期 张 晓 君 等 : 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 死 亡 情 况, 以 复 制 出 同 自 然 病 例 一 样 的 感 染 症, 并 能 重 新 分 离 回 收 到 原 感 染 菌 作 为 相 应 病 原 菌 的 判 定 指 标. 形 态 与 菌

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1 第 卷 第 期 水 生 生 物 学 报.,. 年 月., 号 :. /.... 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 张 晓 君 陈 翠 珍 阎 斌 伦 房 海 秦 国 民 徐 静 (. 淮 海 工 学 院 海 洋 学 院, 江 苏 省 海 洋 生 物 技 术 重 点 实 验 室, 连 云 港 ;. 河 北 科 技 师 范 学 院 动 物 科 学 系, 秦 皇 岛 ) 摘 要 : 对 引 起 红 鳍 东 方 鲀 发 病 死 亡 的 病 原 细 菌 进 行 了 分 离 和 主 要 生 物 学 特 性 研 究, 包 括 病 原 性 形 态 特 征 理 化 特 性 基 因 序 列 及 其 系 统 发 育 学 分 析 胞 外 酶 及 溶 血 素 活 性 抗 原 及 耐 药 性 等 结 果 表 明, 引 起 红 鳍 东 方 鲀 发 病 死 亡 的 病 原 细 菌 为 弧 菌 属 ( ) 的 鱼 肠 道 弧 菌 (.,. ), 株 代 表 菌 株 基 因 序 列 ( 登 录 号 分 别 为 : 和 ) 与 数 据 库 中 鱼 肠 道 弧 菌 的 同 源 性 在 % %, 且 在 构 建 的 系 统 发 生 树 中 与 鱼 肠 道 弧 菌 聚 为 一 个 分 支 分 离 菌 不 具 有 淀 粉 酶 蛋 白 酶 脂 肪 酶 酶 脲 酶 明 胶 酶 和 卵 磷 脂 酶 活 性, 且 在 含 % 家 兔 脱 纤 血 液 营 养 琼 脂 培 养 基 上 不 溶 血 不 具 有 抗 原 人 工 感 染 试 验 中 分 离 菌 对 红 鳍 东 方 鲀 表 现 出 明 显 的 致 病 性 药 敏 试 验 结 果 显 示, 株 分 离 菌 对 供 试 种 抗 菌 药 物 中 的 苯 唑 青 霉 素 和 杆 菌 肽 种 耐 药 关 键 词 : 鱼 肠 道 弧 菌 ; 生 物 学 特 性 ; 系 统 发 育 学 中 图 分 类 号 :. 文 献 标 识 码 : 文 章 编 号 : - ( ) - - 鱼 肠 道 弧 菌 (,. ) 是 于 年 由,. 首 次 报 道, 并 将 其 作 为 一 个 新 种 弧 菌 命 名 自 年 以 来, 在 日 本 孵 化 场 养 殖 的 牙 鲆 发 生 肠 不 透 明 及 肠 坏 死 并 伴 随 高 死 亡 率,,. [ ] 经 对 分 离 自 幼 牙 鲆 的 株 分 离 菌 的 检 验 结 果, 表 明 其 病 原 为 一 种 新 的 病 原 弧 菌 并 命 名 为 鱼 肠 道 弧 菌 此 后,,. [ ] [ ] 与 陈 翠 珍 等 均 报 道 过 从 患 病 牙 鲆 体 内 分 离 到 该 菌 年 月, 作 者 对 河 北 省 昌 黎 一 海 水 养 殖 场 养 殖 红 鳍 东 方 鲀 (.) 发 生 的 疾 病 进 行 了 检 验, 所 检 尾 ( 其 中 濒 死 的 尾 和 刚 刚 死 亡 的 尾 ) 病 死 鱼 表 现 为 体 表 腹 部 充 血, 各 鳍 均 有 不 同 程 度 的 出 血 ( 尤 以 腹 鳍 和 尾 鳍 明 显 ), 部 分 病 鱼 腹 鳍 和 尾 鳍 溃 烂 且 部 分 断 掉 ; 剖 检 见 肝 脏 不 同 程 度 肿 胀 充 血 或 有 出 血, 肠 壁 出 血, 肠 黏 膜 充 血 或 有 出 血 以 其 鳍 溃 烂 组 织 和 肝 脏 组 织 为 材 料 做 细 菌 学 检 验, 结 果 检 出 了 鱼 肠 道 弧 菌 ( ) 和 杀 对 虾 弧 菌 ( ) 两 种 病 原 菌 本 文 报 道 了 所 检 株 鱼 肠 道 弧 菌 的 病 原 性 形 态 特 征 主 要 理 化 性 状 及 系 统 发 育 学 胞 外 酶 及 溶 血 素 活 性 抗 原 及 血 清 同 源 性 与 药 物 敏 感 性 等 方 面 的 研 究 结 果, 旨 在 能 为 对 该 菌 的 有 效 检 验 及 进 一 步 研 究 等 提 供 一 定 的 参 考 材 料 与 方 法. 细 菌 分 离 以 病 死 红 鳍 东 方 鲀 的 鳍 溃 烂 组 织 及 肝 组 织 为 材 料, 先 经 抹 片 后 革 兰 氏 染 色 镜 检 细 菌 ; 镜 检 到 细 菌 后 再 取 新 鲜 鳍 溃 烂 组 织 及 肝 组 织 用 普 通 营 养 琼 脂 培 养 基 做 划 线 接 种 分 离 培 养 ( 培 养 检 查 ) 细 菌, 取 分 离 菌 移 接 于 普 通 营 养 琼 脂 斜 面 ( 培 养 ) 做 纯 培 养 供 检 验 用, 其 编 号 为 : - ( 分 离 自 鳍 溃 烂 组 织 ) - ( 分 离 自 肝 组 织 ) - ( 分 离 自 鳍 溃 烂 组 织 ) - ( 分 离 自 肝 组 织 ), 置 普 通 冰 箱 中 保 存 供 检 验 用. 致 病 性 试 验 将 供 试 代 表 菌 株 - 接 种 于 普 通 营 养 琼 脂 斜 面 培 养, 以 无 菌 生 理 盐 水 洗 下 并 调 成 / 菌 液, 经 腹 腔 接 种 健 康 红 鳍 东 方 鲀, 每 尾 接 种. 共 尾 ; 同 时 设 立 同 剂 量 同 批 无 菌 生 理 盐 水 接 种 的 对 照 ; 均 隔 离 养 殖 于 试 验 水 族 箱 中, 每 天 观 察 其 感 染 后 的 发 病 与 收 稿 日 期 : - - ; 修 订 日 期 : - - 基 金 项 目 : 江 苏 省 自 然 科 学 基 金 项 目 ( ); 连 云 港 市 科 技 攻 关 项 目 ( ); 淮 海 工 学 院 引 进 人 才 科 研 启 动 基 金 资 助 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 张 晓 君 ( ), 女, 河 北 秦 皇 岛 人 ; 博 士, 教 授 ; 主 要 从 事 水 产 动 物 病 害 及 病 原 微 生 物 学 研 究 - 通 讯 作 者 : 阎 斌 伦, -

2 期 张 晓 君 等 : 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 死 亡 情 况, 以 复 制 出 同 自 然 病 例 一 样 的 感 染 症, 并 能 重 新 分 离 回 收 到 原 感 染 菌 作 为 相 应 病 原 菌 的 判 定 指 标. 形 态 与 菌 落 特 征 检 查 取 纯 培 养 菌 移 接 于 普 通 营 养 琼 脂 斜 面, 置 培 养 后 制 备 成 涂 片 标 本, 经 革 兰 氏 染 色 镜 检 细 菌 形 态 ; 各 菌 株 分 别 划 线 接 种 于 普 通 营 养 琼 脂 血 液 营 养 琼 脂 ( 含 % 家 兔 脱 纤 血 的 普 通 营 养 琼 脂 ) 庆 大 霉 素 琼 脂 硫 代 硫 酸 钠 柠 檬 酸 钠 胆 酸 钠 蔗 糖 琼 脂 () 等 不 同 培 养 基 平 板, 置 及 培 养 和, 分 别 检 查 生 长 情 况 及 菌 落 特 征 同 时, 分 别 接 种 于 普 通 营 养 肉 汤 ( 管 ) 中, 置 培 养, 检 查 液 体 培 养 的 生 长 表 现. 理 化 特 性 检 查 取 纯 培 养 菌, 分 别 接 种 于 细 菌 理 化 特 性 鉴 定 用 培 养 基 中, 按 常 规 进 行 氧 化 酶 接 触 酶 糖 ( 醇 及 苷 ) 类 代 谢 吲 哚 - 试 验 硝 酸 盐 还 原 试 验 枸 橼 酸 盐 利 用 (- ) 等 较 系 统 的 理 化 特 性 测 定, 主 要 参 照 常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册 [ ] 及 人 及 动 物 病 原 细 菌 学 [ ] 进 行. 基 因 序 列 测 定 与 系 统 发 育 学 分 析.. 模 板 的 制 备 择 代 表 菌 株 - 及 - 接 种 于 肉 汤 中 培 养, 按 小 量 细 菌 基 因 组 抽 提 试 剂 盒 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 产, 批 号 ) 所 述 方 法 提 取 作 为 模 板.. 基 因 序 列 的 扩 增 与 测 序 基 因 扩 增 的 两 个 引 物 分 别 为 ( 正 向 引 物 ): -(/)- - ( 对 应 于. 基 因 的 第 个 碱 基 位 置 ) ( 反 向 引 物 ): -- - ( 对 应 于. 基 因 的 第 个 碱 基 位 置 ) [ ] 在 μ 反 应 体 系 中 含 有 : 无 菌 蒸 馏 水. μ 缓 冲 液 μ. /. μ 混 合 物. μ 引 物 各. μ. /μ 的 聚 合 酶. μ 模 板 μ 反 应 条 件 为 : 预 变 性 变 性 复 性 延 伸, 个 循 环 后 温 育 扩 增 产 物 经 纯 化 系 统 (, ) 纯 化 后, 由 上 海 生 物 工 程 技 术 公 司 进 行 基 因 序 列 测 定.. 基 因 序 列 系 统 发 育 树 构 建 对 供 试 菌 株 的 基 因 序 列 通 过 的 检 索 系 统 (://...//) 进 行 序 列 同 源 性 分 析, 并 使 用. 软 件 与 从 数 据 库 中 获 得 的 序 列 相 似 性 较 高 的 菌 株 的 序 列 进 行 多 序 列 匹 配 排 列 ( ), 使 用 (, ) 及. 软 件, 采 用 最 大 简 约 法 (-, ) 建 树 方 法, 构 建 系 统 发 生 树, 并 通 过 法 ( 次 重 复 ) 检 验. 菌 种 分 类 位 置 确 定 根 据 细 菌 形 态 培 养 及 理 化 特 性 测 定 的 结 果, 主 要 依 据 ' [ ] ' - [ ] : [ ] 及 有 关 资 料, 并 结 合 细 菌 发 育 学 分 析 的 结 果, 进 行 分 离 菌 的 种 属 分 类 位 置 判 定. 胞 外 酶 活 性 及 溶 血 活 性 检 测 分 离 菌 的 胞 外 蛋 白 酶 活 性 卵 磷 脂 酶 活 性 脂 酶 活 性 淀 粉 酶 活 性 尿 素 酶 活 性 和 酶 活 性 采 用 平 板 检 验 方 法, 明 胶 酶 活 性 采 用 试 管 液 化 方 法 将 处 于 对 数 生 长 期 的 株 供 试 菌 分 别 点 种 于 含 有 脱 脂 牛 奶 ( %) 蛋 黄 液 ( %) 吐 温 (. %) 淀 粉 ( %) 尿 素 (. %, 含 酚 红 指 示 剂 ) 和 (. %) 的 平 板 中, 将 供 试 菌 穿 刺 接 种 于 含 明 胶 ( %) 的 培 养 基 试 管, 于 恒 温 培 养 适 当 时 间 后 观 察 含 脱 脂 牛 奶 蛋 黄 液 吐 温 及 的 平 板 可 以 直 接 观 察 水 解 圈 ; 含 尿 素 的 平 板 观 察 菌 苔 是 否 变 红 色 ; 含 淀 粉 的 平 板 则 在 观 察 之 前 需 要 分 别 加 入 显 色 剂 碘 液 透 明 的 水 解 圈 区 域 显 示 有 酶 活 含 明 胶 的 培 养 基 试 管 于 恒 温 培 养 后, 置 于 冰 箱 中 过 夜 后 观 察 分 离 菌 的 溶 血 活 性 采 用 将 菌 株 接 种 至 血 液 琼 脂 ( 含 % 家 兔 脱 纤 血 的 营 养 琼 脂 ) 培 养 基 平 板 的 方 法, 将 接 种 后 的 血 液 琼 脂 培 养 基 平 板 置 恒 温 培 养 箱 中 培 养 适 当 时 间 后 观 察 菌 株 周 围 是 否 出 现 溶 血 圈 若 出 现 溶 血 圈 则 为 阳 性, 表 明 该 菌 能 分 泌 溶 血 毒 素. 抗 原 及 血 清 同 源 性 检 测 选 取 代 表 菌 株 - 接 种 于 适 宜 发 育 的 液 体 培 养 基 中 经 培 养 扩 繁 后, 分 别 制 备 成 福 尔 马 林 灭 活 的 全 菌 () 抗 原 及 经 热 处 理 ( 作 用 ) 的 菌 体 () 抗 原,

3 水 生 生 物 学 报 卷 经 分 别 强 化 免 疫 接 种 家 兔 制 备 相 应 抗 血 清.. 抗 原 的 检 测 取 分 离 菌 分 别 移 接 于 普 通 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 作 为 玻 板 凝 集 原, 分 别 与 代 表 菌 株 - 所 制 备 的 抗 血 清 做 玻 板 凝 集 反 应 ( 直 接 取 菌 少 许 与 小 滴 约. 血 清 混 匀 ), 若 与 相 应 抗 血 清 均 呈 基 本 一 致 凝 集 强 度 的 明 显 凝 集 (++), 则 判 定 为 无 明 显 凝 集 抑 制 性 抗 原 的 存 在 ( 混 匀 后 即 刻 出 现 明 显 凝 集 并 于 内 判 定 结 果 ); 若 仅 与 抗 血 清 明 显 凝 集 与 抗 血 清 不 凝 或 仅 轻 微 不 明 显 凝 集, 则 判 为 存 在 凝 集 抑 制 性 抗 原 ( 出 现 接 近 于 + 的 现 象 说 明 存 在 抗 原 但 可 能 在 有 的 菌 体 表 达 不 良 ); 同 时 以 无 菌 生 理 盐 水 代 替 抗 血 清 作 为 对 照, 需 不 出 现 凝 集 ( 菌 株 不 自 凝 ).. 血 清 同 源 性 的 检 定 取 上 述 株 供 试 纯 培 养 菌, 分 别 移 接 于 普 通 营 养 肉 汤 管 ( / 管 ) 置 振 荡 培 养 后, 每 个 菌 株 等 分 / 管 的 各 份, 其 中 份 直 接 作 为 试 管 凝 集 原, 另 份 经 处 理 作 为 试 管 凝 集 原, 分 别 与 上 述 用 - 菌 株 制 备 的 及 抗 血 清 做 相 应 及 [ ] 交 叉 的 试 管 凝 集 试 验 方 法 是 将 抗 血 清 用 含. % 石 炭 酸 的 无 菌 生 理 盐 水 做 倍 ( 第 管 ) 至 倍 ( 第 管 ) 的 倍 比 稀 释 ( 即 至 ). / 管, 然 后 分 别 用 前 述 凝 集 原 ( 等 量 加 入 并 混 匀 其 总 量 为. / 管 ) 做 相 应 及 交 叉 的 试 管 凝 集 反 应, 同 时 设 立 以 无 血 清 的 对 照 管, 具 体 为 混 匀 后 置 室 温 下 经 左 右 判 定 结 果, 以 仍 能 呈 现 明 显 凝 集 (++) 的 抗 血 清 最 高 稀 释 倍 数 作 为 相 应 抗 血 清 的 凝 集 效 价, 并 以 各 供 试 菌 株 与 制 备 抗 血 清 用 的 代 表 菌 株 间 进 行 比 较 后 的 凝 集 效 价 相 同 或 仅 差 个 滴 度 的 判 为 同 血 清 型 菌 株 ( 血 清 同 源 ). 药 物 敏 感 性 测 定 经 鉴 定 后 的 菌 株, 用 常 规 琼 脂 扩 散 (-) 法 进 行 对 常 用 抗 菌 类 药 物 的 敏 感 性 测 定, 以 是 否 出 现 抑 菌 圈 及 抑 菌 圈 直 径 大 小 作 为 敏 感 [ ] 与 耐 药 的 判 定 指 标 结 果. 病 变 组 织 中 的 细 菌 与 细 菌 分 离 以 所 检 尾 红 鳍 东 方 鲀 鳍 溃 烂 组 织 肝 组 织 为 材 料, 直 接 做 抹 片 后 经 革 兰 氏 染 色 镜 检, 结 果 均 有 不 同 量 但 均 较 多 形 态 特 征 一 致 的 细 菌 具 体 为 : 革 兰 氏 染 色 阴 性, 杆 状 ( 菌 体 稍 弯 曲 ), 两 端 钝 圆, 散 在 ( 有 的 成 双 ), 无 芽 孢, 大 小 多 在 (.. )μ (.. )μ 以 鳍 溃 烂 组 织 及 肝 组 织 进 行 细 菌 分 离 培 养, 结 果 均 分 离 到 两 种 优 势 生 长 的 细 菌, 菌 落 特 征 : 其 中 一 种 ( 记 作 菌 ) 为 圆 形 光 滑 边 缘 整 齐 稍 隆 起 透 明 至 半 透 明 浅 灰 白 色, 检 查 直 径 多 在.. 左 右 多 在. 左 右, 生 长 良 好 ; 另 一 种 ( 记 作 菌 ) 为 圆 形 光 滑 边 缘 整 齐 稍 隆 起 半 透 明 至 不 透 明 灰 白 色, 检 查 直 径 多 在.. 多 在., 生 长 良 好 ; 在 菌 落 分 布 上, 菌 多 于 菌 从 种 分 离 菌 ( 和 菌 ) 各 取 个 菌 落 ( 菌 各 个 ) 做 纯 培 养 共 株, 其 中 株 菌 即 本 次 所 报 道 的 鱼 肠 道 弧 菌. 分 离 菌 的 致 病 性 代 表 菌 株 - 腹 腔 注 射 感 染 健 康 红 鳍 东 方 鲀 后, 感 染 后 陆 续 死 亡 并 出 现 明 显 的 肝 脏 肿 胀 充 血 或 有 出 血 等 病 变 对 照 的 红 鳍 东 方 鲀 在 观 察 期 内 均 正 常, 并 且 未 分 离 到 细 菌 ; 取 感 染 死 亡 鱼 进 行 细 菌 学 检 验, 结 果 均 检 验 并 分 离 到 大 量 纯 一 的 原 感 染 菌 的 菌 落. 形 态 特 征 与 培 养 特 性 分 离 自 红 鳍 东 方 鲀 肝 脏 及 鳍 溃 烂 组 织 的 株 纯 培 养 菌 ( 菌 ) 的 形 态 特 征 表 现 一 致, 均 为 革 兰 氏 染 色 阴 性 杆 状 ( 有 的 稍 弯 曲 ) 一 端 或 两 端 钝 圆 ( 有 的 一 端 或 两 端 稍 尖 些 ) 无 芽 孢 散 在, 大 小 多 在 (.. )μ (.. )μ 株 纯 培 养 菌 均 在 条 件 下 生 长, 菌 苔 呈 半 透 明 至 不 透 明 状 的 灰 白 色, 生 长 中 度, 在 不 生 长 在 所 试 培 养 基 上 的 生 长 情 况 ( 培 养 ) 表 现 一 致 在 普 通 营 养 琼 脂 培 养 基 上, 菌 落 特 征 与 生 长 情 况 与 从 病 料 中 直 接 分 离 的 相 一 致 ; 在 血 液 营 养 琼 脂 ( 含 % 家 兔 脱 纤 血 的 营 养 琼 脂 ) 培 养 基 上, 菌 落 圆 形 光 滑 边 缘 整 齐 稍 隆 起 浅 乳 白 色 不 溶 血 湿 润 闪 光, 培 养 直 径 多 在. 左 右 多 在. 左 右, 生 长 良 好 ; 在 庆 大 霉 素 琼 脂 培 养 基 上, 培 养 未 见 生 长 ; 在 普 通 营 养 肉 汤 培 养 基 ( 管 ) 中, 株 供 试 菌 生 长 表 现 一 致, 均 为 轻 度 均 匀 混 浊 生 长, 管 底 形 成 圆 点 状 菌 体 沉 淀 ( 摇 动 后 呈 线 状 上 升 易 消 散 ). 理 化 性 状 株 分 离 菌 所 测 主 要 理 化 性 状 的 反 应 结 果 一 致 ( 表 )

4 期 张 晓 君 等 : 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 表 分 离 菌 的 理 化 特 性. 特 性 鱼 肠 道 弧 菌. 分 离 菌 生 长 - - 氧 化 酶 + + 接 触 酶 + + 产 试 验 - 动 力 + + 枸 橼 酸 盐 利 用 - - 葡 萄 糖 : 产 酸, + + 葡 萄 糖 : 产 气, - 山 梨 醇 - 蜜 二 糖 - - 棉 子 糖 - - 菊 糖 - - 水 杨 苷 - - 吐 温 - - 硝 酸 盐 还 原 + + 半 乳 糖 - + 蔗 糖 + + 鼠 李 糖 肌 醇 - - 甲 基 红 + - 试 验 - - 阿 拉 伯 糖 - - 甘 露 醇 - - 吲 哚 - - 七 叶 苷 利 用 - 赤 藓 醇 - - 海 藻 糖 + + () - 阿 拉 伯 醇 - 乙 酰 胺 酶 - 糊 精 + + 卫 茅 醇 - - 甘 油 - - 麦 芽 糖 + + 丙 二 酸 盐 利 用 + 醋 酸 盐 利 用 - 木 糖 - - 木 糖 醇 - 苦 杏 仁 苷 - 松 三 糖 -

5 水 生 生 物 学 报 卷 续 表 特 性 鱼 肠 道 弧 菌. 分 离 菌 山 梨 糖 - 侧 金 盏 花 醇 - - 酒 石 酸 盐 利 用 - 黏 液 酸 利 用 - β- 半 乳 糖 苷 酶 - + α- 甲 基 -- 葡 糖 苷 α 乳 糖 - - 果 糖 + - 甘 露 糖 + - 纤 维 二 糖 - - 精 氨 酸 双 水 解 酶 - - 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶 - 中 生 长 : % - - : % + + % + + / : μ μ 注 : + 示 阳 性, - 示 阴 性, 示 文 中 未 记 述, 示 发 酵 型, 示 敏 感 ; 鱼 肠 道 弧 菌 的 结 果 来 自 : [ ] :+, ;-, ;, ;, ;, ;. : [ ]. 基 因 序 列 与 系 统 发 育 学 分 离 菌 ( - 及 - ) 所 扩 增 的 基 因 序 列 长 度 ( 不 包 括 引 物 结 合 区 ), - 株 为 ( 登 录 号 : ) - 株 为 ( 登 录 号 : ); 将 株 菌 的 基 因 序 列 在 上 通 过 进 行 同 源 性 检 索, 结 果 均 与 弧 菌 属 细 菌 的 基 因 序 列 自 然 聚 类 在 检 索 出 的 鱼 肠 道 弧 菌 序 列 中, - 及 - 株 与 它 们 的 同 源 性 在 % 至 % 选 取 了 其 中 相 似 性 较 高 的 部 分 菌 株 的 基 因 序 列, 并 以 嗜 水 气 单 胞 菌 ( 登 录 号 ) 作 为 外 围 菌 进 行 系 统 发 育 学 分 析, 构 建 了 系 统 发 育 树 ( 图 ), - 及 - 株 均 与 鱼 肠 道 弧 菌 聚 为 一 个 大 分 支, 且 自 举 值 为 %. 菌 种 判 定 株 供 试 菌 对 所 测 形 态 及 理 化 特 性 等 的 表 型 性 状 的 结 果 一 致, 属 于 同 种 细 菌 根 据 表 型 特 征 及 系 统 发 育 学 分 析 的 结 果, 判 定 为 弧 菌 属 ( ) 的 鱼 肠 道 弧 菌 ( ) 图 - 及 - 菌 株 基 因 序 列 系 统 发 育 树 ( 图 中 至 为 菌 株 在 的 登 录 号, 数 字 为 自 举 值 ). ( -, )

6 期 张 晓 君 等 : 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究. 胞 外 酶 活 性 及 溶 血 活 性 酶 活 性 实 验 结 果 表 明, 株 鱼 肠 道 弧 菌 均 无 淀 粉 酶 蛋 白 酶 脂 肪 酶 酶 和 卵 磷 脂 酶 脲 酶 及 明 胶 酶 活 性 ; 且 株 鱼 肠 道 弧 菌 在 含 % 家 兔 脱 纤 血 液 营 养 琼 脂 培 养 基 上 均 无 溶 血 现 象. 菌 株 抗 原 及 血 清 同 源 性 应 用 玻 板 凝 集 和 试 管 凝 集 反 应 对 供 试 株 鱼 肠 道 弧 菌 所 测 抗 原 及 血 清 同 源 性 结 果 见 表 表 四 株 分 离 菌 凝 集 反 应 结 果. 抗 血 清 ( - ) 玻 板 凝 集 原 试 管 凝 集 原 - 抗 血 清 - ++ ( ) ** ( ) - 抗 血 清 - ++ ( ) ( ) 生 理 盐 水 (< ) (< ) 注 :++, 明 显 凝 集 ;, 不 凝 集 ;**, 凝 集 效 价 :++, ;, ;**:. 从 表 可 以 看 出 株 鱼 肠 道 弧 菌 的 玻 板 凝 集 原 与 - 株 制 备 的 抗 血 清 均 明 显 凝 集 (++) 与 对 照 的 生 理 盐 水 均 不 凝 集 ( ) 仍 呈 均 匀 混 浊 态, 初 步 表 明 该 菌 不 存 在 凝 集 抑 制 性 抗 原 株 纯 培 养 菌 制 备 的 及 试 管 凝 集 原 与 - 株 制 备 的 抗 血 清 的 凝 集 效 价 在 凝 集 原 的 完 全 一 致, 均 为 ( 倍 ); 凝 集 原 的 完 全 一 致, 均 在 ( 倍 ), 比 相 应 凝 集 原 的 高 个 抗 体 滴 度 ; 凝 集 原 与 - 株 制 备 的 抗 血 清 的 凝 集 效 价, 在 凝 集 原 的 完 全 一 致, 均 为 ( 倍 ); 凝 集 原 的 完 全 一 致, 均 在 ( 倍 ), 比 相 应 凝 集 原 的 低 个 抗 体 滴 度, 进 一 步 表 明 了 该 菌 不 存 在 抗 原 使 用 全 菌 () 凝 集 原 与 抗 血 清 的 抗 体 效 价 与 使 用 热 处 理 () 凝 集 原 与 抗 血 清 的 抗 体 效 价 相 比 均 表 现 的 低, 其 原 因 可 能 是 经 热 处 理 ( 作 用 ) 后 的 菌 体 更 易 于 与 抗 体 结 合 之 故. 药 物 敏 感 性 测 定 株 分 离 菌 对 种 抗 菌 类 药 物 的 敏 感 性, 结 果 均 对 供 试 的 青 霉 素 头 孢 唑 啉 头 孢 拉 啶 头 孢 噻 肟 头 孢 曲 松 头 孢 他 啶 头 孢 哌 酮 头 孢 吡 肟 氨 曲 南 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 丁 胺 卡 那 霉 素 新 霉 素 诺 氟 沙 星 氧 氟 沙 星 环 丙 沙 星 氯 霉 素 呋 喃 妥 因 呋 喃 唑 酮 恩 诺 沙 星 克 林 霉 素 万 古 霉 素 新 生 霉 素 氨 苄 青 霉 素 阿 奇 霉 素 链 霉 素 多 黏 菌 素 卡 那 霉 素 大 观 霉 素 四 环 素 多 西 霉 素 复 方 新 诺 明 甲 氧 苄 氨 嘧 啶 利 福 平 红 霉 素 等 种 药 物 高 度 敏 感 ; 对 苯 唑 青 霉 素 和 杆 菌 肽 种 耐 药 讨 论 本 次 对 发 生 在 河 北 昌 黎 地 区 养 殖 红 鳍 东 方 鲀 大 量 死 亡 的 病 鱼 进 行 病 原 研 究, 通 过 对 病 鱼 溃 烂 组 织 及 肝 组 织 抹 片 标 本 经 染 色 后 镜 检 发 现 细 菌, 有 规 律 地 自 病 鱼 溃 烂 组 织 及 肝 组 织 中 分 离 到 优 势 生 长 的 细 菌, 并 经 鉴 定 表 明 为 同 种 细 菌, 对 健 康 红 鳍 东 方 鲀 进 行 人 工 感 染 试 验, 能 够 引 起 健 康 红 鳍 东 方 鲀 的 发 病 与 死 亡 并 能 重 新 分 离 回 收 到 原 感 染 菌, 表 明 所 检 出 并 经 鉴 定 的 鱼 肠 道 弧 菌 为 本 次 被 检 病 死 红 鳍 东 方 鲀 的 相 应 病 原 菌 本 文 首 次 报 道 了 鱼 肠 道 弧 菌 对 红 鳍 东 方 鲀 的 感 染, 进 一 步 表 明 了 该 菌 在 水 产 养 殖 动 物 中 的 广 泛 致 病 作 用 另 一 方 面, 通 过 本 次 对 鱼 肠 道 弧 菌 较 系 统 的 鉴 定, 进 一 步 丰 富 了 该 菌 在 形 态 与 培 养 特 性 理 化 特 性 及 基 因 序 列 与 系 统 发 育 学 方 面 的 内 容, 为 对 该 菌 的 有 效 检 验 提 供 了 可 参 考 的 资 料 弧 菌 的 致 病 性 取 决 于 弧 菌 与 宿 主 细 胞 间 的 相 互 作 用, 致 病 过 程 也 包 括 黏 附 侵 袭 体 内 增 殖 及 产 生 毒 素 等, 而 这 些 又 与 弧 菌 产 生 的 各 种 毒 力 因 子 有 关 目 前 已 发 现 的 弧 菌 毒 力 因 子 有 外 毒 素 ( ) 蛋 白 酶 ( ) 荚 膜 () 载 铁 体 ( ) 及 外 膜 蛋 白 (, ) 等, 如 鳗 弧 菌 ( ) [ ] 溶 藻 胶 弧 菌 (. ) 副 溶 血 弧 菌 (. ) [ ] 创 伤 弧 菌 (. ) [ ] [ ] 哈 维 氏 弧 菌 等 多 种 鱼 虾 类 病 原 弧 菌 均 可 产 生 具 有 强 烈 致 病 作 用 的 胞 外 蛋 白 酶 ; 溶 血 素 也 是 多 数 病 原 菌 的 重 要 致 病 因 子 之 一, 目 前 也 已

7 水 生 生 物 学 报 卷 在 鳗 弧 菌 副 溶 血 弧 菌 等 病 原 弧 菌 的 胞 外 产 物 中 检 测 到 而 本 次 通 过 对 分 离 鉴 定 的 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 胞 外 酶 及 溶 血 活 性 的 检 测, 表 明 株 供 试 菌 均 无 淀 粉 酶 蛋 白 酶 脂 肪 酶 酶 和 卵 磷 脂 酶 脲 酶 及 明 胶 酶 活 性, 且 均 在 含 % 家 兔 脱 纤 血 的 营 养 琼 脂 培 养 基 上 无 溶 血 现 象, 提 示 该 菌 的 致 病 机 理 可 能 与 其 他 毒 力 因 子 的 分 泌 及 该 菌 的 生 存 能 力 侵 袭 能 力 以 及 抗 宿 主 的 防 御 能 力 等 诸 方 面 相 关 细 菌 的 抗 原 成 分 在 病 原 细 菌 的 致 病 作 用 中 常 发 挥 着 重 要 作 用, 可 构 成 病 原 细 菌 的 重 要 毒 力 因 子, 主 要 表 现 在 抵 抗 机 体 免 疫 系 统 吞 噬 细 胞 的 吞 噬 作 用 对 机 体 细 胞 的 黏 附 发 挥 毒 力 作 用 利 于 细 菌 向 机 体 内 部 广 为 深 入 扩 散 的 侵 袭 作 用 等 方 面 本 次 经 用 株 供 试 菌 制 备 的 凝 集 原 与 用 代 表 菌 株 - 所 制 备 的 抗 血 清 做 对 应 及 交 叉 的 凝 集 抗 体 效 价 测 定, 表 明 株 供 试 菌 均 不 存 在 不 耐 热 的 抗 原, 且 为 同 种 血 清 型 ( 血 清 同 源 ), 这 一 结 果 在 对 该 菌 进 行 血 清 型 检 定 血 清 流 行 病 学 调 查 免 疫 血 清 学 检 验 及 致 病 机 理 研 究 方 面 具 有 一 定 的 指 导 意 义 本 次 经 以 种 抗 菌 类 药 物 对 株 鱼 肠 道 弧 菌 的 药 敏 测 定, 尚 未 发 现 不 同 菌 株 间 对 某 种 抗 菌 药 物 敏 感 或 耐 药 的 明 显 差 异 性, 供 试 株 菌 均 对 苯 唑 青 霉 素 和 杆 菌 肽 种 耐 药 ( 抑 菌 圈 直 径 为 ), 对 其 他 种 药 物 均 高 度 敏 感 ( 抑 菌 圈 直 径 在 ), 该 结 果 与 分 离 自 牙 鲆 的 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 药 物 敏 感 性 方 面 的 研 究 结 果 一 致, 初 步 显 示 该 菌 所 测 菌 株 在 对 供 试 抗 菌 类 药 物 中 所 表 现 出 的 一 致 性, 有 益 于 在 防 治 由 该 菌 引 起 的 水 产 动 物 疾 病 的 选 择 用 药 参 考 文 献 : [ ], -,. -.. ( - ) [ ].,, : [ ],,,., - ( )[ ].,, ( ): [ ],,,. - ( ) [ ].,, ( ): [ 陈 翠 珍, 房 海, 张 晓 君, 等. 牙 鲆 鱼 肠 道 弧 菌 感 染 症 及 病 原 特 性 研 究. 热 带 海 洋 学 报,, ( ): ] [ ],. - []. :., [ 东 秀 珠, 蔡 妙 英. 常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册. 北 京 : 科 学 出 版 社., ] [ ],. [ ]. :., [ 杨 正 时, 房 海. 人 及 动 物 病 原 细 菌 学. 石 家 庄 : 河 北 科 学 技 术 出 版 社., ] [ ],. [ ].,, ( ): [ ],,,. '. [ ]. : -.,,, [ ],. ' [ ]..:, -., [ ],. : [ ]. ( ). -,,.,, [ ],. - [ ].:., [ 沈 关 心, 周 汝 麟. 现 代 免 疫 学 试 验 技 术. 武 汉 : 湖 北 科 学 技 术 出 版 社., ] [ ],. - ( )[ ].:., [ 叶 应 妩, 王 毓 三. 全 国 临 床 检 验 操 作 规 程 ( 第 二 版 ). 南 京 : 东 南 大 学 出 版 社., ] [ ],,,. - - [ ].,, ( ): [ 陈 师 勇, 莫 照 兰, 张 振 冬, 等. 鳗 弧 菌 胞 外 产 物 中 致 病 因 子 的 分 离 纯 化 及 性 质 研 究. 高 技 术 通 讯,, ( ): ] [ ],. [ ].,, ( ): [ 吴 后 波, 潘 金 培. 病 原 弧 菌 的 致 病 机 理. 水 生 生 物 学 报,, ( ): ] [ ],. () - [ ].,, ( ): [ ],,,. - [ ].,, ( ): [ 石 存 斌, 胡 学 峰, 陈 献 稿, 等. 两 株 致 病 性 哈 维 氏 弧 菌 胞 外 产 物 的 特 性 分 析. 水 生 生 物 学 报,, ( ): ]

8 期 张 晓 君 等 : 红 鳍 东 方 鲀 病 原 鱼 肠 道 弧 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 (.) -, -, -,, - (.,,, ;.,,, ) : (.)., -,,.,, -.,.,.,,.( - )-.,,, --., (). ( -, -, - - ), -, -(),, -, (.. )μ (.. )μ. - - (. ), - ( % %)..-. (, ),, ( ).-,,,,,,.- -., ( - )..... : ;;