムを 使 用 する 場 合 は 適 切 に 関 連 づけられて いるので 新 規 のアッセイステップを 追 加 しない 限 り 特 に 設 定 を 変 更 する 必 要 はありません 3 Recurrence Calibration Control Sample Solvent correction などをサンプル 測 定 ステップ 内 で 定 期 的 に 繰 り 返 し 実 行 するための 設 定 項 目 です 通 常 ウィザードで 作 成 したプロ グラムを 読 み 込 んだ 場 合 はすでに 設 定 されています 必 要 があれば 測 定 頻 度 の 変 更 や サンプル 測 定 ステップの 最 初 と 最 後 に 測 定 する 項 目 を 追 加 できます 詳 細 は 補 足 6-1. を 参 照 してください 4 Assay step preparations 温 度 の 入 力 し ランニング 緩 衝 液 を 選 択 します ランニング 緩 衝 液 を 1 種 類 しか 使 用 しない 場 合 は 設 定 する 必 要 はありません (デフォルトでは A が 選 択 されて います) 5 Number of replicates 同 一 サンプル(コントロールサンプルや 検 量 線 用 試 薬 も 同 じ)について 繰 り 返 し 測 定 回 数 を 入 力 します 合 わせて 測 定 順 序 を As Entered Order および Random の 中 から 選 択 します

138 メソッドによるプログラムの 作 成 補 足 6-1. 測 定 ステップの 定 期 的 繰 り 返 しの 実 行 設 定 各 ステップは( )の 入 力 順 に 実 行 されます 上 記 画 面 では スタートアップ(Startup 1)が 実 行 された 後 コントロールサンプル(Control Sample 1)の 測 定 ステップを 実 施 します 終 了 後 解 析 に 必 要 なサンプルの 測 定 ステップ (Thermo 1)が 実 行 されます ここで コントロールサンプルの 測 定 をサンプル 測 定 中 に 定 期 的 に 繰 り 返 し 実 行 したい 場 合 には Recurrence を 設 定 します Control Sample に 該 当 するステップ(Control Sample 1)を 選 択 します Repeat assay step within にチェックを 入 れ どの 測 定 ステップの 中 で 定 期 的 に 測 定 を 実 行 するかを 右 側 のプルダウンメニューから 選 択 します(アッセイステップ 内 のすべての 測 定 ステップが 表 示 されます) 通 常 コントロールサンプルの 測 定 や 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 測 定 は サンプル 測 定 ステップ 内 (ここでは Thermo 1)です 矢 印 ( )は 差 し 込 み 測 定 を 表 しており 矢 印 が 向 かっているステップ(ここでは Thermo 1) の 中 で 実 行 されます 測 定 頻 度 に 関 しては Every もしくは Distribute にチェックを 入 れて 適 切 な 数 値 を 入 力 しま す 必 要 に 応 じて Run assay step once first( 矢 印 が 向 かっている 先 のステップが 開 始 さ

139 6. メソッドによるプログラムの 作 成 133 れる 直 前 に 実 施 )および Run assay step once first( 矢 印 が 向 かっている 先 のステップが 終 了 した 後 に 実 施 )にチェックを 入 れます 間 隔 の 確 認 に 関 しては Cycle Run List 機 能 を 使 います 使 用 方 法 は 補 足 6-2. を 参 照 して ください なお 測 定 ステップが 複 数 存 在 する 場 合 は 上 から 並 んだ 順 に 実 行 されます 必 要 に 応 じ て Move Up および Move Down を 用 いて 並 び 替 えます 上 に 示 した 例 では アナライトが 30 サンプルの 場 合 以 下 のように 測 定 が 実 行 されます Startup 1 Solvent correction 1 Control Sample 1 Thermo 1 1 から 15 番 目 までのアナライト Solvent correction 1 Control Sample 1 Thermo 1 16 から 30 番 目 のアナライト

140 メソッドによるプログラムの 作 成 補 足 6-2. サイクルの 測 定 順 序 の 確 認 と 変 更 サンプル 測 定 ステップ 内 において 溶 媒 補 正 用 曲 線 コントロールサンプルなどはサンプ ル 数 に 応 じて 複 数 回 繰 り 返 し 実 行 します 繰 り 返 し 回 数 の 設 定 は Recurrence および Number of replicates で 設 定 します 実 際 にどの 順 序 で 溶 媒 補 正 用 曲 線 コントロールサンプルなど が 実 行 されるか アッセイステップを 作 成 している 際 に Cycle Run List で 確 認 できます 溶 媒 補 正 用 曲 線 コントロールサンプルなどのステップに 関 して Recurrence および Number of replicates を 望 みの 間 隔 になるように 値 などを 入 力 し Cycle Run List をクリックします 各 ステップ 名 が 表 示 されます # Cycles/Assay step に 各 ステップ 内 における 測 定 サンプ ル 数 を 入 力 します 例 )Startup : 1 Sample : 7 Solvent correction : 1 Control Sample : 2 ウインドウ 内 の 右 側 に 測 定 サイクルの 順 番 がリスト 表 示 されます 望 みの 順 序 になるよう に 必 要 に 応 じて Recurrence および Number of replicates の 設 定 を 変 更 します

141 6. メソッドによるプログラムの 作 成 135 Cycle types をクリックします Cycle types では 大 きく 分 けて 4 つの 設 定 項 目 があります 1 サイクルタイプの 作 成 削 除 名 前 の 変 更 ウィザードで 作 成 したプログラムを 読 み 込 んでいる 場 合 は 通 常 はここで 新 たな サイクルタイプを 追 加 する 必 要 はありません 作 成 法 の 詳 細 は 補 足 6-3. を 参 照 してください 2 各 サイクルのコマンドの 設 定 およびパラメータの 入 力 各 コマンドをプルダウンメニューから 選 択 し Insert ( )をクリック

142 メソッドによるプログラムの 作 成 して 追 加 します 各 コマンドの 順 序 は および にて 調 整 します 各 コマ ンドのパラメータは 右 隣 の 画 面 2 で 入 力 します 以 下 の 9 種 類 があります 使 用 頻 度 が 高 いのは Capture Sample Regeneration です 中 でも Sample は Evaluation software で 反 応 速 度 定 数 や 親 和 定 数 の 算 出 および 濃 度 測 定 などの 解 析 を 実 行 する 際 に 必 須 なコマンドとなります Sample 測 定 サンプル(アナライト)の 添 加 コマンドです Types: 添 加 モード Low Sample consumption サンプルの 消 費 量 が 少 なく サンプル 消 費 量 は 7 mm プラスチックバイアル 使 用 時 添 加 容 量 + 28 μl です High performance サンプル 添 加 時 の 希 釈 が 少 なく サンプル 消 費 量 は 7 mm プラスチックバイアル 使 用 時 添 加 容 量 + 58 μl で す 主 に 反 応 速 度 定 数 や 解 離 定 数 の 算 出 時 に 用 いま す Single cycle kinetics シングルサイクル 法 による 反 応 速 度 定 数 や 解 離 定 数 算 出 時 に 用 います 最 大 5 濃 度 までアナライトの 連 続 添 加 が 可 能 です サンプル 消 費 量 は 7 mm プラスチック バイアル 使 用 時 添 加 容 量 + 58 μl です Sample solution: デフォルトは Is variable です Contact time: サンプル 添 加 時 間 (s)を 入 力 します Dissociation time: 解 離 時 間 (s)を 入 力 します シングルサイクル 法 では 最 後 に 添 加 するサンプルの 解 離 時 間 の 設 定 となります Flow rate: 流 速 (μl/min)を 入 力 します Flow path: サンプル 添 加 流 路 を 選 択 します Detection を Dual に 設 定 している 場 合 以 下 のフロー セルにサンプルが 流 れます 必 要 に 応 じて 選 択 します First 2-1 の 場 合 は の 場 合 は 3

143 6. メソッドによるプログラムの 作 成 137 Second 2-1 の 場 合 は の 場 合 は 4 Both 2-1 の 場 合 は 1 および の 場 合 は 3 および 4 Detection を Multi に 設 定 している 場 合 は 該 当 するフ ローセル 番 号 をプルダウンメニューから 選 択 します Predip サンプルを 分 取 する 前 にニードルを 洗 浄 する 場 合 にチ ェックを 入 れるます Mix with: サンプルを 自 動 混 合 します 各 サンプルは 指 定 された 溶 液 と 混 合 後 に 添 加 されます 混 合 したい 溶 液 の 名 称 を 入 力 します Fraction:にサンプ ルおよび 混 合 用 溶 液 の 混 合 比 を 入 力 します 例 えば 20(%)と 入 力 すると 混 合 用 溶 液 20%とサン プル 80%が 混 合 されます 混 合 後 は Stabilization period after mix に 入 力 された 時 間 が 経 過 した 後 に 添 加 されます 阻 害 法 を 用 いた 濃 度 測 定 実 験 で 使 用 します なお Mix 機 能 を 使 用 する 場 合 には 必 ず 混 合 用 のバイアルが 必 要 です Extra wash after injection with: サンプル 添 加 後 のフローセル 以 外 の 流 路 を 洗 浄 する 場 合 にチェックを 入 れます 洗 浄 溶 液 名 を 入 力 します センサーチップ 表 面 には 流 れません Stabilization period: 次 のコマンド 実 行 までの 待 機 時 間 を 設 定 する 場 合 にチ ェックを 入 れます 待 機 時 間 (s)を 入 力 します Capture リガンドのキャプチャー 用 添 加 コマンドです Enhancement アナライトの 結 合 確 認 またはシグナル 増 幅 として 2 次 抗 体 などを 添 加 するコマ ンドです

144 メソッドによるプログラムの 作 成 Regeneration 再 生 溶 液 の 添 加 コマンドです 粘 性 が 高 い 溶 液 (40% グリセロール 以 上 )を 使 用 する 場 合 は High viscosity solution にチェックを 入 れます Carry-over control キャリーオーバーチェックの 添 加 コマンドです 40 μl/min で 30 秒 ランニング 緩 衝 液 を 添 加 します Evaluation Software で 結 合 レス ポンスからキャリーオーバーを 評 価 します 低 分 子 化 合 物 をアナライトとして 添 加 する 場 合 は 測 定 サイクルの 最 後 に 実 施 することを 推 奨 します Solvent correction 溶 媒 補 正 溶 液 の 添 加 コマンドです 30 μl/min で 30 秒 溶 媒 補 正 溶 液 を 添 加 します 溶 媒 補 正 溶 液 を 添 加 する 数 だけ コ マンドを 挿 入 します InjectAndRecover 結 合 したアナライトの 回 収 コマンドです General Sample コマンドと 同 等 の 機 能 を 持 ちますが 添 加 モードに Dual Inject の 機 能 が 追 加 されています Dual Inject は 1 つ 目 のサンプル 添 加 終 了 後 ランニング 緩 衝 液 での 自 動 洗 浄 をはさむことなく 引 き 続 き 2 つ 目 のサンプルを 添 加 することがで きます ただし General コマンドで 実 行 したデータは 解 析 できません If Then 自 動 判 断 機 能 コマンドです 取 得 したレポートポイントから その 次 の 操 作 コマンドの 追 加 省 略 プログラ ム 全 体 を 終 了 させる 設 定 が 可 能 です

145 6. メソッドによるプログラムの 作 成 各 測 定 サイクルの 変 数 の 設 定 変 数 設 定 には Method Variables と Evaluation Variables の 2 つがあります Method Variables 各 測 定 サイクルのコマンドおよびパラメータの 変 数 を 設 定 できます 通 常 サン プルコマンドの 変 数 の 設 定 は Solution にチェックが 入 っています 測 定 サイクル ごとに 添 加 時 間 などを 変 数 として 設 定 する 場 合 は 各 項 目 にチェックを 入 れます Evaluation Variables 解 析 ソフトウェアに 反 映 される 変 数 の 設 定 および 解 析 目 的 を 設 定 します テンプレートのメソッドやウィザードで 作 成 したプログラムを 開 いている 場 合 Evaluation purpose に 応 じて 解 析 に 必 要 な 変 数 はあらかじめ 設 定 されています そ れらのチェックは 外 さないように 注 意 します チェックが 入 っていなくても 測 定 自 体 は 実 行 されますが Evaluation software による 解 析 は 実 行 できません プログラムに 定 義 されていないパラメータを 作 成 する 場 合 は User defined variables 下 の Add をクリックし 作 成 します Evaluation purpose は Sample コマ ンドの 設 定 時 のみ 表 示 されます Evaluation purpose には 以 下 の 7 種 類 があります Kinetics/Affinity Thermodynamics Concentration Affinity in solution Kinetics Heterogeneous analyte Calibration free conc General

146 メソッドによるプログラムの 作 成 4 レポートポイントの 編 集 Report Points タブをクリックすると 各 コマンドのレポートポイントの 一 覧 を 見 ることが きます レポートポイントの 追 加 方 法 は 以 下 の 通 りです Name レポートポイントの 名 称 を 入 力 します Sec Start of / End of および Inject で 定 義 されるイベントから 何 秒 離 れた 時 刻 にレポートポイントを 取 るかを 設 定 し ます Before / After Start of / End of および Inject で 定 義 されるイベントの 前 後 どちら 側 にレポートポイントを 取 るかを 設 定 します Start of / End of Inject で 定 義 されるイベントの 開 始 時 および 終 了 時 の どちらを 基 準 点 にするかを 設 定 します Inject 取 得 したいレポートポイントと 関 連 づけるイベントを プルダウンメニューから 選 択 します Window レポートポイントの 値 (RU)を 算 出 するための 時 間 幅 を 設 定 します 通 常 5 秒 です 指 定 した 時 間 の 平 均 値 をレポートポイントとします Baseline 該 当 するレポートポイントをベースライン( 相 対 値 0) にするか 設 定 します

147 6. メソッドによるプログラムの 作 成 141 補 足 6-3. サイクルタイプおよびアッセイステップの 追 加 アッセイステップはそのメソッドに 存 在 するいずれかのサイクルタイプと 必 ず 関 連 づける 必 要 があります 新 規 サイクルタイプの 追 加 と 関 連 づける 新 規 アッセイステップの 追 加 の 流 れを 示 します ここでは 低 分 子 アナライト 測 定 時 に 必 要 な 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 作 成 ス テップ(Solvent correction)の 追 加 を 例 として 説 明 します Cycle types 画 面 にて New ( )をクリックします Rename で 新 規 サイクルタイプの 名 称 を 入 力 します(ここでは Solvent correction) Commands タ ブのプルダウンメニューから Solvent correction を 選 択 し て Insert ( ) をクリックします 溶 媒 補 正 溶 液 を 添 加 する 数 だけコマンドを 追 加 し 新 規 サイクルタイプを 作 成 します 続 いて Solvent correction のステップをアッセイステップに 追 加 します Assay steps ダイアログにて New ( )をクリックします

148 メソッドによるプログラムの 作 成 アッセイステップの 最 後 尾 に 新 規 のステップ(ここでは Assay step 1)が 挿 入 されます Assay step 1 をクリックして 選 択 し Base settings の 設 定 に 移 ります Name Purpose Connect to cycle type Solvent correction Solvent correction Solvent correction 以 上 でステップの 追 加 は 完 了 です 追 加 し た ス テ ッ プ は 必 要 に 応 じ て Recurrence Number of replicates Assay step preparations を 適 切 に 設 定 します

149 6. メソッドによるプログラムの 作 成 143 Variable Settings をクリックします 各 ステップの 変 数 をどの 時 点 で 入 力 するのか 画 面 右 上 の 3 項 目 から 選 択 します Define all values at run time 測 定 開 始 直 前 に 入 力 するモードです Define all values in method 現 画 面 上 で 入 力 するモードです 作 成 したメソッドを 頻 繁 にテンプレー トとして 使 用 し 毎 回 変 更 がない 場 合 は ここで 入 力 しておくと 測 定 直 前 での 情 報 入 力 が 不 要 となります Define some values in method and others at run time 幾 つかの 情 報 を 現 画 面 上 で 入 力 し その 他 の 情 報 は 測 定 開 始 直 前 に 入 力 するモードです Verification をクリックします

150 メソッドによるプログラムの 作 成 メソッドの 設 定 に 不 備 が 無 ければ The method has been verified and can be used to set up a run. と 表 示 されます 間 違 いがある 場 合 は 該 当 部 分 が 表 示 されるので 指 示 に 従 って 修 正 します 確 認 後 Setup Run をクリックします 適 切 な Flow path を 選 択 し Next をクリックします

151 6. メソッドによるプログラムの 作 成 145 Sample & Assay Setup のすべてのステップについて 必 要 事 項 を 入 力 します Define all values at run time を 選 択 したステップは この 時 点 でサンプル 情 報 の 入 力 が 必 要 となります 各 ステップをクリックすると 画 面 下 にサンプル 情 報 が 入 力 できるよう になります 入 力 する 必 要 のないカラムが 出 てきた 場 合 は 空 欄 のまま 次 に 進 みます 補 足 6-4. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 します すべての 項 目 を 入 力 後 Next >をクリックします

152 メソッドによるプログラムの 作 成 サイクルリストが 表 示 されます 上 から 順 番 に 測 定 が 実 行 されます 問 題 が 無 ければ Next >をクリックします

153 6. メソッドによるプログラムの 作 成 メソッドの 実 行 測 定 を 始 める 前 に Prime および Normalize を 実 施 する 場 合 はチェックを 入 れます 設 定 後 Next >をクリックします 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 6-5. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Simple Position Import でそのファイル を 読 み 込 むと サンプル 位 置 が 変 更 されます

154 メソッドによるプログラムの 作 成 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next をクリックします 測 定 時 の 基 本 的 な 共 通 注 意 事 項 と 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 容 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したメソッドをテンプレートとして 保 存 するかメッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォルダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 が 開 始 します 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます 解 析 およびデータの 評 価 は 各 章 を 参 照 してください

155 6. メソッドによるプログラムの 作 成 149 補 足 6-6. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 設 定 が 可 能 です Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

156 メソッドによるプログラムの 作 成 補 足 6-7. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

157 7. メンテナンス メンテナンス システム 内 部 に 設 置 されているマイクロ 流 路 系 (IFC)は 消 耗 品 であり 使 用 するサンプル の 性 状 や 使 用 頻 度 に 応 じて 耐 久 月 数 が 異 なります より 長 くマイクロ 流 路 系 を 使 用 する ために システム 使 用 ごとのメンテナンスの 実 施 を 推 奨 します システムのメンテナンスは 既 定 のメンテナンスプログラム(Menu bar の Tools More Tools Maintenance Tools )に 従 って 実 行 します ランニング 緩 衝 液 として 超 純 水 を 使 用 します また メンテナンス 時 はメンテナンス 用 試 薬 によりセンサーチップ 表 面 に 固 定 化 しているリガンドは 破 壊 されてしまうので 必 ず Sensor Chip Maintenance(もしくは 使 用 済 みセンサーチップ)を 使 用 してください システム 温 度 は 25 に 設 定 します メンテナンスコマンドの 呼 び 出 し Menu bar の Tools More Tools を 選 択 します Tools ダイアログが 表 示 されます 各 コマンドを 選 択 すると ウインドウ 下 で 内 容 と 最 終 実 施 日 が 確 認 できます

158 メンテナンス メンテナンスに 必 要 な 試 薬 通 常 のメンテナンスに 必 要 な 試 薬 は Biacore Maintenance Kit, type 2 (BR )に 含 ま れています BIAdesorb solution 1 95 ml x 2 BIAdesorb solution 2 95 ml x 2 BIAtest solution 65 ml BIAdisinfectant solution (conc. ) 10 ml x 3 BIAnormalizing solution 90 ml HBS-N Buffer 10 X 50 ml Sensor Chip Maintenance 1 枚 BIAdesorb solution 1 は 4 で 保 存 すると SDS が 析 出 します BIAdesorb solution 1 のみ 室 温 で 保 存 してください(その 他 のキット 内 試 薬 は 4 で 保 存 してください) Sensor Chip Maintenance は 洗 浄 用 チップです 保 存 時 には 埃 が 付 着 しないように パラフィルムで 巻 いて 室 温 で 保 存 してください 再 使 用 時 には ガラス 面 に 汚 れが 付 着 していないことを 確 認 してから Dock してください また 定 期 的 に 新 しいものに 交 換 して ください

159 7. メンテナンス 153 補 足 7-1. メンテナンスチップへの 交 換 方 法 Toolbar の Eject アイコン( )または Menu bar の Tools Eject Chip を 選 択 します Eject Chip をクリックします センサーチップポートが 開 くのでセンサーチップを 取 り 出 し メンテナンス 用 センサーチ ップ(Sensor Chip Maintenance)をセットします あわせて ランニング 緩 衝 液 ボトルを 超 純 水 ボトルに 交 換 します Insert Chip ダイアログが 表 示 されるので Chip type: Maintenance を 選 択 後 Chip id;を 入 力 し Dock Chip をクリックします Dock が 完 了 すると 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります Dock 終 了 後 は 超 純 水 で Prime を 実 行 します

160 メンテナンス 7-1. システムの 洗 浄 Desorb IFC および サンプルチューブに 付 着 した 汚 れなどを 洗 浄 するプログラムです 1 週 間 に 1 回 必 ず 実 施 してください 実 験 内 容 の 変 更 ごとに 実 施 することを 推 奨 します なお クルードサンプルや 不 溶 性 サンプル 使 用 時 には 実 験 終 了 後 に 実 施 してください 所 要 時 間 は 約 20 分 です 測 定 温 度 および Sample compartment 温 度 は 20 以 上 で 実 施 してください 試 薬 Biacore Maintenance Kit, type 2 BIAdesorb solution 1(0.5 % SDS) BIAdesorb solution 2(50 mm Gly-NaOH ph 9.5) ランニング 緩 衝 液 超 純 水 Tools More Tools Maintenance Tools Desorb を 選 択 し Start をクリックしま す 内 容 を 確 認 後 Next >をクリックします 内 容 を 確 認 後 Next >をクリックします BIAdesorb solution 1 および BIAdesorb solution 2 を 指 示 された 量 分 注 してラックにセット し Start をクリックします Desorb 終 了 後 装 置 は 自 動 的 に Standby flow の 状 態 になります そのままの 状 態 で 3~4 時 間 放 置 するか Prime を 3 回 実 施 します

161 7. メンテナンス Desorb and Sanitize すべてのフローシステムの 滅 菌 および 洗 浄 するプログラムです 1 ヶ 月 に 1 回 必 ず 実 施 してください 所 要 時 間 は 約 1 時 間 です 測 定 温 度 および Sample compartment 温 度 は 20 以 上 で 実 施 してください バッファーチューブ(チューブ A, B, C, D)の 洗 浄 後 A 以 外 のチューブ(チューブ B, C, D) を 空 にして 終 了 します 試 薬 Biacore Maintenance Kit, type 2 BIAdesorb solution 1(0.5 % SDS) BIAdesorb solution 2(50 mm Gly-NaOH ph 9.5) BIAdisinfectant solution 原 液 6 ml を 超 純 水 80 ml で 希 釈 ランニング 緩 衝 液 超 純 水 Maintenance Tools Desorb and Sanitize を 選 択 して Start をクリックします 内 容 を 確 認 後 Next >をクリックします 内 容 を 確 認 後 Next >をクリックします

162 メンテナンス BIAdesorb Solution 1 を 25 ml, 15 ml の 2 本 に 分 注 します チューブ A, B, C, D は すべて BIAdesorb Solution 1 ボトル(25 ml)にセットします 超 純 水 チューブを BIAdesorb Solution 1 ボトル(15 ml)にセットします Start をクリックします ステップ 1 の 終 了 後 自 動 的 にステップ 2 のダイアログが 表 示 されます BIAdesorb Solution 2 を 25 ml, 15 ml の 2 本 に 分 注 する チューブ A, B, C, D は すべて BIAdesorb Solution 2 ボトル(25 ml)にセットします 超 純 水 チューブを BIAdesorb Solution 2 ボトル(15 ml)にセットします Start をクリックします ステップ 2 の 終 了 後 自 動 的 にステップ 3 のダイアログが 表 示 されます BIAdisinfectant Solution を 50 ml, 30 ml の 2 本 に 分 注 します チューブ A, B, C, D は すべて BIAdisinfectant Solution ボトル(50 ml)にセットします 超 純 水 チューブを BIAdisinfectant Solution ボトル(30 ml)にセットします Start をクリックします

163 7. メンテナンス 157 ステップ 3 の 終 了 後 自 動 的 にステップ 4 のダイアログが 表 示 されます チューブ A, B, C, D は すべて 超 純 水 ボトル(ランニング 緩 衝 液 ボトル)にセットします 超 純 水 チューブを 超 純 水 ボトルにセットします Start をクリックします ステップ 4 の 終 了 後 自 動 的 にステップ 5 のダイアログが 表 示 されます チューブ A を 緩 衝 液 (10~50 mm HEPES や Tris 緩 衝 液 )が 入 ったボトルにセットします チューブ B, C, D は 空 気 を 吸 えるようにボトルから 取 り 出 します Start をクリックします ステップ 5 の 終 了 後 装 置 は 自 動 的 に Standby flow の 状 態 になります この 状 態 で 3~4 時 間 放 置 します もしくは Prime を 3 回 実 施 します Close をクリックして 洗 浄 を 終 了 します 電 源 を 落 とす 場 合 には 超 純 水 で Prime を 実 行 してください なお 汚 れがひどく Desorb and Sanitize で 十 分 な 洗 浄 効 果 が 得 られない 場 合 には Tools More Tools Service Tools の Superclean を 実 行 してください

164 メンテナンス Empty Buffer Tubing B,C,D のバッファーチューブを 超 純 水 で 洗 浄 後 チューブの 中 身 を 空 にするプログラムです Buffer scouting またはシステムチェックで B,C,D のチューブを 使 用 後 使 用 する 予 定 がない 場 合 に 実 行 します 所 要 時 間 は 約 20 分 です ランニング 緩 衝 液 超 純 水 70%エタノール 溶 液 Tools More Tools Maintenance Tools Empty Buffer Tubing を 選 択 し Start をク リックします Next >をクリックします 本 体 左 側 のチューブ A,B,C,D をすべて 超 純 水 ボトルにセットします Start をクリックします ステップ 1 終 了 後 自 動 的 にステップ 2 のダイアログが 表 示 されます 本 体 左 側 のチューブ A,B,C,D すべてを 70%エタノール 溶 液 (10 ml)のボトルにセットします Start をクリックします ステップ 2 終 了 後 自 動 的 にステップ 3 のダイアログが 表 示 されます

165 7. メンテナンス 159 本 体 左 側 のチューブ A,B,C,D を 空 気 が 吸 えるようボトルから 出 します Start をクリックします Close をクリックします B,C,D のチューブは キムワイプで 拭 いて チューブホルダーに 収 納 してください

166 メンテナンス Wash Buffer Tubing A,B,C,D のバッファーチューブを 洗 浄 するプログラムです 界 面 活 性 剤 または BSA など 吸 着 しやすい 物 質 を 含 んだランニング 緩 衝 液 を 使 用 後 それ らの 物 質 を 含 んでいないランニング 緩 衝 液 に 切 り 替 えて 実 験 する 場 合 に 実 行 します 所 要 時 間 は 約 30 分 です 試 薬 Biacore Maintenance Kit, type 2 BIAdesorb solution 1(0.5 % SDS) BIAdesorb solution 2(50 mm Gly-NaOH ph 9.5) ランニング 緩 衝 液 超 純 水 Tools More Tools Maintenance Tools Wash Buffer Tubing を 選 択 し Start をク リックします 洗 浄 するチューブを 選 択 し Next >をクリックします 内 容 を 確 認 後 Next >をクリックします

167 7. メンテナンス 161 最 初 に 選 択 したチューブを BIAdesorb Solution 1(20 ml)ボトルに 入 れ Start をクリックし ます ステップ 1 終 了 後 自 動 的 にステップ 2 のダイアログが 表 示 されます チューブを BIAdesorb Solution 2(20 ml)ボトルに 入 れ Start をクリックします ステップ 2 終 了 後 自 動 的 にステップ 3 のダイアログが 表 示 されます チューブを 超 純 水 ボトルに 入 れ Start をクリックします ステップ 3 終 了 後 自 動 的 に 以 下 のダイアログが 表 示 されます Close をクリックします 使 用 しないチューブはチューブホルダーに 収 納 してください

168 メンテナンス 7-2. シグナルの 校 正 Normalize センサーチップを 新 規 にセットした 際 に 実 施 することを 推 奨 します 試 薬 Biacore Maintenance Kit, type 2 BIAnormalizing solution センサーチップおよびランニング 緩 衝 液 実 験 に 使 用 するセンサーチップおよびランニング 緩 衝 液 Tools More Tools Maintenance Tools Normalize を 選 択 し Start をクリックし ます Next >をクリックします バイアルをセット 後 Start をクリックします 終 了 後 下 記 ダイアログが 表 示 されます 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります

169 7. メンテナンス システムチェック 装 置 の 診 断 をおこなうプログラムです このプログラムは Desorb and Sanitize による 洗 浄 後 に 実 行 してください シグナルのドリフトや エアースパイクの 混 入 が 激 しい 場 合 などに 実 施 します 使 用 頻 度 が 高 い 場 合 定 期 的 に 実 行 することを 推 奨 します 所 要 時 間 は 約 1 時 間 です 試 薬 Biacore Maintenance Kit, type 2 BIAtest solution ランニング 緩 衝 液 HBS-N Buffer 150 ml 程 度 (メンテナンスキットの 10X Buffer を 希 釈 して 使 用 します) 超 純 水 必 要 な 消 耗 品 新 品 の Series S Sensor Chip CM5 (チェック 後 実 験 に 使 用 可 能 ) BIAtest solution 1.5 ml プラスチックバイアル 新 品 のセンサーチップ CM5 を Dock 後 HBS-N 緩 衝 液 で Prime を 実 施 します Tools More Tools Test Tools System Check を 選 択 し Start をクリックします System Check ダイアログが 表 示 されます デフォルトでは 上 から 4 項 目 が 選 択 されてい ます Next >をクリックします Merged and Dual injections および Buffer Selector を 使 用 す る 場 合 にはチェックを 入 れます

170 メンテナンス A のチューブを HBS-N Buffer ボトルに 入 れます Buffer Selector テストを 行 う 場 合 には B,C および D のチューブを 超 純 水 の 入 ったボトルに 差 し 込 みます (Buffer Selector テストが 必 要 なければ B,C,D のチューブを 超 純 水 ボトルに 入 れる 必 要 はありません ) Next >をクリックします BIAtest Solution を 1.5 ml プラスチックバイアルに 795 μl 分 注 してラックポジションにセッ トします また 空 の 1.5 ml プラスチックバイアル 4 本 を キャップをして 指 定 のラック ポジションにセットします Merged and Dual injections テストをおこなう 場 合 には BIAtest Solution を 995 μl と 空 バイアルを 7 本 セットします Start をクリックします

171 7. メンテナンス 165 続 いて 測 定 結 果 の 保 存 先 を 指 定 します File name を 入 力 して Save すると 測 定 がスター トします Buffer Selector テストを 実 施 した 場 合 で システムチェックを 実 行 後 B,C およ び D のチューブを 使 用 しない 場 合 は Empty Buffer Tubing を 実 行 してください 測 定 が 終 了 すると チェック 結 果 が 自 動 的 に 表 示 されます 各 チェック 項 目 について 測 定 値 が 正 常 範 囲 内 であれば PASS 範 囲 外 であれば FAIL と 診 断 されます FAIL が 表 示 さ れている 場 合 には 弊 社 技 術 サービス 部 にご 相 談 ください

172 実 験 の 終 了 8. 実 験 の 終 了 実 験 が 終 了 した 際 には 次 のいずれかの 方 法 でシステムを 維 持 できます スタンバイ 状 態 で 放 置 7 日 以 内 に 使 用 する 場 合 電 源 を 落 として 終 了 7 日 以 上 使 用 しない 場 合 8-1. スタンバイ 状 態 での 放 置 測 定 が 終 了 すると 自 動 的 に Standby flow 状 態 になります チューブ A にセットしたランニング 緩 衝 液 で 65 ml/ 24 時 間 の 流 速 を 最 長 7 日 間 継 続 しま す ランニングバッファーを 涸 らさないように 注 意 してください 廃 液 ボトルの 空 き 容 量 にも 注 意 してください スタンバイ 状 態 であるか 否 かは ウインドウ 下 の Status bar で 確 認 できます 8-2. 電 源 の 落 とし 方 電 源 を 落 とす 前 には メンテナンスを 実 行 してください Toolbar の Eject アイコン( )または Menu bar の Tools Eject Chip を 選 択 します Eject Chip をクリックします センサーチップポートが 開 きます センサーチップを 取 り 出 し control software を 終 了 します パソコンのシャットダウン の 本 体 電 源 を 落 とします 注 意 ) 電 源 を 落 とす 場 合 は システム 内 部 が 超 純 水 で 置 き 換 わっているかどうか 確 認 の 上 電 源 を 落 としてください

173 8. 実 験 の 終 了 センサーチップの 保 存 取 り 出 したセンサーチップは 以 下 の 2 つの 方 法 で 保 存 できます リガンドは 保 存 中 に 変 性 する 可 能 性 があるので 再 使 用 の 際 にはポジティブコントロール サンプルのレスポンスからリガンドの 活 性 を 確 認 してください また 再 Dock 時 前 には 検 出 面 固 定 化 面 に 埃 などの 汚 れが 付 着 していないことを 確 認 してください ドライ 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップにパラフィルムを 巻 いて 4 で 保 存 します 安 定 なサンプルを 固 定 したセンサーチップの 保 存 に 用 います ウェット 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップのシート 部 分 をカバーから 抜 き 取 り シートだけを 容 器 (50 ml 容 のふた 付 きプラスチック 遠 心 チューブ 等 )に 分 注 した HBS-EP+などの 緩 衝 液 に 浸 し 4 で 保 存 します シートの 取 り 出 しと 保 存 センサーチップはカバーとシートから 構 成 されています カバー シート シートの 金 基 板 の 窪 んでいる 面 はリガンドが 固 定 化 されています 平 らな 面 は 検 出 器 が 接 触 します リガンド 固 定 化 面 には 触 れないよう 注 意 してく ださい 下 図 のようにピンセットにてシートを 抜 き 出 し 緩 衝 液 に 浸 して 保 存 し ます

174 実 験 の 終 了 保 存 していたシートからの 緩 衝 液 成 分 の 除 去 とカバーへの 収 納 再 利 用 する 際 は 緩 衝 液 に 浸 していたシートをカバーに 収 めます シートの 水 分 を 取 り 除 いてからカバーに 収 めてください プラスチックの 部 分 および 検 出 面 固 定 化 面 キムワイプで 拭 き 超 純 水 で 湿 らせたキムワ イプで 再 度 拭 きます さらに 乾 いたキムワイ プで 拭 きます キムワイプなどを こより 状 に 細 くして 金 基 板 の 中 央 部 分 に 触 れないように 四 隅 か ら 水 分 を 吸 収 します 検 出 面 固 定 化 面 埃 に 注 意 しながらカバーに 収 めます 下 図 のように 検 出 面 が 表 になる 向 きで ピンセットにてカバーの 左 側 から 挿 入 します リガンド 固 定 化 面 を 表 にして 挿 入 した 場 合 には 最 後 までシートが 入 りません

175 9. センサーグラムの 編 集 センサーグラムの 編 集 ウィザードまたはメソッドを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation Software は 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データが 開 かれます 過 去 に 取 得 したデータを 編 集 解 析 する 場 合 は Evaluation ソフトウェアを 起 動 し ファイルを 呼 び 出 してください 9-1. ソフトウェアの 起 動 画 面 左 下 の Start All programs Biacore Evaluation Software をクリ ックします

176 センサーグラムの 編 集 9-2. ファイルの 呼 び 出 し アイコン( )もしくは File Open をクリックし 目 的 のファイルを 選 択 します ( 通 常 ファイルは C:/BIA users/に 保 存 されています ) ここでは 練 習 用 データ C:/BIA users/t200 demo File / Binding Analysis を 選 択 します OK をクリックします

177 9. センサーグラムの 編 集 171 補 足 9-1. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

178 センサーグラムの 編 集 9-3. センサーグラムの 編 集 Evaluation Explorer で Sensorgram フォルダから All sensorgrams をクリックし Work area 内 に Sensorgram window を 表 示 します センサーグラムの 表 示 Sensorgram window 上 部 のセレクションツールを 使 用 します フローセル 別 センサーグラムの 選 択 択 します の もしくは をクリックし 目 的 のフローセルを 選 複 数 のフローセルを 同 時 に 選 択 する 場 合 は を 使 用 します キーボードの Ctrl キーを 押 しながら 目 的 のフローセルをクリックします 連 続 したフロ ーセルを 選 択 する 場 合 は マウスのドラッグ 操 作 によっても 選 択 可 能 です

179 9. センサーグラムの 編 集 173 特 定 のセンサーグラムの 選 択 の もしくは をクリックし 目 的 のサイクルを 選 択 し ます 複 数 のサイクルを 同 時 に 選 択 する 場 合 は を 使 用 します キーボードの Ctrl キーを 押 しながら 目 的 のサイクルをクリックします 連 続 したフロー セルを 選 択 する 場 合 は マウスのドラッグ 操 作 によっても 選 択 可 能 です

180 センサーグラムの 編 集 センサーグラムの 表 示 の 変 更 Sensorgram window 上 部 のセレクションツールの 右 端 にある を 使 用 します 色 の 表 示 の 変 更 Tools Color By Sample をクリックします サンプル 名 ごとに 自 動 的 にセンサーグラムの 色 が 変 更 します その 他 測 定 温 度 ごとやフローセルごとにも 色 を 変 更 することができます レポートポイントの 表 示 Tools Report Point Id and Marker をクリックします レポートポイントの id が 表 示 されます

181 9. センサーグラムの 編 集 センサーグラムの 添 加 開 始 時 間 ベースライン 合 わせ Sensorgram window 上 部 のセレクションツールの 右 端 にある を 使 用 します Tools Sensorgram Adjustment をクリックします サンプル 添 加 開 始 時 間 合 わせ X-Adjustmentvに Report point (time=0)をクリックし で baseline を 選 択 します OK をクリックします

182 センサーグラムの 編 集 ベースラインあわせ Y-Adjustment も 同 様 に Report point (response=0)をクリックし します で baseline を 選 択 OK をクリックします センサーグラムの 不 必 要 部 分 の 削 除 削 除 する 範 囲 を マウスを 右 クリックしたままドラッグして 選 択 します

183 9. センサーグラムの 編 集 177 余 白 部 分 で 右 クリックし Cut を 選 択 します 選 択 した 範 囲 が 削 除 されます センサーグラムの 差 し 引 き 差 し 引 きしたいセンサーグラム(ブランク)と 差 し 引 くセンサーグラムを 重 ね 書 きしま す ブランクのセンサーグラムの 上 にポインターを 移 動 して 表 示 されるサイクル 数 を 確 認 します Sensorgram window 上 部 のセレクションツールの 右 端 にある を 使 用 します Tools Sensorgram Adjustment をクリックします

184 センサーグラムの 編 集 Blank Subtraction の Enable Blank Subtraction にチェックを 入 れ クのセンサーグラムを 選 択 します をクリックしてブラン ブランクのセンサーグラムは 直 線 に 変 わります センサーグラムのノーマライズ 指 定 した 結 合 量 を 基 準 として 結 合 量 の 100 あわせを 行 うことをノーマライズといいます 解 離 速 度 の 比 較 を 行 う 場 合 などに 使 用 します 添 加 開 始 およびベースラインのゼロ 合 わせを 実 施 したセンサーグラムを 用 いて 実 施 します Sensorgram window 上 部 のセレクションツールの 右 端 にある を 使 用 します Tools Sensorgram Adjustment をクリックします

185 9. センサーグラムの 編 集 179 Enable Second Y-Adjustment (Normalize)にチェックを 入 れます 解 離 速 度 定 数 の 比 較 を 行 う 場 合 には Injection Event (response = 100)を 選 択 して (Sample 1 stop)を 選 択 します OK をクリックします をクリックして 添 加 終 了 添 加 終 了 時 点 の 結 合 量 を 100 RU として ノーマライズ 後 のセンサーグラムが 表 示 されます

186 センサーグラムの 編 集 9-4. グラフの 編 集 Sensorgram window 上 のマウスの 右 クリックメニューを 使 用 します スケールの 変 更 Scale 通 常 Auto が 選 択 されています スケールを 変 更 する 場 合 は 軸 のスケールの 最 小 値 (Min:)と 最 大 値 (Max:)を 入 力 します のチェックを 外 し 各 OK をクリックします

187 9. センサーグラムの 編 集 181 凡 例 の 移 動 と 削 除 Legend 通 常 Right が 選 択 されています 移 動 する 位 置 を 選 択 します 凡 例 をグラフに 表 示 しない 場 合 は Hidden を 選 択 します OK をクリックします グリッドラインの 表 示 Gridlines 主 軸 目 盛 りに 対 してグリッドラインを 表 示 させるときは Major Gridlines にチェックを 入 れ ます 副 目 盛 りに 対 してグリッドラインを 表 示 させるときは Minor Gridlines にチェックを 入 れます OK をクリックします

188 センサーグラムの 編 集 9-5. データの 移 管 データの 移 管 方 法 には 次 の 方 法 があります 1 画 像 データファイルとして 移 管 2テキスト 形 式 ファイルとして 移 管 3エクセル 形 式 ファイルとして 移 管 画 像 データファイルして 移 管 Sensorgram window 上 のマウスの 右 クリックメニューを 使 用 します Copy Graph をクリックします グラフを 画 像 としてコピーします 続 いて Biacore 付 属 のパソコンにインストールされてい る Word Pad Paint などに 貼 り 付 け 貼 り 付 けたファイルを 保 存 します 保 存 したファイル は 画 像 として 別 のパソコンに 移 動 させることが 可 能 です ( 例 )Word Pad への 貼 り 付 け センサーグラムをテキスト 形 式 ファイルとして 移 管 Sensorgram window 上 のマウスの 右 クリックメニューを 使 用 します Export Curves をクリックします 保 存 先 を 指 定 して 保 存 します( 拡 張 子 :txt) 保 存 したファイルは 他 のパソコンの Excel などのグラフ 描 画 機 能 を 持 つソフトウェアで 再 びセンサーグラムを 作 成 することが 可 能 で す

189 9. センサーグラムの 編 集 183 ( 例 ) 保 存 した text ファイル 解 析 データを Excel 形 式 ファイルとして 移 管 File Export Result To Excel をクリックします 保 存 先 を 指 定 して 保 存 します( 拡 張 子 :xls) Evaluation Explorer に 表 示 されている 解 析 結 果 の 数 値 データなどが 保 存 されます ただし センサーグラムのデータは 保 存 されません 他 のパソコンの Excel で 解 析 結 果 を 開 くことができます ( 例 ) 保 存 した xls ファイル

190 センサーグラムの 編 集 9-6. データの 保 存 File Save As をクリックします Save in:に 保 存 先 (C:/Bia Users/ 個 人 名 など)を 選 択 し File name:にファイル 名 を 入 力 し Save をクリックします 補 足 9-2. ファイルのアイコン ファイルの 種 類 によってアイコンが 異 なります Control ソフトウェアで 保 存 したファイル Evaluation ソフトウェアで 保 存 したファイル テキスト 形 式 で 保 存 したデータファイル

191 索 引 A 索 引 Add Report point After run... 95, 129 Aim for immobilized level... 35, 42 Analysis temperature... 10, 29, 37, 61, 103, 129 Application wizards Assay step preparations , 142 Assay Steps... 95, 124, 127 Automatic Positioning... 63, 105, 149 B Base Line Baseline... 21, 67, 110, 171 Batch mode...68, 81, 88 Biacore Maintenance Kit , 154, 155, 160, 162, 163 Binding Analysis Binding level... 67, 110, 171 Binding to reference... 67, 110, 171 Bivalent Analyte... 72, 115 Blank immobilization Buffer settings... 95, 129 Bulk Effect C Capture... 58, 136, 137 Carry Over Chi , 76, 91, 118, 119 Concentration... 53, 60, 139 Concentration Analysis Concentration unit... 95, 129 Concentrations per cycle Connect to cycle type Contact time...29, 49, 59, 98, 99, 136 Copy Graph crude Current Fits... 78, 80, 121, 123

192 索 引 Custom Methods Cycle Run List... 61, 133, 134 Cycle Types... 97, 127 D Data Collection rate... 95, 128 Desorb Desorb and Sanitize , 163 Detection... 58, 95, 128, 137 Dissociation time... 59, 98, 99, 136 DMSO... 3, 26, 46, 128 Dock Chip... 6, 153 E EDC... 25, 36, 38, 40 Eject Rack... 11, 30, 38, 49, 64, 106, 148 Eject Rack Tray... 11, 30, 38, 64, 106, 148 Empty Buffer Tubing , 164 End manual run... 22, 51 End Run... 22, 51 Enhancement Evaluation Variables Export Curves Extra wash after injection with... 98, 137 F Flow path... 15, 28, 47, 58, 98, 99, 101, 136, 144 Flow rate... 15, 29, 47, 59, 98, 99, 136 Fraction G General General Settings... 94, 126 H Heterogeneous Analyte... 72, 115 Heterogeneous Ligand... 72, 115 High performance High viscosity solution... 59, 138 I If Then

193 索 引 Immobilization ph Scouting... 26, 27, 28, 32, 33 Immobilization Results Immunogenicity Inject command... 18, 19, 48, 49 InjectAndRecover K ka 54, 55, 73, 75, 77, 85, 93, 116, 118, 120 kd 54, 55, 73, 75, 77, 85, 93, 116, 118, 120 KD.45, 54, 55, 56, 75, 91, 92, 93, 118 Keyword Table... 66, 87, 109 Kinetics Summary Kinetics/Affinity... 53, 57, 139 L Low Sample consumption... 99, 136 M Manual run... 14, 15 Method Variables Methods Methods and Templates... 28, 31, 34, 38, 41, 57, 64, 106, 125, 148 Mix with Multiple Rmax N New chip... 5 NHS... 23, 25, 26, 33, 35, 36, 38, 40, 44 Normalize... 29, 37, 61, 103, 147, 162, 179 Number of cycles Number of replicates... 96, 97, 131, 134, 142 O On-Off Rate Map Overview... 94, 126 P Predip Prime... 9, 29, 37, 61, 103, 147, 153, 154, 157, 163 Print Purpose , 131

194 索 引 Q Quality Assessment Quality Control... 73, 116 R Rack tray... 12, 13, 30, 38, 64, 106, 148 Reagent rack, Type Reagent rack, Type Recurrence , 132, 134, 142 Reference line Reference Line... 20, 51 Regeneration... 50, 58, 98, 99, 136, 138 Regeneration Scouting Remove Selection... 70, 113 Repeat assay step within Report... 21, 75, 118 Report point... 21, 175, 176 Req... 55, 90 Residuals... 74, 76, 117, 119 Response Bound Response Final Result To Excel Reuse chip... 5, 7 RI.73, 75, 76, 77, 79, 116, 118, 119, 120, 122 Rmax... 24, 55, 73, 75, 77, 79, 91, 116, 118, 120, 122 Run... 4, 15 S Sample and reagent rack Sample compartment temperature... 29, 37, 61, 95, 103, 128 Sample solution SE... 76, 119 Sensor Chip Maintenance , 152, 153 Sensorgram Adjustment , 177, 178 Show All Curves Show average blank(s)... 68, 88, 111 Show Curves of Same Type Show Only Current Curve... 48

195 索 引 Single cycle kinetics... 98, 136 Single mode... 68, 88 Single-cycle Kinetics Solvent correction Specify contact time and flow rate Stabilization period... 59, 98, 137 Standard error... 76, 119 Standby flow... 6, 9, 22, 32, 39, 51, 65, 107, 148, 153, 154, 157, 162, 166 Startup... 58, 96, 99, 102 Steady State Affinity Stop Run... 65, 108, 150 Surface Performance Surface Preparation...28, 34, 41 System Check T Target level Temperature... 4, 10, 29, 37, 61, 103 Thermodynamics... 53, 139 Tile Horizontally Tile Vertically Two state Reaction... 72, 115 Type Types U U-value... 75, 76, 118, 119 V Variable Settings... 99, 127, 143 Verification , 126, 143 Verifivcation Vial/well position W Wash Buffer Tubing Wash solution... 42

196 索 引 あ アイコンの 説 明 アナライトの 回 収... 53, 138 アフィニティー アフィニティーが アミンカップリングキット アミンカップリング 法 アルデヒドカップリング 法 い 一 時 停 止 印 刷 え エクセル 形 式 ファイル エタノールアミン か カーブフィッティング カイネティクス 解 析 解 離 速 度 定 数 解 離 定 数... 24, 45, 53, 54 化 学 耐 性 画 像 データファイル き キャリーオーバー... 58, 138 緊 急 停 止 結 合 速 度 定 数 こ 固 定 化 固 定 化 量 さ サーフェスチオールカップリング 法 再 解 析... 77, 78, 79, 120, 121, 122 サイクルの 切 り 替 え 再 生 条 件... 45, 46, 52, 59 再 生 溶 液... 46, 50 最 大 結 合 量 残 差 プロット... 74, 76, 117, 119

197 索 引 サンプル 位 置... 62, 63, 104, 105, 147, 149 サンプル 情 報... 61, 66, 87, 109 し シグナルの 校 正 システムチェック 至 適 アナライト 濃 度 自 動 判 断 機 能 コマンド 試 料 必 要 量 シングルサイクル 法... 45, 53, 54, 136 す スクリーニング スタンバイ ステータスマーク... 73, 116 せ センサーグラムの 編 集 , 172 センサーチップの 固 定 化 履 歴... 7 センサーチップの 挿 入... 5 センサーチップの 保 存 そ 測 定 の 終 了... 17, 22 た ダミーラン... 58, 99 て データの 移 管 テキスト 形 式 ファイル 電 源 の 落 とし 方 の 濃 度 測 定 ノーマライズ は バイアル バッチ 解 析 反 応 速 度 定 数 反 応 モデル... 71, 72, 114 ひ 非 線 形 最 小 二 乗 法... 55

198 索 引 標 準 誤 差... 76, 119 ふ ファイルのアイコン フィッティング プーリング 機 能... 63, 105, 149 プレコンセントレーション 効 果 へ 平 衡 値 解 析 ま マストランスポートリミテーション... 24, 73, 116 マニュアル 測 定 マルチサイクル 法... 53, 54 め メソッド メソッドビルダー... 14, 124, 126 メンテナンス , 153 ゆ 有 機 溶 媒... 26, 46 よ 溶 液 効 果... 45, 73, 75, 91, 116, 118 溶 媒 補 正 , 134, 138, 141 ら ラックトレイ...11, 12, 13 ラックの 取 り 出 し ランニング 緩 衝 液 の 交 換... 9 ランニング 緩 衝 液 の 種 類... 3 り リガンド 希 釈 液... 25, 26, 27, 28 リガンドチオールカップリング 法 リファレンスセル... 35, 45 リファレンスライン... 20, 21, 50, 51 リファレンスラインウィンドウ 流 速 の 変 更 流 路 の 切 り 替 え れ レポートポイント... 20, 22, 50, 67, 110, 138, 140

199 索 引 レポートポイントテーブル レポートポイントの 追 加... 20

200

201 60

202 OFF TEL : : : 30

203

204 FAQ Q&A FAQ Q&A MicroCal Q&A Web Web 2013 GE 8