Image-J を使用した連続薄切標本からの組織立体構築 Image-J は JAVA ベースで作られた画像処理ソフトであり もともと医療画像解析を主目的に開発されてきた経緯から ソフトウェアの演算処理過程が簡易 明確であり多方面の科学研究に使用されている ここでは Image-J を用いた組織 立体構築法の基本操作について説明する 1. Image-J 使用可能な OS 環境 ImageJ は Windows Mac OS X, Mac OS, Linux で使用できる なお 多数枚の連続標本の画像処理には大きなメモリ容量と高性能のPCの使用が推奨される Windowsであれば64bit のOSを選択 (32bitでは1アプリケーションでメモリ2GBが上限) することが望ましい 2. Image-J のインストール Image-J Web サイト :http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html の download を選んで 使用するPCの OS 環境に適した Image-J バージョンをダウンロードする インストール後には インターネットに接続して Update Image-J コマンドを実行することで 自動的にソフトウェアとプラグインを更新できる 3. 組織立体構築に必要なプラグイン Image-J の特徴として プラグイン という拡張プログラムファイルをダウンロードすることで 目的に適した機能システムを設計できる 組織立体構築操作に最小必要なプラグインは ImageJ 3D Viewer StackReg TurboReg Color Deconvolution の 4 種類である (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/index.html) ダウンロードしたプラグインファイルは いずれも圧縮されているので解凍する 解凍処理によって作成されたフォルダを Image-J フォルダ内の piugins フォルダに移動することでプラグイン操作は完了する 4. 立体構築に用いる原図情報の準備 Image-Jで扱えるファイル形式は 生物系顕微鏡のファイル形式(TIFF, GIF, JPEG, DICOM, BMP, PGM, FITS) 形式を網羅している 組織立体構築に先立って 原図ファイル (CCD カメラで撮影された顕微鏡画像, バーチャルスライドによるデジタル画像 共焦点顕微鏡像など ) を単一のフォルダに保存して A001 A002 のように桁数を揃えた連番号 ( 画像スタック ) で個別の画像レコードに名称をつける < 以下の項目では われわれが日常的に実行している Cytokeratin 抗体 /DAB 発色と Ki-67 抗体 /Vector SG 発色による二重免疫染色画像を例として 組織立体構築の手順を 説明する > 5. Image-J で画像スタックを開く 1. File Import Image Sequence を選択 2. 画像スタックが収納されているフォルダを指定し フォルダにある画像の一つをクリックして選択すると Sequence Option ダイアログボックスが表示される Number of images: 積層する画像数を入力 Starting image: 何番目の画像から始めるのかを指定 Increment: 入力した数値毎にイメージを呼び出す Scale mages: 呼び出す画像サイズを設定 File name contains: 入力した文字列を含むファイルを読み込む
Sort names numerically: 番号順に読み込み (or enter pattern Convert to RGB Use virtual stack は空欄のまま残す ) 3. OK をクリックすると画像スタックが読み込まれる 4. ウインドウ下部のスライダーを動かすと 積層された画像を閲覧で きる 4. ボリューム情報の入力空間座標を設定するために数値 ( 薄切標本の厚さと単位ピクセル長さ ) を入力 1. Image Properties を選択すると右図のダイアログボックスが表示される Channels: ImageJ で開いているイメージスタックのチャンネル数 Slices: 積層表示している画像枚数 Frames: 空欄のまま???? 不明 Use of Length: 長さの単位を入力 ( nm, um, mm など ) Pixel Width, Pixel Height: 単位ピクセル長さ Voxel Depth: 厚さ Frame Interval: タイムラプス画像スタックにおいて フレーム数 / 秒を設定 Origin: 画像座標系の基準点を設定 Global: チェックを入れると 現在の作業中に開いた全ての画像スタックに対して同一条件を付与 2. OK をクリックする 3. ここで設定した空間情報は保存されないので 画像スタックを開くたびに設定する必要がある 5. 積層画像の自動位置合わせ 1. Plugins StackReg を選択すると右図のダイアログボックスが表示される 2. Transfomation: Translation ( 平行移動 ) Rigid Body ( 平行移動 + 回転 ) Scaled Rotation ( 平行移動 + 回転 + 均等拡大 ) Affine ( 平行移動 + 回転 + 縦横方向への不当拡大 ) 通常の連続標本の積層では Rigid Body を選択して OK をクリックする Scaled Rotation や Affine では 標本の歪みを補正するため画像の拡大変形を加える 実際上は 良好な位置合わせ結果は得られない 4. 位置合わせが完了した後 File Save as Image Sequence で保存する
6. 色調抽出 ( 免疫標識に基づく組織要素の分画 ) 1. Plugins Color Decomvolution を選択すると右図のダイアログボックスが表示される 2. Vectors 内に頻用される染色法について その色調抽出条件が与えられている 例 )H&E ヘマトキシリン エオジン染色 H DAB 免疫染色 (DAB 発色 )+ ヘマトキシリン核染色 3. 任意の染色条件を用いた場合 ( ここでは DAB と Vector SG の二重染色 ) には From ROI 機能を使用して 色調幅を任意で設定する From ROI では 組織画像から 3 つの色調幅条件を設定する必要がある 4. From ROI を選択して OK をクリックすると右図のメッセージが表示される OK ボタンをクリックして 最初に DAB の色調幅を設定する 設定方法は 画像内の DAB 発色領域を矩形でドラッグ選択する 複数の領域を同時設定することも可能 設定完了後にマウスの右ボタンをクリックすると設定が完了する 同様の操作を繰り返して 次に Vector SG の発色領域を同様に設定する 今回の染色条件では 設定すべき 3 番目の色調が存在しないので 背景色を選択しておく 5. 3 つの色調設定が完了すると 自動的に演算が開始されるので 結果画面が表示されるまで待つ 6. 色調抽出の結果として 新たに 3 つのウインドウが表示される この結果画面を使用して 後述する Binary 処理を施すと DAB 染色要素と Vector SG 染色要素とが分画できる DAB Vector SG 背景 7. 色抽出結果の画像スタックを File Save as Image Sequence で保存する 7. 色抽出結果された画像スタックの 2 値化処理 1. DAB 色調の抽出結果ウインドウをクリックして選択する 2. Process Binary Make Binary を選択すると DAB 標識の癌実質が分画される 3. Vector SG 色調抽出結果ウインドウにつても同様の作業を繰り返して Vector SG 標識の Ki-67 陽性核を分画する
4. 2 値化処理で得られた画像スタックについても File Save as Image Sequence で保存する 8. 論理演算処理による組織要素の分画操作 Vector SG の色調で抽出 2 値化された Ki-67 陽性核を 実質空間に帰属する核質 と 間質空間に帰属する核質 とに分画する 1. 癌実質データを反転して間質空間を分画する 2 値化処理で分画された実質ウインドウを選択して Edit Invert を選択する 2. 実質 / 間質空間に帰属する Ki-67 陽性核を分画する Process Image Calculator を選択する Image 1 と Image 2 で論理演算対象とするデータ を選択 Operation で実行 する演算処理を選び OK を クリック 3. File Save as Image Sequence で演算結果を保存する
9. 癌実質データの細線化処理図形の特徴を保持した状態で 立体構築像の最外側の組織要素を 1 ピクセル幅に細線化して透過表示することで 内部構造を直視することができる 1. 癌実質ウインドウを選択 Process Binary Outline を実行する 2. File Save as Image Sequence で演算結果を保存する 10. 抽出 分画要素 ( 癌実質 癌実質 outline 間質 実質 Ki67 陽性核 間質 Ki67 陽性核 ) の立体表示 1. 立体表示に必要な抽出 分画要素以外の画像スタックウインドウをすべて閉じる 2. 癌実質要素の画像スタックウインドウを選択し Plugins 3D Viewer ImageJ 3D Viewer を実行すると右図のダイアログパネルが表示される Image: 立体表示するデータの選択 Name:3D Viewer 上で表示され組織要素の名称 Display as: 投影方法 ( ボクセルモデルかサーフェイスモデルを選択 ) Color: 疑似カラーの選択 後で任意の疑似カラーに設定できる Threshold: 不明 Resampling factor: 不明 Channels: 不明 3. OK をクリックすると 3 次元投影ウインドウが開く マウスのドラッグ操作で任意方からの観察が可能 立体画像の拡大 縮小はマウスのホイール操作で可能 組織要素の追加 1. ImageJ 3D Viewer ウインドウの File Add content を選択 前述のダイアログパネルが表示されるので 3 次元投影するデータを選択する 2. この操作を繰り返すことにより すべての組織要素を 3 次元空間に投影 表示できる 疑似カラーの設定 1. ImageJ 3D Viewer ウインドウの Select メニューで対象とする組織要素を選択する 2. ImageJ 3D Viewer ウインドウの File Edit Attribute Change Color を選択 R, G, B のスライダーを調整して任意の疑似カラーを適応できる 組織要素の透過度 1. ImageJ 3D Viewer ウインドウの Select メニューで対象とする組織要素を選択する 2. ImageJ 3D Viewer ウインドウの File Edit Attribute Change Transparency を選択 スライ
ドを調整して適応させる 立体表示の ON, OFF 1. ImageJ 3D Viewer ウインドウの Select メニューで対象とする組織要素を選択する 2. ImageJ 3D Viewer ウインドウの File Edit Hide/Show Show Content の On/Off を切り替える 動画作成 ImageJ 3D Viewer には回転動画作成ツールが格納されている 1. ImageJ 3D Viewer ウインドウの View Record 360 deg rotation を選択すると 立体画像が 360 度回転して新しいウインドウ ( 動画ウインドウ ) が作成される 2. 新しく作成された動画ウインドウを選択して ImageJ メニューの File Save as AVI( 動画ファイルフォーマット ) を選択 保存すると動画ファイルが保存できる なお ImageJ 3D Viewer で投影させた 3D 情報については保存することができない