Molecular Mechanism of Acetate Ester Syntehsis by Alcohol Acetyltransferase Toshio FUJII (Central Laboratories for Key Technology, Kirin Brewery Co.,

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1 Molecular Mechanism of Acetate Ester Syntehsis by Alcohol Acetyltransferase Toshio FUJII (Central Laboratories for Key Technology, Kirin Brewery Co., Ltd.)

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3 (a) (b) 第3図 ATF1, (a)エ Lg-ATF1遺 ATF1 Lg-ATF1 伝 子 の 染 色 体 上 上の 位 置 の 解 析 チ ジ ウ ム プ ロ マ イ ド染 色,(b)ATF1,Lg-ATF1遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と し た サ ザ ン ハ イ ブ リグ イ ゼ ー シ ョ ン 1. S. cerevisiae YPH ー ル 酵 母KBY 母KBY 下 面 ビ ー ル 酵 母,S. carlsbergensisは cerevisiae型 bayanus,あ 149,,4.下 2. S. cerevisiae A,3.下 面 ビ ー ル 酵 母KBY 010, 面 ビ 5.下 面 ビ ール 酵 003 が 非 常 に 複 雑 で あ り,S. 体 の 他 に,S. 001 る い はS. そ の 染 色 体 構成 第2表 イ ソア ミノ レア ル コ ー ル お よ び エ タ ノ ー ル を 墓 質 と し た と き のAATase活 の構 造 を 持 つ 染 色 monascensisと 性 静 置,24時 間培養 い う 酵 母 に 類 似 の 構 造 の 染 色 体 を も持 つ こ と が 知 られ て い る7 9) Lg-ATF1遺 伝 子 は,こ はS. い う酵 母 に 類 似 の 構 造 の 染 色 体 由 monascensisと 来 で あ る と 考 え ら れ る 第3図 泳 動(CHEF)を のS. bayanus,あ るい は パ ル ス フ ィ ー ル ド電 気 用 い て 実 験 酵 母お よび 下 面 ビー ル酵 母 に お い てATF1, Lg-ATF1遺 伝 子 が 存在 す る 染 色体 を 調 べ た も の で あ る 実 験 酵 母 で はATF1遺 伝 子 は15 生 か す た め,実 験酵母を用いて酵母 の エ ス テ ル生成 と 番 染 色 体 に 存 在 し,下 面 ビ ー ル酵 母 で もそ れ とほ ぼ 同 じ AATaseの 大 き さ(1,100kb)の 染 色 体 に 存 在 して お り,さ こ れ ま で 知 ら れ て い た こ と と 異 な る 点 が い くつ か 明 ら か 1,000kbの 遺 伝 子 は15番 kb)の ら に, 染 色 体 に も 存 在 し て い た 一 方,Lg-ATF1 に な って き た の で あ る 染 色 体 と ば 明 らか に 異 な る 大 き さ( 染 色 体 に 存 在 す る こ と が 示 さ れ た(第3図b) そ れ で は,ATF1遺 伝 子 とLg-ATF1遺 伝 子 の機 能 は 遺 伝 子 をS. cerevisiaeで 発 現 さ せ,エ ステル 生成等 を 検 討 し た そ の 結 果,Lg-ATF1遺 伝 子 はATF1遺 子 と 同 じ よ う に 酢 酸 イ ソ ア ミ ル,酢 酸 エ チ ル双 方 の生 成 に 関 与 し て お り,ま た,振 盪 培 養 で 活 性 が 減 少 す る 等, 々 は 以 後 の 解 析 をATF1遺 ぼ っ て 行 う こ と と し た ま た,遺 914 伝 伝 子 と 同 等 の 機 能 を 持 つ も の で あ る と考 え ら れ た5) そ こ で,我 AATaseは1種 伝子 に し 伝 子 操 作 の メ リ ッ トを 類 で は な い 酵 母 の エ ス テ ム 生 成 とATF1遺 か に す る た め に,ま 同 じ な の だ ろ うか 我 々 は ク ロ ー ニ ン グ したLg-ATF1 ATF1遺 活 性 を 解 析 し て み る こ と と した そ の 結 果, 作 製 し,こ が,予 の 酵 母 のAATase活 想 に 反 しATF1欠 失 す る 以 前 の 約1/5か 伝 子 と の関 係 を 明 ら ず,ATF1遺 伝 子 を持 たな い酵 母 を 性 を 検 討 した1 ) と こ ろ 失 酵 母 のAATase活 ら1/10に 完 全 に は な く な ら な か っ た さ ら に,エ と し たAATase活 性 測 定 で は(通 コ ー ル を 基 質 と して い る)80%以 性 は,欠 下 が っ て い る も の の, タ ノ ー ルを 基 質 常 は イ ソ ア ミル ア ル 上 の 活 性 が 残 存 して い る こ と が 判 明 し た(第2表) 醸 協 (1995)

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5 (A) 第6図 (B) イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル(A)お stand よ び エ タ ノ ー ル(B)を 基 質 と し た と き のAATase活 性 123 shake 123 mrna ATF7 第7図 静 置 お よび 振 盪 培 養 時 のAATaseお よ びATF1 mrnaの 変化 第8図 1,静 プ ロモ ー タ ー を 変 え た 場 合 のATF1 遺伝 上 子の 発 現 とAATase活 置培 養12時 間,2.静 置培 養9時 3時 間, 3.静 こ るAATase活 活 性 の 減 少 はATF1遺 伝 子 の発 現 レベ ル が 関 係 して い るの で は な い か と 考 え,ノ mrna量 ーザ ン 解 析 に よ りATF1 を測 定 した(第7図) そ の 結 果,予 想 どお り 置 培 養9時 間+1mMリ 性 の減 少 は,酵 通 常 の 静 置 培 養時 に比 べATF1 が 減 少 して 性 の増 減 と非 常 に よ く関 連 して い る こ とが 判 明 した(第7図) 第1図 に示 した よ うに,こ れ ま では 試 験 管 内 でAAT- 構成 的 に 発 現す る プ ロモ ー タ ーに 変 え て み た そ の結 果,GAPプ ロ モ ー タ-でATF1遺 伝 子 を発 現 させ た 株 は,通 気や 不 飽 和 脂 肪 酸 条 件 下 で もAATase活 ど見 られ な くな った(第8図) 性 の 減 少 が ほ とん こ の結 果 は,酵 母細 胞 内 aseが 不 飽 和 脂 肪 酸 に よ り阻 害 され る こ とか ら,通 気 レ に お い て はATF1遺 ベ ル を あ げ た り,不 飽 和 脂 肪 酸 を加 え た りす る とき に 起 飽 和 脂 肪酸 条件 下 にお け るAATase活 916 の減少 と 性 の減 少 に中 心 的 役割 を 果 たす か を 検 討す る ためATF1 遺 伝 子 の プ ロモ ー タ ーをmRNAが mrna量 間 素 の阻 害 が 主 因 であ る と説 明 され て い た2,3) そ こで 我 々 はmRNA量 GAPの 増 減 がAATase活 盪培 養 ノ ール 酸3時 酵 素 の阻 害 の ど ち らが 酵 母細 胞 内 にお いてAATase活 振 盪 培 養 時 や,培 地 中 に不 飽 和 脂 肪 酸 を添 加 した場 合 は い る こ と,ま た,mRNAの 性 間+振 伝 子 のmRNAの 減 少が 通 気,不 性 の 減 少 の主 因 醸 協 (1995)

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7 (1994) 7) M. B. PEDERSEN: Carlsberg Res. Commun., 180, 263 (1985) 8) S. HOLMBERG: Carlsberg Res. Commun., 47, 233 (1982) 9) J. HANSEN and M. C. KILLAND-BRANDT: Gene, 140, 33 (1994) 11) P. MALCORPS and J. P. DUFOUR: Eur. J. Biochem., 210, 1015 (1992) 13) V. M. MCDONOUGH, J. E. STUKEY and C. E. MARTIN: J. Biol. Chem., 267, 5931 (1992) 14) M. F. HENRY and J. E. CRONAN Jr.: Cell, 70, 671 (1992) 1) K. NORDSTROM: J. Inst. Brew., 67, 173 (1961) 2) K. YOSHIOKA and H. HASHIMOTO: Agri. Biol. Chem., 45, 2187 (1981) 3) K. YOSHIOKA and H. HASHIMOTO: Agri. Biol. Chem., 47, 2287 (1983) 4) T. MINETOKI, T. BOGAKI, A. IWAMATSU, T. FUJII and M. HAMACHI: Biosci. Biotech. Biochem., 57, 2094 (1993) 5) T. FUJII, N. NAGASAWA, A. IWAMATSU, T. BOGAKI, Y. TAMAI and M. HAMACHI: Appl. Environ. Microbiol., 60, 2786 (1994) 6) M. KISHIMOTO: J. Ferment. Bioeng., 77, ) H. M. C. S. KUMARA, N. FUKUI, K. KOJI MA and K. NAKATANI: Technical Quarterly, 32, 159 (1995)

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