KASEAA 52(3) (2014)

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1 解説 ヒカリカモメガイ由来の 発光タンパク質 フォラシン 小さな発見に至るまでの長い道のり 久世雅樹 ヒ カ リ カ モ メ ガ イ の 発 光 器 に は 発 光 タ ン パ ク 質 フ ォ ラ シ ン があり 活性酸素種 ROS の刺激により青色に発光す る フ ォ ラ シ ン は ROS 検 出 キ ッ ト と し て 市 販 さ れ て い る に もかかわらず 発光に関与しているクロモフォア 発光を司 る化学構造 の構造は不明であった そのため フォラシン の遺伝子発現はすでに達成されていたが クロモフォアを構 り 陸上ではなかなか味わうことのできない生物との 近い距離感 を楽しむことができる 潜れる範囲は水 深 40 メートルまでの沿岸域と限られるが 色彩豊かな 生物を見ることができ 海洋生物の多様性を実感でき る 図 1の水中写真を見ていただくとフラッシュ光が届 成することができず発光させることは不可能であった 筆者 らはトビイカの発光基質であるデヒドロセレンテラジンが フォラシンの基質であることを突き止めた 本稿では ヒカ リカモメガイの科学研究における長い歴史の紹介と フォラ シンの基質を特定するに至った経緯について紹介する 海洋発光生物と発光タンパク質 最近 海に潜って水中生物の写真を撮ることを趣味に している 海中では 1 cm にも満たないエビの仲間から 大きなウツボやエイまでのさまざまな生物を間近で見る ことができ そっと近づけば写真を撮らせてくれる 水 中生物はわれわれダイバー 部外者 に対して寛容であ Pholasin, the Photoprotein from a Bioluminescent Mollusk : Long History to Find Its Organic Substance Masaki KUSE, 神戸大学大学院農学研究科 166 図 1 水深 20 m における水中写真 上部の矢印で示したアカマツカサの赤色はフラッシュ光が届いて 赤色に見えるが 下に矢印で示したように同じ魚でも離れるとフ ラッシュ光が海水によって吸収されてしまい灰色に写る

2 図 2 発光タンパク質における発光機構の概略図 アポタンパク質は発光基質と結合しクロモフォアを構成し発光タンパク質となる クロモフォアは活性酸素などの刺激により酸化され過酸 化物へと変化し これが分解するときに生じるエネルギーを光として放出する 発光後 クロモフォアは酸化物へと変化する く範囲は色鮮やかに写っているが 少し離れると色彩が 乏しく灰色の世界になることに気がつくであろう これ は海水が赤色の光をより吸収しやすいためである 青色 から黄色にかけての色合いは離れていてもよく見える この海水の性質が海洋発光生物の放つ光の色 波長 に 大きく関係している 光は波長をもった電磁波の一部であり 可視光とは 400 nm から 700 nm までの波長を指す 海水は 600 nm 以上の赤色の波長をよく吸収するので 生物は青色から 緑色に発光するほうが効率良くシグナルとして利用でき 図 3 ヒカリカモメガイの写真 ヒカリカモメガイ 左 の管状の器官 赤丸で囲んだ部分 の中に 発光器がある 管状の器官を切り開いた状態を赤丸で囲んである 中央 その中の発光器が発光している様子 右 るのであろう そのため海洋発光生物には青から緑色に 光るものが多い しかしながら なかには赤色に光る生 タンパク質には トビイカ由来のシンプレクチン sym- 物が実在しているのも事実である また 赤色の魚は水 4 plectin, ヒカリカモメガイ由来のフォラシン phola- 中では黒っぽく見えるので外敵から認識されにくい利点 sin がある 本稿ではこのフォラシンについての詳細 もある を紹介する 2008 年のノーベル化学賞受賞で有名になった緑色蛍 光タンパク質 GFP は緑色の蛍光を放つ 蛍光とは 基底状態にある分子がエネルギーを吸収して一重項励起 状態となり 過剰のエネルギーを光として放出して基底 ヒカリカモメガイ ヒカリカモメガイ はイギリス南西 状態に戻ることを指す GFP が蛍光を出すためには何 部の海岸に生息する二枚貝であり 岩に穴を掘って一生 らかのエネルギーの供給が必要であり この役割を果た を過ごす おそらく餌を捕獲するためであると思われる しているのがイクオリン aequorin である イクオリ が 管状の器官の中が発光する 図 3 この器官の中 1 ンは発光タンパク質 photoprotein と呼ばれる 発 2,3 には発光器と呼ばれる光を発するための部位があり こ 光タンパク質とはホタルのルシフェラーゼ 酵素 の中に発光タンパク質 フォラシン が存在している と区別するための用語である ルシフェラーゼは基質で 沿岸部の護岸工事による生息地の縮小 そして食用や夜 あるルシフェリンの酸化反応を触媒し 光を放つ この 釣りの餌用とするための乱獲により 近年その生息数は 反応はルシフェリン ルシフェラーゼ反応 L L 反応 減少している と呼ばれ 酵素反応であるので放たれる光の量 発光 量 は基質のモル数に依存する 一方 発光タンパク質 は その分子構造中にクロモフォア 発光を司る化学構 造 があり これが分解することで発光する 図 2 ヒカリカモメガイに関する記述の歴史 生物発光研究の歴史については Harvey と Roda によ このため 発光量は発光タンパク質のモル数に依存す る優れた書籍 5, 6 がある ここではヒカリカモメガイの る 発光量がタンパク質の濃度に依存するか否かで発光 科学研究の歴史について焦点を絞って紹介する ヒカリ タンパク質とルシフェラーゼが区別できよう 蛍光を発 カモメガイに関する記述の始まりは古代ギリシャ時代に する蛍光タンパク質を含めると 3 種類の光るタンパク までさかのぼる Alistotle アリストテレス 紀元前 質が存在していることになる イクオリンのほかの発光 年 は海洋生物が発光し その光は熱を発し 167

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5 フォラシンとデヒドロセレンテラジン DCL を参考にして フォラシンをアセトンで処理してみた が アセトン付加体は単離できなかった フォラシンの 筆者らは フォラシンのクロモフォアはトビイカと同 クロモフォアもシンプレクチン同様にシステイン残基に 様に DCL で構成されているのではないかと推定した 結合しているのであれば 過剰のチオール化合物 ジチ そこで 市販のフォラシンに DCL を加えて光らせてみ オスレイトール DTT で処理すればクロモフォアを た その結果 DCL の添加によりフォラシンの発光は DTT 付加体へと変換できるのではないかと考えた 図 7 著しく強くなることを見いだした 17 図 6 シンプレクチンのクロモフォアは DCL と平衡の状態に しかしながら DCL が本当の基質ではないが偶然基 あり シンプレクチンの状態ではクロモフォアとして安 質として働いている可能性も残っていたので 実際に 定であるが タンパク質の構造を破壊するとすぐに DCL をフォラシンから抽出して証明する必要があった DCL を放出する この性質により シンプレクチンの まず トビイカから単離されたアセトン付加体の抽出法 活性部位の特定の際には苦労させられたが 平衡反応を 逆に利用することがフォラシンから DCL を抽出する際 には都合が良いことになった 市販のフォラシンをメタノールに懸濁させ 過剰の DTT を加え撹拌した その後上澄みを集めると蛍光を 示す化合物の抽出に成功した 図 7 抽出量はごく微 量であったため 別途化学合成した標品と比較しながら 磯部らの手法 18, 19 を用いて質量分析した その結果 フォラシンから抽出された蛍光物質は間違いなく DCL の DTT 付加体であることが証明できた 20 DCL の添 加によりフォラシンの発光強度が増加すること DCL の DTT 付加体がフォラシンから抽出できたこと そし 図 6 フォラシンの発光プロファイル 横軸は経過時間 秒 で 縦軸は光の強さを表している 市販の フォラシンンは青色で示した発光パターンを示す これに DCL を 加えて発光させると ピンク色で示すように発光強度が増加する て DCL を添加したフォラシンの発光スペクトルがヒカ リカモメガイの発光スペクトルと一致したことから フォラシンのクロモフォアは DCL を基質として形成さ れていると結論づけることができた 1887 年における 図 7 フォラシンのクロモフォアを DTT 付加体へと変換するスキーム フ ォ ラ シ ン の ク ロ モ フ ォ ア 左 上 は DCL 右上 と平衡の関係にあり クロモフォアの状態が安定である 過剰の DTT で処理すると この平衡 は DTT 付 加 体 右 下 へ 移 動 し DTT 付加体の抽出が可能になる そ の結果 蛍光物質として有機溶媒で 抽出できるのである 左下 クロモ フォアはフォラシン中では安定であ るうえにシステインと結合している ため 直接有機溶媒で抽出すること はできない そのため 長年その化 学構造が不明であった 170

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