卵黄 PIP 2 IP 3 mammalian ICSI ER Ca 2+ 胚盤

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1 世界初 体外授精法を用いた有用な鳥類の創出 Production of valuable chicken using intracytoplasmic sperm injection 静岡大学総合科学技術研究科准教授笹浪知宏 農学専攻

2 卵黄 PIP 2 IP 3 mammalian ICSI ER Ca 2+ 胚盤

3 本技術は 鳥類における唯一の体外受精システムである

4 類の受精卵の卵殻培養法 (Site of fertilization) infundibulun oviduct magnum Chicken; Perry et al., Nature Quail; Ono et al., Dev. Biol uterus vagina isthmus 3.5 hr after fertilization 7 hr System I 1cell stage X in vivo fertilized egg System II stage X 52h incubation 24 hr Blastoderm formation (around 24 hr) Stage X System III 52h incubation hatch Hatch Total 18 days incubation (quail) 体外受精により得られた受精卵の孵化は報告されていない

5 鳥類の顕微授精 (ICSI) システム ejaculated sperm single sperm ISCI 卵の 24 時間培養後の発生状況 No. of oocytes injected Developed (%) stages II IV V VI X 30 5 (16.6) germinal disc (Hrabia et al., Biol Reprod., 2003) Under stereomicroscope DAPI staining oocyte 5,000 times bigger マウス卵 VS ウズラの胚盤

6 類の受精 : 理的多精 1 つの卵子に受精する 2 個の精子 多精受精 ( sperm) blastodisc 卵黄 雌性前核形成に及ぼす精子抽出物の効果 70 c c c 排卵卵子 (%) a ab b 雌性前核雄性前核 sperm extracts (ng) (Mizushima et al, Mol Reprod Dev, 2009)

7 精子のみ Stage VII ICSI 卵の発 に及ぼす精 抽出物の効果 1 ng 精子抽出物 Stage 6 2 ng の精子抽出物 hatch Hatched quail and her offspring Mizushima et al., Development, 2014 Injecting sample injected No. of eggs Developed (%) No. of embryos: Developed to the stage of IV V VI VII VIII X XII hatch (%) Sp 26 5 (19) Sp+ 10 pg SE (1 sperm) 6 2 (33) 1 1 Sp+ 50 pg SE (50 sperm) 11 6 (55) Sp+ 1 ng SE (100 sperm) (72) Sp+ 2 ng SE (200 sperm) (79) (7) Sp+ 2 ng SE + BAPTA 5 0 (0) ICSI により初めてヒナの孵化に成功した

8 Live birth offspring, Megumi, the grace of God in Japanese

9 ヒナの孵化には PLCz, CS, AH の 3 種類の因子が必須である single sperm PLCZ, AH, CS crna hatch PLCZ crna stage 6 AH, CS crna no fertilization (Mizushima et al., Development, 2014) Injecting sample injected No. of eggs Developed (%) No. of embryos: Developed to the stage of IV V VI VII X XIII hatch (%) Sp Sp+SE Sp+60ng PLCZ crna Sp+AH and CS crnas Sp+PLCZ and AH crnas Sp+PLCZ and CS crnas Sp+PLCZ, AH and CS crnas 26 5 (19) (79) (7) 13 6 (46) (0) 9 5 (56) (63) (71) (6)

10 顕微授精法の応用 1 遺伝子組み換え鳥類の作出

11 ICSI 法を応用して 1. 外来遺伝子導入ウズラを作出する 2. 核移植ウズラを作出する

12 トランスジェニックまたはゲノム編集ニワトリの作出に要する期間 PGC 法と ICSI 法との比較 PGC 法 年 * 培養 PGC の株化 (3-4 ヶ月 ) * 遺伝子組換えおよび組換え PGC の培養 (1-2 ヶ月 ) *PGC 細胞移植個体の性成熟および F1 作出 (6 ヶ月 ) *F1 の性成熟および F2 の作出 (6 ヶ月 ) 6-12 ヶ月 ICSI 法 *KO を含めたゲノム編集家禽の作出 (1 世代で可能 :6 ヶ月 ) * トランスジェニックニワトリの作出 ( 遺伝子導入個体の性成熟および F1 作出が必要 (6 ヶ月 )) ジーンターゲッティング外来遺伝子導入効率遺伝子発現 挿入 欠損可能 * 遺伝的に雌型 ( 性染色体 :ZW) の PGC は培養が困難 低い * 培養 PGC の相同組換え率 ( %) * 遺伝的に雌型 ( 性染色体 :ZW) の PGC 培養が困難 * 培養 PGC 細胞の生殖腺への定着率が個体により変動 ( 1 86%) ブスルファンによる内在性 PGC を死滅させることにより改善 安定 欠損のみ可能 * ジーンターゲッティングによる遺伝子挿入は困難 ( ランダムインサーションのみ可 ) 高い * ランダム挿入率 (40-50%) * 遺伝的に雌型 ( 性染色体 :ZW) の個体へも導入が可能 * モザイク発現になる可能性が高い ( 遺伝子導入個体 ) 安定

13 ICSI 法を応用して 1. 外来遺伝子導入ウズラを作出する 2. 核移植ウズラを作出する 外来遺伝子導入ウズラの作出 ICSI-sperm-mediated gene transfer: ICSI-SMGT) 精子ベクター法 + 細胞膜を破壊 GFP vector (Perry et al., Science, 1999) 精子細胞膜の破壊 :Triton X-100 (TX-100) または凍結 融解 (FT) 処理 ICSI-SMGT:EGFP ベクターとインキュベートした細胞膜破壊処理精子を 50μM IP3 および 1mg/ml SE とともに排卵直後の卵に顕微注入

14 精子と外来遺伝子との結合に対する TX-100 または FT 処理の効果 Control LIVE/DEAD staining (bp) 1k 精子の GFP vector との結合試験 (PCR 解析 ) 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp B MSp MSp: Multiple Sperm B: Buffer 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp B MSp TX-100 処 理 (bp) 1k Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp 1Sp B MSp FT 処 理 (bp) 1k

15 ウズラ胚の発生率と GFP 発現に対する TX-100 または FT 処理の効果 PBS TX-100 FT 24 hr after injection 6 day after injection Blastoderm stage IX Embryo stage 25 1 mm Blastoderm stage V fluorescent stereomicroscope 1 mm 1 mm Blastoderm stage V 1 mm 1 mm Blastoderm stage IX Embryo stage 27 1 mm 1 mm 1 mm 1 mm stereomicroscope GFP 発現 (bp) 2 k 1.5 k 1 k RT-PCR S17 PBS FT GFP Western blot (kda) β-actin PBS FT GFP Sperm treatment No. of oocytes injected Developed (%) Expressing GFP (%) No. of embryos: Developed to the stage of III IV V VI VII VIII XI Control TX-100 FT (88.2) 2 (14.4) (73.3) 6 (72.8) (85.0) 14 (82.3)

16 GFP 発現ウズラ胚の GFP 遺伝子の検出 PCR sp wt FT 処理群 Southern blot sp wt FT 処理群 (bp) (kbp) Sperm factor を用いた ICSI-GFP 発現ウズラ胚と GFP 遺伝子の検出 Stage 30 stereomicroscope 2 mm fluorescent stereomicroscope

17 顕微授精法の応用 2 クローン鳥類の作出

18 哺乳類のクローン動物作製法 鳥類ではクローン動物作出の報告はない 受精卵 未受精卵 卵の除核操作が要らない 卵子の核は受精しないと壊れていく 卵の DNA

19 体細胞核移植によるクローンウズラの作製 ドナー細胞 * 受精卵 (stage X) ) から得た胚盤葉細胞卵子 * 放卵卵子または UV 照射した排卵卵子 ドナー細胞 stage X 核移植 * 胚盤葉細胞とともに 50μM IP3, 1mg/ml 精子抽出物または 3 つの因子を顕微注入 *5 μg/ml のサイトカラシン B を添加した培養液で 4 時間培養卵殻培養 * システム I システム III 培養 Single blastderm cell

20 核移植によるクローンウズラ胚の作出 H&H 8 EGK IX 1mm 1mm 100 µm クローンウズラ胚の発 率と発 ステージ No. of oocytes No. of embryos Injected 21 Developed (%) Developed to the stage of II III IV V VI VII VIII IX X 8 4 (19.0) 本技術は クローン鳥類を作出可能な唯一のシステムである

21 想定される用途 家禽育種 食品 農医薬品産業への応用が可能 質の良いニワトリの創 産卵成績の良いニワトリの創 割れにくい卵の創 鶏 鶏卵の 付加価値化 医薬品を含む卵を産むニワトリの創 アレルゲンを除去した鶏卵や鶏 の創 遺伝資源の保存技術の開発 絶滅 類の復活

22 低い孵化率 (8-10%) 実用化への課題 顕微授精の精度の問題 : 胚盤が不透明であり 注入した精子が可視化できない排卵直後のウズラ卵胚盤の拡大図胚盤の切片 (HE 染色 ) 胚盤 100 µm 1 mm 卵黄 卵殻培養法の問題 : in vivo 受精卵の卵殻培養での孵化率が 19-25% System III の培養 2 日で約 50% の胚が死亡 System I (1 細胞 Stage X) System II (Stage X 孵卵 52h) System III ( 孵卵 52h hatch) Hatch 計 17 日培養 Ono, T. et al. Comp. Biochem. Physiol. 113A, , 1996.

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