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あゆみやまがた
7 years ago
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1 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) の神経変性メカニズムを解明和歌山県立医科大学神経内科学講座伊東秀文

3 共同研究者和歌山県立医科大学医学部愛媛大学プロテオサイエンスセンター綾木孝伊東秀文 ( 神経内科学 ) 高橋宏隆竹田浩之澤崎達也大阪市立大学医学部広島大学原爆放射線医科学研究所及川大輔徳永文稔 ( 分子細胞生物学 ) 川上秀史群馬大学生体調節研究所医学部京都大学医学部中澤世識亀井希代子竹吉泉岩井一宏畑田出穂東京大学理学部石井亮平石谷隆一郎濡木理 ( 構造生物学 )

4 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

5 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

6 ALS の症状と社会的認知随意筋を支配する上位および下位運動ニューロンが選択的に侵される進行性の神経変性疾患四肢の筋力低下と筋萎縮により寝たきりとなり呼吸筋麻痺により死亡する引用 :ALS 運動ニューロン疾患 ( 辻省次総編集中山書店 ) Lou Gehrig ( 引用 :wikipedia) アイスバケツチャレンジ ( 引用 :

7 Guam/Kii ALS

8 ALS の生命予後 Kaplan-Meier 法による病型別生存曲線栁澤信夫 : 第 40 回日本神経学会総会サテライトシンポジウムより引用

9 レヴィ小体 Lewy body α- シヌクレイン凝集細胞死レヴィ小体形成

10 遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子 Abou-Sleiman PM, Muqit MM, Wood NW. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson s disease. Nat Rev Neurosci. 2006;7(3):

11 Pathways to parkinsonism Abou-Sleiman PM, et al. Nat Rev Neurosci

12 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

13 ALS の神経病理ユビキチン染色円形封入体正常 ALS TDP-43 染色

14 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) ALS Guam/Kii ALS Sporadic ALS Familial ALS (FALS) SOD1 TDP-43 FUS Unknown 家族性 ALS の 70% は原因遺伝子不明

15 劣性型 FALS 患者の homozygosity mapping

16 ALS の新規原因遺伝子 optineurin (2010) Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465: , 2010.

17 OPTN の構造 huntingtin

18 Optineurin は autophagy receptor である Tumbarello DA et al. J Cell Sci 2013;126:

19 The rate of discovery of ALS-related genes タンパク分解 RNA 代謝 Sreedharan J, Brown RH Jr. Amyotrophic lateral sclerosis: Problems and prospects. Ann Neurol 2013;74:309-16

20 ALS の分子病態 RNA 代謝タンパク分解 TDP-43 or FUS 核ー細胞質間輸送障害ストレス顆粒形成タンパク分解系の異常? 封入体形成 Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:

21 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

22 ユビキチンプロテアソームシステム (UPS)

23 The Nobel Prize in Chemistry 2004 "for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation" Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose Photos: Copyright The Nobel Foundation

24 iquitin の構造と機能 76 アミノ酸 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPD QQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG

25 iquitin の構造と機能 K48 K63

26 Polyubiquitin の多様性ユビキチン修飾系の最新モデル基質マルチ - モノユビキチン化基質基質 MQIFVKTLTGKTITLEVEPS DTIENVKAKIQDKEGIPPD QQRLIFAGKQLEDGRTLSD YNIQKESTLHLVLRLRGG E1, E2, E3, ATP 基質 K6 基質 K33 基質分枝鎖基質 K11 基質 K27 基質 K29 基質基質基質 K48 K63 基質混成鎖 P P 基質リン酸化 Ac 基質アセチル化

27 iquitin の構造と機能

amyloid protein Complement C3 VCAM ICAM TCRa, b MHC I 炎症性サイトカイン

28 NF-kB は炎症や免疫の中心的なレギュレーター細菌ウイルス感染 LPS dsrna 抗原受容体刺激 TCR BCR 炎症性サイトカイン TNF-a IL-1b 遺伝毒性ストレス紫外線放射線活性酸素種 NF-kB 免疫制御タンパク質 Serum amyloid protein Complement C3 VCAM ICAM TCRa, b MHC I 炎症性サイトカイン TNF-a IL-1 IL-6 IL-12 NF-kB 抑制 IkBa c-rel p105 A20 抗アポトーシス Bcl-XL IAPs G-CSF M-CSF

癌乳がん大腸がん胃がん肝臓がん円柱腫毛包上皮腫 B 細胞リンパ腫多発性骨髄腫骨髄性白血病炎症性疾患炎症性大腸炎クローン病皮膚炎

29 NF-kB シグナルの破綻は多くの疾患を引き起こす細菌ウイルス感染 LPS dsrna 抗原受容体刺激 TCR BCR 炎症性サイトカイン TNF-a IL-1b 遺伝毒性ストレス抗がん剤紫外線放射線活性酸素種癌乳がん大腸がん胃がん肝臓がん円柱腫毛包上皮腫 B 細胞リンパ腫多発性骨髄腫骨髄性白血病炎症性疾患炎症性大腸炎クローン病皮膚炎 NF-kB 自己免疫疾患関節リウマチ SLE 多発性硬化症乾癬アトピー性皮膚炎神経変性疾患緑内障筋萎縮性側索硬化症パーキンソン病アルツハイマー病生活習慣病糖尿病アテローム性動脈硬化症

LUBAC による直鎖状ユビキチン鎖を介した NF-kB 活性化とその破綻が引き起こす疾患 HOIL-1L HOIP SHARPIN 直鎖状ポリユビキチン鎖 LUBAC (Linear ubiquitin chain assembly complex) NF-kB 炎症免疫制御細胞生存に関わる遺伝子の発現調節癌炎症性疾患

30 LUBAC による直鎖状ユビキチン鎖を介した NF-kB 活性化とその破綻が引き起こす疾患 HOIL-1L HOIP SHARPIN 直鎖状ポリユビキチン鎖 LUBAC (Linear ubiquitin chain assembly complex) NF-kB 炎症免疫制御細胞生存に関わる遺伝子の発現調節癌炎症性疾患自己免疫疾患生活習慣病神経変性疾患 Kirisako, T. et al., EMBO J. (2006) Tokunaga, F. et al., Nature Cell Biol. (2009) Tokunaga, F. et al., Nature (2011) Tokunaga, F. et al. EMBO J. (2012)

31 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

32 孤発性 ALS Optineurin (OPTN) は孤発性家族性 ALS の発症に関与 SOD1-FALS FUS-FALS Maruyama H, Ito H, et al. Nature 465:223-6, Ito H, et al. Acta Neuropathol 121:555-7, 2011.

33 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) Guam/Kii ALS Sporadic ALS ALS OPTN Familial ALS (FALS) SOD1 TDP-43 FUS Unknown OPTN Unknown 分子メカニズムが異なる

34 Pathological condition ALS の分子病態ストレス顆粒形成 TDP-43 or FUS 核ー細胞質間輸送障害タンパク分解系の異常? 封入体形成オプチニューリン Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:

35 NF-κB 活性変異 OPTN は NF-κB 抑制作用を喪失 Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465: , 2010.

36 Optineurin Knockdown cell では細胞死が誘導される Akizuki M, Ito H* et al. J Neurochem 2013;126:

37 OPTN の構造直鎖状ユビキチン結合? UBAN huntingtin Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465: , 2010.

H486R Q545Q R545Q NF-κB (fold induction) オプチニューリンの ALS 型変異体は NF-kB

38 WT H26D E50K R96L M98K Q165X E322K Q398X Q454E D474N E478G H486R Q545Q LUBAC WT H26D E50K R96L M98K M98K Q165X E322K Q398X Q454E D474N E478G H486R Q545Q R545Q NF-κB (fold induction) オプチニューリンの ALS 型変異体は NF-kB 活性抑制能を喪失している変異 ; 緑内障 ALS (kda) FLAG-OPTN

直鎖状ユビキチン直鎖状ユビキチン Response Response c オプチニューリンのUBANドメインは 40 直鎖状ユビキチンに結合する 0 20-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Time (sec) オプチニューリン N

1000 nm distal distal distal NEMO distal E16 N R74 proximal NEMO distal OPTN proximal OPTN dista E16 C OPTN/NEMOQ2 proximal R479 distal

39 直鎖状ユビキチン直鎖状ユビキチン Response Response c オプチニューリンのUBANドメインは 40 直鎖状ユビキチンに結合する Time (sec) オプチニューリン N N a d Time (sec) -20 ()#%&'% 125 nm )#+%&'% 250 nm #++%&'% 500 nm #++%&'% 500 nm (+++%&'% 1000 nm distal distal distal NEMO distal E16 N R74 proximal NEMO distal OPTN proximal OPTN dista E16 C OPTN/NEMOQ2 proximal R479 distal NEMO distal R482 OPTN E478 オプチニューリン proximal proximal Q2 U proximal U proximal OPTN proximal b OPTN C C dista 東京大学大学院理学研究科濡木理教授との共同研究 dista

標的遺伝子の発現 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 TNF-a (h) 0 1 0 1 元の HeLa OPTN -/- が -H2 細胞欠損した細胞 80 70

40 IL-6 IL-6 (fold (fold induction) BIRC3 (fold induction) ICA (fold (fold induction) オプチニューリンが欠損した細胞では NF-kB 活性化が亢進する細胞内シグナル元の細胞オプチニューリンが欠損した細胞転写因子の核移行元の細胞オプチニューリンが欠損した細胞 NF-kB 標的遺伝子の発現 TNF-a (h) 元の HeLa OPTN -/- が -H2 細胞欠損した細胞元の HeLa OPTN -/- が -H2 細胞欠損した細胞元の HeLa OPTN -/- が -H2 細胞欠損した細胞

41 オプチニューリンが欠損した細胞ではアポトーシス ( 細胞死 ) が亢進する Cell viability (%) Cell Cell viability (%) (%) Trypan blue-positive cells (%) Trypan blue-positive cells (%) (%) ssdna ( A405) ssdna ( ( A405) オプチニュー生存細胞数解析カスパーゼ活性化リンが欠損元の細胞 HeLa OPTN a d TNF- HeLa OPTN -/- -H2 した細胞 -/- -H TNF-a a d +CHX (h) TNF- HeLa OPTN -/- -H2 (kda) CHX (h) TNF- HeLa OPTN -/- -H 元の細胞 (kda) 58 +CHX (h) +CHX (h) (kda) (kda) カスパーゼ IB: Caspase IB: 8 Caspase オプチニューリンが IB: Caspase 8 IB: Caspase 欠損した細胞活性型カスパーゼ TNF- 20 +CHX (h) TNF (h) CHX (h) b c IB: Caspase 3 30 TNF- +CHX (h) TNF- (h) CHX (h) IB: Caspase 30 TNF- +CHX * (h) TNF- (h) CHX (h) 死細胞数解析 * カスパーゼ b * 断片化 2.5 c DNA 量 17 * IB: Caspase 3 IB: Caspase * 2.0 IB: cleaved * IB: 活性型 cleaved caspase * * caspase 17 カスパーゼ3 1.5 * IB: IB: 80 cleaved cleaved オプチニューリン caspase caspase IB: OPTN *** * 46 IB: tubulin IB: PARP *** TNF- +CHX (h) TNF- +CHX (h) HeLa OPTN -/- -H2 HeLa OPTN -/- -H2 IB: IB: PARP PARP e 0 0 Lysate IP: caspase TNF- TNF- +CHX +CHX (h) 0 (h) TNF- +CHX (h) TNF- TNF- HeLa OPTN -/- -H HeLa OPTN -/- -/- -H2 元の元の OPTN が HeLa OPTN -/- -/- が -H e +CHX (h) +CHX (h) 0 3 6細胞細胞欠損した欠損した IB: RIP1 IB: RIP1 Lysate 細胞 IB: RIP1 IP: caspase 細胞 HeLa OPTN -/- -/- -H2 TNF- HeLa OPTN -/- -/- -H2 IB: FADD

42 本研究の分子細胞生物構造生物学的解析で明らかになったこと 1) オプチニューリンは UBAN ドメインの E478 で直鎖状ユビキチンに結合する 2) オプチニューリンの ALS 型変異体は NF-kB 活性抑制能を喪失しておりオプチニューリンが欠損した細胞では NF-kB 活性が亢進する 3) オプチニューリンが欠損した細胞では活性型カスパーゼ 3 8 が増加しておりアポトーシスが亢進する

43 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

44 オプチニューリンは細胞の生と死のシグナルを制御その破綻は ALS を発症させる正常型オプチニューリンの場合 TNFa ALS 型オプチニューリン変異の場合 TNFa TNF 受容体 TNF 受容体 HOIL-1L HOIP SHARPIN P IKKa NEMO P IKKb p50 P IkBa p65 NF-kB 活性抑制 RIP1 IKKa NEMO IKKb 複合体 I オプチニューリン複合体 II RIP1 FADD カスパーゼ 8 細胞死抑制 HOIL-1L HOIP SHARPI N P IKKa NEMO P IKKb p50 IkBa p65 NF-kB 異常活性化 P RIP1 IKKa NEMO IKKb 複合体 I オプチニューリン ALS 型変異体 p65 p65 p65 細胞質内封入体複合体 II RIP1 FADD カスパーゼ 8 細胞死亢進 ALS

45 OPTN 変異を伴う FALS 優性型 (E478G) 劣性型 (Q398X)

46 OPTN 変異を伴う FALS (E478G) にも TDP-43 陽性封入体が出現する優性型 (E478G) 劣性型 (Q398X) TDP-43 TDP-43 ptdp-43

47 OPTN-ALS 患者の運動ニューロン封入体には直鎖状ポリユビキチン鎖と活性型 NF-kB が共局在コントロール E478G 変異 Q398X 変異直鎖状ユビキチン活性型 NF-kB ( リン酸化 p65)

48 直鎖状ポリユビキチン鎖活性型 NF-kB は ALS 患者の TDP-43 凝集体と共局在する

49 OPTN-ALS 患者の運動ニューロンでは細胞死を司る酵素 ( カスパーゼ ) が活性化しているコントロール E478G 変異 Q398X 変異活性型カスパーゼ 3 活性型カスパーゼ 8

RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic

50 ALS の分子病態 Pathological condition Cell death 封入体形成 OPTN の封入体への取り込み NF-kB 異常活性化カスパーゼ活性化直鎖状ユビキチン鎖 OPTN 機能障害 Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:

51 本研究の神経病理学的解析で明らかになったこと 1) オプチニューリン変異 ALS 患者 3 例の運動ニューロンに出現する TDP-43 陽性封入体に直鎖状ユビキチン鎖と活性化 NF-κB が共存している 2) OPTN-ALS 患者の運動ニューロンでは細胞死を司るカスパーゼ 3 8 が活性化している 3) オプチニューリン機能障害による NF-κB の異常活性化とアポトーシスの亢進が ALS に共通の細胞死メカニズムである可能性がある

52 発表内容 ALS 克服のための基本戦略 ALSについてわかっていることとわからなかったことユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 ( 分子細胞生物構造生物学的解析 ) 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 発症における意義 ( 病理学的解析 ) 今後の展開

53 まとめと今後の展開 ALS 型オプチニューリン変異の場合新たな創薬標的の可能性 HOIL-1L HOIP SHARPIN LUBAC P P IKKa NEMO IKKb p50 NF-kB 異常活性化 P IkBa p65 IKKa NEMO IKKb RIP1 TNF 受容体複合体 I オプチニューリン ALS 型変異体 p65 p65 p65 細胞質凝集体複合体 II RIP1 FADD カスパーゼ 8 細胞死亢進孤発性 ALS や他の遺伝子変異に起因する家族性 ALS においても直鎖状ユビキチン鎖生成を介する NF-kB 活性亢進という同様の細胞応答が見られるか確認するアルツハイマー病パーキンソン病などユビキチン陽性凝集体形成を伴う神経変性疾患に関連するユビキチンの連結を詳細に解析し発症に至る細胞メカニズムを解析する ALS 治療薬開発を目的に LUBAC の活性阻害剤探索を行う ALS

54 ありがとうございました

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル 60 秒でわかるプレスリリース 2007 年 12 月 17 日独立行政法人理化学研究所免疫の要 NF-κB の活性化シグナルを増幅する機構を発見 - リン酸化酵素 IKK が正のフィーッドバックを担当 - 身体に病原菌などの異物 ( 抗原 ) が侵入すると誰にでも備わっている免疫システムが働いて異物を認識し排除するためにさまざまな反応を起こしますその一つに免疫細胞である B 細胞が