Jpn J Electroph 1996; 40: 299
Jpn J Electroph 図1. ミ ト コ ン ド リ ア3243位 3243位 がGに 変 異 (A G) 変 異 す る と, 制 限 酵 素ApaIに 1996; 40: 301 の 解 析. よ る認 識 サ イ トが 現 れ るの で, 酵 素 で 切 断 され, 137bpサ イ ズ が 検 出 され る. この 測 定 系 は レ ー ン2に 変 異 型1%の 存 在 で も検 出 で き る こ とを 示 して い る. よ り, ら れ る場 合 が あ る. 例 え ばC型 肝炎 ウイル スに おいて は, NS5A領 域 の塩 基 配列 が変 異 して いれ ば イ ン タ ー フ ェ ロ ン α に感 受 性 が あ り予 後 の 経 過 が よ い が, 変 異 し て い な け れ ば イ ン タ ー フ ェ ロ ン抵 抗 性 で あ る. 一 方, 結 核 菌 で はrpo B領 域 が 変 異 す る と リフ ァ ン ピ シ ン耐 性 と な る. ま た, B型 肝 炎 ウ イ ル ス のpre C領 域 の塩 基 置 換 は 症 状 悪 化 や 劇 症 化 と問 連 す る こ とか ら, こ れ らの 疾 患 で は 治 療 効 果 を予 測 す る た め に, 微 生 物 ゲ ノ ム の 特 定 領 域 の 塩 基 配 列 を 解 析 す る こ とが 重 要 と な る. 遺 伝 子 の微 細 な 変 異 を解 析 す る 方 と し て, (1)塩 基 配 列 解 析, (2)SSCP, electrophoresis (HA) (3)denaturing (DGGE), gradient gel (4)heteroduplex analysis な どが あ る. ま た, 最 近 で は 一 本 鎖DNAの2 次 構 造 の 特 異 領 域 を 認 識 し て 切 断 す る 酵 素 (cleavase) 図2. 各MRSA株 polymorphisms のパ ル ス フィー ル ドゲル 電 気泳 動 像. を 用 い た cleavase (CFLP) fragment (Third Wave length Technol- ogies/ラ イ フテ ッ ク オ リエ ン タ ル) や, 標 的DNAを 鋳 型 に し て 合 成 し たRNA鎖 病原 微生 物 のゲ ノム変 異解 析 ブ リ ダ イ ズ させ た 後 にRNase 微 生物 ゲ ノムの変 異解 析が感 染症 の治療 と関連 づ け -13- を, 野 性 型RNAと Hで 切 断 して, 電 気 泳 動 で 確 認 す る RNase ハイ ミス マ ッチ 部 分 を cleavage assay
生物 物理 化学 1996; 40: 302 図3. 脆 弱X症 候 群 の 患 者 に お け るGCC反 復 遺 伝 子 の 解 析. FMR-1遺 伝 子 断 片 を プ ロ ー ブ と して 制 限 酵 素 (EcoRIとPstI) と組 み 合 わ せ た サ ザ ン プ ロ ッ ト解析 の 結 果 を示 す. こ こ で は被 検 検 体DNAに お い て約670回 のGCC反 復 配 列 が 認 め られ る (正 常 者 にお け る反 復 は6 54回 程 度). (RCA) (Ambion/フ ナ コ シ) が キ ッ ト化 され 市 販 の 三 つ の 方 が 用 い られ る. され て い る. (1) 塩 基 配 列 解 析 の 原 理 と し てdideoxy とMaxam (Sanger) に よ る も の が 主 流 で あ る. 実 際 に ABI/Perkin-Elmer, 作 所 お よ びDuPon社 ン サ ー を用 い てPCRの Pharmacia, : 標 的 遺 伝 子 を 制 限 酵 素 で 適 当 な に切 断 し, そ れ を ベ ク タ ー に挿 入 して, 大 腸 菌 で 増 や Gilbert が あ る が, 最 近 の オ ー トシ ー ケ ンサ ー は dideoxy Shotgun 長 さ (通 常 は シ ー ケ ンス しや す い よ う に500 800bp) し, 精 製 後 各 ク ロ ー ン を シ ー ケ ン ス す る. 制 限 酵 素, 日立 製 作 所, 島 津 製 断 片 を ク ロ ー ニ ン グ す る ベ ク タ ー お よ び大 腸 菌 が 必 要 な どか ら市販 され て い るシー ケ で, 操 作 手 順 は簡 単 で あ るが 各 ク ロ ー ン の 塩 基 配 列 結 原 理 を 応 用 し て, dideoxy 応 を行 う cycle sequencing 反 果 を 連 結 す る操 作 が 広 く用 い ら れ て い る. オ ー ト シ ー ケ ンサ ー で は, 蛍 光 色 素 (dye) を プ ライ (2) Primer (ア ッ セ ン ブ リー) が 必 要 で あ る. Walk : シ ー ケ ン ス して 得 られ る配 列 結 果 を も と に, そ の3'末 端 側 の プ ラ イ マ ー を 合 成 マ ー や タ ー ミネ ー タ ー に 標 識 した ダ イ プ ラ イ マ ー また し, こ こか ら さ ら に3'側 に 向 けて シ ー ケ ン ス し て い く はダ イ タ ー ミネ ー タ ー を 用 い るが, 一 般 に 前 者 の ほ う 方 で, が よ り長 くシ ー ケ ン ス で き る. しか し, 解 析 領 域 が 長 プ ラ イ マ ー を必 要 とす る. ダ イ タ ー ミネ ー タ ー と組 い場 合 に は, 以 下 に述 べ る primer み 合 わ せ て 用 い ら れ る. walk が使 える点 で ダ イ タ ー ミネ ー タ ー が 便 利 で あ る. (3) 塩 基 配 列 解 析 は, 一 般 に 目的 領 域 を プ ラ ス ミ ドに 挿 入 し, そ れ を 大 腸 菌 中 で 増 幅 し た 後, 製 して 解 析 を行 う が, PCRプ ロ ダ ク トを直 接 シ ー ケ ン ス す る 方 (direct sequence) 1kb以 プ ラ ス ミ ドを 精 も よ く用 い られ る. ア ッ セ ン ブ リ ー操 作 は簡 単 で あ るが, 多 くの Nested Deletion : 直 線 化 し た 標 的DNA を, 数 本 の チ ュ ー ブ に分 注 して 用 意 し, DNA末 端か ら exonuclease で 処 理 し, 処 理 時 間 の 異 な る複 数 の処 理 産 物 を 得 る. これ ら をベ ク タ ー に挿 入 し, 大 腸 菌 中 で 増 殖 後 プ ラ ス ミ ドを 精 製 し (サ ブ ク ロ ー ン の作 製), サ ブ ク ロ ー ン を シ ー ケ ン ス す る. exonuclease 上 の 長鎖 を シー ケ ンス す る場 合 には通 常 以 下 -14- 各 と クロ
Jpn J Electroph 1996; 40: 303